우리는 우리에게 종자를 보내주셔서 교수 히라 오카 주셔서 감사합니다. 우리는 고란 Gustafssons 재단과 스웨덴의 암 협회 (939분의 2,008)에서 지원을 인정합니다.

1. 분열 효모 문화 <ol><li> 에딘버러 최소 미디어 (EMM)와 ammoniumchloride 않고 EMM (EMM - N) 8을 준비합니다. autofluorescence 줄이기 위해 포도당 솔루션은 autoclaved하지만 필터와 이후 autoclaved 미디어에 추가 0.2 μm의를 사용하여 소독하는 대신 필터를해서는 안됩니다. </li><li> 접종 분열 효모 세포는 신선한 필터 소독 포도당과 EMM 액체 매체 3 ML에, 8 네, 리치 미디어와 한천 플레이트에서 성장. 가 가볍게 세포의 좋은 통풍을 위해 모자를 강요와 13mL 튜브를 사용하십시오. 세포가 30 225 RPM으로 그들을 흔들어하여 성장하자 ° C. 세포 (1 X 10월 6일부터 2일까지 X 10 7 세포 / ML) 로그 단계에서 성장을 유지 Burker 챔버를 사용하여 계산하여 2 일간 적절한 희석, 매일 아침과 저녁으로 따라갔다. </li><li> 실험 당일 초기 기록 단계, 5 세포를 가지고 있는지 확인하십시오 X 10월 6일부터 1일까지 X 10 7 세포 / ML. </li><li> T를 굶어EMM - N 미디어로 EMM 미디어에서 20 분 동안 질소 스위치에 대한 그 세포. 이것은 빠른 속도로 원심 분리로 최대 1.5 rcf에서 벤치 최고 원심 분리기에서 1.5 ML Eppendorf 튜브에 세포 3 ML을 수확하여 수행은 분열 효모 9 스트레스 반응을 유발 할 수도 있습니다. 이중 회전 기술, 의미를 사용, 2 분 첫번째 스핀을 다음 Eppendorf 튜브 180 ° 회전하고 1.5 rcf 2 분 10 다시 돌린다. 이것은 튜브의 아래쪽에 하나의 펠렛에있는 모든 세포를 수집하는 데 도움이됩니다. EMM - N으로 한번 씻어하고 EMM - N의 펠렛을 해산 30 15 분 동안 전지를 품어 ° C 225 rpm으로 흔들어 후 2 지점으로 진행합니다. 샘플 준비. </li></ol> 2. 샘플 준비 <ol><li> 빠른 속도로 원심 분리로 최대 1.5 rcf에서 벤치 최고 원심 분리기에서 1.5 ML Eppendorf 튜브에 세포의 수확 1.5 ML은 분열 효모 9 스트레스 반응을 유발 할 수도 있습니다. 이중 회전 기술, meani를 사용하여NG, 2 분 첫번째 스핀은 다음 Eppendorf 튜브 180 ° 회전 2 분 10 1.5 rcf 다시 돌린다. 이것은 튜브의 아래쪽에 하나의 펠렛에있는 모든 세포를 수집하는 데 도움이됩니다. </li><li> 뜨는을 제거하지만, 휴가 10-15 μL하고 나머지 미디어 세포를 resuspend. 또는 세포 펠렛을 resuspend 신선한 미디어 10 μL를 추가합니다. </li><li> 투명 유리 슬라이드를하고 (없음 1.5) 유리를 커버해야합니다. 일반적으로 당신이 그들을 청소해야하지만, 그들은 먼지가 가득되지 확인하지 않습니다. </li><li> 냉장고에서 나온 필터 소독되었습니다 1mg/mL 렉틴의 재고 솔루션 나누어지는를 가져가라. 렉틴과 솔루션은 몇 번 refrozen 수 있습니다. 렉틴과은 커버 유리에있는 효모 세포를 수정하는 데 사용됩니다. </li><li> 객관적인 유리에 필터 소독 포도당과 EMM의 장소 5 μL. </li><li> 커버 유리의 모서리에 렉틴 솔루션 5 μL를 놓습니다. 이후 렉틴과 드롭 즉, 같은 모서리에있는 세포 배양의 5 μL를 배치. 