私達は私達の株を送信するための教授平岡に感謝。我々は、ゴランGustafssons財団とスウェーデンの癌協会（939分の2008）からの支援を認める。

1。分裂酵母の培養<ol><li>エディンバラ最少培地（EMM）を準備し、塩化アンモニウムのないEMM（EMM - N）8。自家蛍光グルコース溶液を減らすためにオートクレーブしてはいけませんが、代わりにフィルタし、その後オートクレーブメディアに追加さ0.2μmのを使用して滅菌フィルター。 </li><li>新鮮な濾過滅菌グルコースとEMM液体培地3mlに、8 YEA、リッチメディアと寒天プレート上に成長した分裂酵母の細胞を接種する。軽く細胞の十分な換気を確保するためにキャップをプッシュで13mLチューブを使用してください。細胞は30で225回転でそれらを揺することによって成長しましょう​​℃に適切な希釈、毎朝と夕方に続いてBurkerチャンバーを使用して、それらをカウントすることにより、 - （2 × 10 7細胞/ mLの1 × 10 6）2日間細胞は対数増殖期に成長しておいてください。 </li><li>実験の日に早期対数増殖期、5で細胞を持っていることを確認してくださいX 10 6 - 1 × 10 7細胞/ mLの。 </li><li> tを飢えへEMMメディアからEMM - Nのメディアへの切り替え20分間の間に窒素のための彼の細胞。これは、分裂酵母9のストレス応答を誘発する可能性が速い速度での遠心分離のように最大1.5 rcfで、ベンチトップ遠心分離機で1.5mlのエッペンドルフチューブに細胞を3mlのを収穫することによって行われます。ダブル紡績技術、意味が使用する、2分間の最初のスピンを、次にエッペンドルフチューブ180 °回転し、1.5 RCF 2分10秒間再びスピン。これはチューブの底に一つペレット内のすべての細胞を回収するのに役立ちます。 EMM - Nで1回洗浄し、EMM - Nでペレットを溶解し、30℃で15分間細胞をインキュベート℃で225 rpmで振盪し、次に2を指すように続ける。サンプルの準備。 </li></ol> 2。サンプルの準備<ol><li>速い速度で遠心分離などの収穫最大1.5 rcfで、ベンチトップ遠心分離機で1.5mlのエッペンドルフチューブに細胞を1.5 mLのは、分裂酵母9のストレス応答を誘発するかもしれない。ダブル紡績技術、meaniを使用NG、2分間の最初のスピンは、その後、エッペンドルフチューブ180 °回転し、2分10 1.5 RCFのために再びスピン。これはチューブの底に一つペレット内のすべての細胞を回収するのに役立ちます。 </li><li>上清を取り除くが、10から15μLを残し、残りのメディアに細胞を懸濁します。また、細胞ペレットを再懸濁させる新鮮な培地の10μLを加える。 </li><li>透明なガラススライドとカバーガラス（無1.5）を持っていることを確認してください。通常は、それらをクリーンアップする必要がありますが、それらが塵のフルではないことを確認していない。 </li><li>冷凍庫からフィルター滅菌されています1mg/mLレクチンのストック溶液のアリコートを取り出してください。レクチン溶液は数回再凍結することができます。レクチンは、カバーガラスで酵母細胞を固定するために使用されます。 </li><li>客観的なガラス上で濾過滅菌グルコースとEMMの代わりに5μL。 </li><li>カバーガラスの隅にあるレクチン溶液5μLを置きます。その後、レクチンドロップで同じコーナー、すなわち、細胞培養の5μLを配置。その後数回ピペッティングしてミックスがピペットの先端の長い側を使用して、カバーガラスを通して細胞培養レクチンミックスを広げる。あなたの細胞混合物の密度に応じてすべてのものを残したり、カバーガラスの反対側の隅にある余分な液体を吸い上げる。 </li><li>客観的なガラスとベンチで反対側の片側で、上のトップ、カバーガラスを置きます。カバーガラスは、数分間少し乾かします。それは絶対に完全に乾燥させてはならないが、それはあまりにも多くの液体ガラス上であってはならない。 </li><li> EMMのドロップによる客観的なガラスからおおよそ70 °の天使とカバーガラスを置きます。それはEMMのドロップにトップダウン落下するように、カバーガラスを放す。 </li><li>シリコングリースとの縁をシールすると、2 mLの注射器を準備する。 200μlの先端の広い方の端をカットして注射器に添付します。シリコングリスの約1 mLの注射器を埋める。シリコンの微細な線を穏やかに膿がカバーガラスの端に適用されます興注射器のピストン。今、あなたはS.の小さな成長チャンバーを持っている分裂酵母細胞。 </li></ol> 3。顕微鏡検査<ol><li>水銀/キセノンランプ、顕微鏡とコンピュータをオンにして蛍光顕微鏡を初期化する。蛍光顕微鏡で酵母の成長室を置きます。 63 ×対物レンズまたはNA = 1.3以上で100 Xの目標を使用してください。油浸対物が使用されている場合は、オイルを追加。 </li><li>セルを検索し、シャープな画像を得るために明るいフィールドを使用してください。 </li><li>蛍光顕微鏡の設定は、酵母細胞と顕微鏡を標識するために使用される蛍光色素によって異なります。我々は、16ラインの平均平面スキャン設定とプラン - アポクロマート63x油浸対物レンズ（NA = 1.4）との共焦点顕微鏡ツァイスLSM 700レーザー走査型顕微鏡を使用してください。ピンホールは、0.8 mmの光学的スライスを与える1から1.1エアリーユニット、に設定する必要があります。我々は、このようにD 582 nmのビームスプリッタでアレクサ488用のフィルタセットを使用して、トラック1にGFPを検出488と582 nmの間の波長をetecting。トラック2に我々は、578と600nmの波長を検出するので、578 nmのビームスプリッタを使用してmCherryに最適なフィルターセットを使用してください。これは、トラック2にMRFP（SPB）とNM（mCherry）の両方が検出されることを意味します。 </li><li>多くの写真がそれぞれの株について60種類の細胞で測定できるように、必要に応じてかかります。通常、独立した顕微鏡の分野の15枚は十分です。それは、顕微鏡の時間が60分を超過した場合、新鮮な細胞を用いた新たな成長チャンバーが行われることをお勧めします。 </li></ol> 4。細胞内の距離の定量的測定<ol><li>ツァイス禅ライト版のプログラムで画像を開きます。測定ツールの測定のすべての信号が同じ焦点面内にあるすべてのセルに異なる蛍光色素間程度の距離を使用する。蛍光シグナルの中心を識別するために、光強度とコントラストを調整します。この簡略化されたプロトコルは、2つだけ異なるcを使用していますolours、したがって、SPBとNMは、同じチャネルになります。 SPBは、NMで、その大きな丸い構造によって選び出されます。メモ帳のシートまでの距離を転送する。少なくとも60細胞で測定します。このようなImageJのような他のプログラムにも距離を測定するために使用することができるが、ツァイス禅のライトは、その高い画像の解像度と、そのプログラムを使用してズームインおよびズームアウトする使いやすさのために好ましい。 ImageJの年にオープンLSM形式の画像はお互いの上に二つのチャンネルを持つことになります。両方のチャンネルを持つ画像を作成するには、最初の2つのチャンネルを分割し、その後、それらをマージする。その後ラインツ​​ールは、前述のように距離を測定するために使用することができます。 </li><li> SigmaStat - 3.5ソフトウェアを使用して、例えばt検定またはMann - Whitneyの順位和検定、例えば、統計的なプログラムを使用して、異なる菌株と両群間の平均または中央値細胞内の距離を比較する。短い持つセルの選択があるだろうので、頻繁にデータが正常に配布されていませんすべての信号からの蛍光信号間の距離を測定すると同じ焦点面にある必要があります。マン-ホイットニー順位和検定は、正規分布を欠いているデータセットの比較を可能にしながら、データが正規分布しているときに、t検定にのみ使用できます。マン-ホイットニー順位和検定で中央値が比較されている間t検定では二つの異なるデータセットの平均値が比較されます。 </li></ol> 5。代表的な結果ひずみPJ1185：（H + his7 +：：dis1placR - GFP塩基番号[：：ura4 + hphMX6 lacO] sid4 - MRFP：：kanMX6 cut11 - mCherry：：natMX6 ura4 - D18 leu1 - 32 ade6 - DN / N）が EMMに成長させた。サンプルを取り出し、小さな成長チャンバーと絵に取り付け（図1A + N）採取した。その後、増殖培地は、EMM W / O塩化アンモニウム（EMM - N）に置き換え、そして細胞はgであったれました振盪しながら15分間rown。飢餓状態の細胞をEMM - Nと映像との成長チャンバーにマウントされた窒素は、（図1A - N）を採取した。測定ツールは、遺伝子座（GFP）とSPB（図1Bおよび表1）の間の距離を測定するために使用されていました。さらに、遺伝子座（GFP）とNM間の距離は、（図1Bおよび表2）を測定した。窒素の枯渇の前と後の中央値は細胞内の距離は、SigmaStat - 3.5ソフトウェア（表3）を用いて比較した。 SBPに向かってNMから離れて移動する遺伝子クラスターの局在において統計的に有意な変化があった。 GFPとSBPの間の距離を測定するデータはt -検定（表1と3）を使って比較できるので、正規分布と平均距離（1.777μmの+ Nと1587μmの- N）を有していた。 2つの平均値（P = 0.008、t検定）との間に有意差があった。 GFPとNM間の距離を測定するデータは、通常のディを持っていなかったstribution従って中央値の距離は（0μmの+ Nおよび0.390μmの- N）のMann - Whitney順位和検定（表2および3）を用いて比較した。 two中央値（P &lt;0.001、Mann - Whitneyの順位和検定）との間に有意差があった。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> 図1 GFPでマークされた塩基番号という名前の遺伝子のクラスターの局在は、窒素飢餓後に変更。 （A）左列、+ N、EMM右側の列で育った細胞、- N、EMM - Nに生育細胞から代表的な細胞核からの代表的な細胞核。グリーンが塩基番号クラスタのラベル付けGFPのシグナルである、赤はそれぞれ、SPBとNMをラベリングMRFPとmCherryです。 （B）同一細胞の核として（A）が、現在測定された核内の距離で、黄色：細胞核の直径は、青色：SPBとGFPシグナルとピンクの間の距離：GFPのシグナルと核膜の間の距離。 <pクラス=&quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> 表1。EMMで育ったPJ1185ひずみの程度で測定された核内の距離。最初の行、セルの直径（D）、2行目、GFPとSPB、3行目の間の距離、GFPとNM間の距離。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> 表2。EMM - Nで栽培さPJ1185ひずみの程度で測定された核内の距離。最初の行、セルの直径（D）、2行目、GFPとSPB、3行目の間の距離、GFPとNM間の距離。 <imgALT =&quot;表3&quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg&quot;/&gt; 表3。歪みPJ1185で観測された核内の距離の記述統計量の窒素飢餓の前に（+ N）と（- N）の後。最初の行：測定されたセルの数、2行目：平均直径（D）、3行目：中位径（D）、など行：GFPとSPB、番目の行の間の距離を意味する：GFPとNMとの間の中央値の距離。

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Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li><li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li><li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li><li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li><li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes.">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li><li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cut11(+):+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li><li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network.">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. 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我々は、開示することは何もない。

過去10年間中に携帯電話のイベントを監視するための生細胞イメージングの使用は、ますます人気となっている。それはクラゲオワンクラゲから緑色蛍光タンパク質の使用を開始し、現在多くの異なる蛍光色素は、シアン（475 nm）から遠赤（648 nm）を11に幅広いスペクトルを介して発光蛍光ご利用いただけます。免疫上の生細胞イメージングの大きな利点の一つは、細胞がそれ故に固定のプロセスから可能なアーチファクトを避けること、顕微鏡の前にホルムアルデヒドやエタノール/アセトン処理により固定されていないということです。さらに、生細胞イメージングでは、個々のセルを追跡し、携帯電話のイベント12の動画を取得することが可能となり、インキュベーションの数時間または数日中に頻繁な間隔で写真を撮るために可能性を提供しています。哺乳動物細胞は、約3〜4＆の直径を小さく酵母細胞に比べ、約100μmの直径で、大きいサイズを有するという利点を持っているムー、M.一方、酵母の利点は、操作が簡単なゲノムである。相同組換えが酵母で非常に効率的に発生し、異なる蛍光色素3に目的のタンパク質を融合するために使用されます。また、lacOシーケンスとLacR - GFPタンパク質のその後の発現の標的との統合を使用すると、細胞核2内のゲノムの特定の部分の検出を可能にする。 S.の使い方彼らは低コストの細胞の培養条件での高速生成時間とともに成長する自然な単細胞生物なので、顕微鏡での分裂酵母細胞は、追加の利点があります。また、S.分裂酵母は、後生動物の相同遺伝子を持っているので、優れた真核生物のモデル生物です。 この手法の主要な限界の一つは、真の信号の検出を妨害する酵母細胞における自家蛍光である。この問題は、代わりにオートクレーブのフィルター滅菌グルコースと最小限の増殖培地を使用することで解決できます。のさらに、酵母細胞は、それらをマウントする前に、ログフェーズで2日間増殖されるべきである。ここで紹介するプロトコルは、酵母細胞内のタンパク質の細胞内局在を決定するために比較的単純な、まだ定量的な方法を提供しています。また、異なる時点で写真を撮ることによって我々は携帯電話のイベントを続けることができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/装置の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>レクチン</td><td>シグマ</td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td>シリコングリース</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査顕微鏡 LSM 700 </td><td>ツァイス</td><td> LSM 700 </td><td>他の共焦点顕微鏡を使用することができる。 </td></tr><tr><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3.5 </td><td>統計分析のための任意のソフトウェアを使用することができる。 </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

いくつかの顕微鏡技術は、細胞内の特定のタンパク質を検出することができる、今日利用可能です。過去10年間の間に直接、目的のタンパク質に接続された緑色蛍光タンパク質（GFP）のような蛍光色素を用いた生細胞のイメージングは、1人気が高まっています。 GFPと同様の蛍光色素を用いてタンパク質の細胞内ローカライゼーションと動きを蛍光顕微鏡で検出することができます。また、また、染色体の特定の領域の核内局在性は、この手法を用いて研究することができます。 GFPは、Lacリプレッサータンパク質（LacR）に融合させ、異所的lacO配列のタンデムリピートが染色体2上の関心領域に挿入されている細胞内で発現されています。 LacR - GFPは、lacOの繰り返しにバインドされ、ゲノムのその領域は、蛍光顕微鏡で緑色のドットとして表示されます。酵母は、特に相同ので、このタイプの操作に適しています組換えは、非常に効率的であり、それによってlacOを繰り返すとGFP 3人工融合タンパク質の標的を統合することができます。ここでは、分裂酵母の生細胞解析のための定量的な方法を説明します。分裂酵母の生細胞解析のための追加のプロトコルは、減数分裂の染色体の行動の4のムービーを作成する方法の例については、見つけることができます。この特定の実験では核内の組織とそれがどのように遺伝子の誘導中に影響を受けているに焦点を当てる。我々は、遺伝子の近傍にlacO結合部位を導入することにより、塩基番号という名前の遺伝子クラスターを、、ラベルを貼っている。遺伝子クラスターは、分裂酵母5の窒素飢餓時に早期に誘導される遺伝子を濃縮される。株では核膜（NM）が赤色蛍光シグナルを生じさせるNMタンパク質Cut11にmCherryを接続してラベルが付けられます。紡錘体極体（SPB）化合物Sid4は、赤色蛍光タンパク質（Sid4 - MRFP）6に融合させる</s上&gt;。栄養成長している酵母細胞では動原体は常にNM 7に埋め込 ​​まれているSPBに添付されています。 SPBは、NMの大きな丸い構造として識別されます。前の画像と20分窒素源の枯渇後に我々は、遺伝子クラスター（GFP）とNM / SPBの間の距離を決定することができます。窒素の枯渇の前と後の平均値や中央値の距離が比較され、我々は、このように窒素の枯渇後の遺伝子クラスターの細胞内局在の変化があるか否かを定量化することができます。

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Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

分裂酵母、<em&gt;シゾサッカロマイセスポンベ</em&gt;、基本的な細胞プロセスを研究する良いモデルシステムです。ここでは、分裂酵母の定量的な生細胞の解析を実行する方法を説明します。この特定の実験では細胞核内でゲノムの組織に焦点を当てるが、この方法はまた、細胞質因子を研究するために使用することができます。

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K ビュー.  University of Uppsala. 分裂酵母、シゾサッカロマイセスポンベ、基本的な細胞プロセスを研究する良いモデルシステムです。ここでは、分裂酵母の定量的な生細胞の解析を実行する方法を説明します。この特定の実験では細胞核内でゲノムの組織に焦点を当てるが、この方法はまた、細胞質因子を研究するために使用することができます。

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

遺伝学

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

生物学

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

免疫・感染学

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

分裂酵母における細胞質分裂のイベントの時空間解析

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

酵母の4D顕微鏡検査

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...