다음 몇 번 pipetting하여 혼합하여 피펫 팁의 긴 쪽을 사용하여 덮개 유리를 통해 문화 렉틴 혼합 세포를 확산. 모든것을 떠나거나 커버 유리의 반대 모서리에 초과하는 액체를 빨아 휴대 혼합물의 밀도에 따라 다릅니다. </li><li> 벤치에 목적 유리와 반대쪽에 한쪽으로 커버 유리, 꼭대기를 놓으십시오. 커버 유리가 몇 분 동안 약간 건조 보자. 그것은 절대적으로 완전히 건조하지 않아야하지만, 그것은 유리에 너무 많은 액체해서는 안됩니다. </li><li> EMM의 드롭에 의한 객관적인 유리에서 약 70 ° 천사와 덮개 유리를 놓습니다. 그것이 EMM의 드롭 다운로 가기 떨어질 수 있도록 커버 유리 가자. </li><li> 실리콘 그리스와 가장자리를 밀봉하기 위해서는 2 ML의 주사기를 준비합니다. 200 μl 팁의 넓은 끝을 잘라 주사기에 첨부해 주시기 바랍니다. 실리콘 기름의 약 1 ML로 주사기를 채우십시오. 실리콘의 벌금 라인이 부드럽게 고름으로 커버 유리의 가장자리에 적용됩니다주사기의 피스톤 hing. 이제 S.의 작은 성장 챔버를 pombe 세포. </li></ol> 3. 현미경 사용법 <ol><li> 수은 / 크세논 램프, 현미경 및 컴퓨터 켜기하여 형광 현미경을 초기화. 형광 현미경에있는 효모 성장 챔버를 놓습니다. 63 X 목표 또는 = 1.3 이상 NA와 100 X 목표를 사용하십시오. 석유 목표가를 사용하는 경우, 오일을 추가합니다. </li><li> 세포를 찾아 날카로운 사진을 얻을 수있는 밝은 필드를 사용합니다. </li><li> 형광 현미경에 대한 설정은 효모 세포와 현미경 레이블을하는 데 사용되는 fluorochromes에 따라 다릅니다. 우리는 16 라인 평균 평면 스캔 설정 계획 - 고차 색지움 63x 오일 객관적인 렌즈 (NA는 = 1.4)와 공촛점 현미경 자이스 혈구 LSM 700 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다. 핀홀은 0.8 mm의 광학 슬라이스를 제공 1-1.1 공기 단위로 설정해야합니다. 우리는 따라서 D 582 NM에서 빔 스플리터와 알렉사 488에 대한 필터 설정을 사용하여 트랙 1에 GFP를 감지488과 582 nm의 파장 사이를 etecting. 트랙 2 우리는 따라서 578, 600 nm의 파장 사이를 감지, 578 nm의에서 빔 스플리터를 사용하여 mCherry 최적 필터 설정을 사용합니다. 이것은 트랙 2 mRFP (SPB)과 NM (mCherry) 모두가 감지된다는 것을 의미합니다. </li><li> 많은 사진이 각 변형에 대해 60 종류의 세포의 측정을 할 수있는 능력이 필요로 가져가라. 보통 독립 현미경 분야의 15 사진은 충분히 있습니다. 이것은 귀하의 현미경 시간 60 분 초과하면 새로운 세포로 새 성장 챔버가 만든 것을 권장합니다. </li></ol> 4. subcellular 거리의 양적 측정 <ol><li> 자이스 혈구 선종 라이트 버전 프로그램에서 사진을 엽니다. 측정 도구 측정 모든 신호가 같은 초점 평면에있는 모든 세포에서 다른 fluorochromes 사이 μm의에서 거리를 사용합니다. 형광 신호의 중심을 식별하는 빛의 강도와 대비를 조정합니다. 이 단순화된 프로토콜은 두 가지 C를 사용하여olours하고 따라서 SPB와 NM 같은 채널에 있습니다. SPB는 NM에서의 대형 원형 구조에 의해 선발되어집니다. 메모장 시트 거리를 전송합니다. 최소 60 세포에서 측정합니다. 같은 ImageJ 같은 다른 프로그램도 거리를 측정하는 데 사용될 수 있지만 자이스 혈구 선종 라이트 인해 그 높은 사진의 해상도와 해당 프로그램을 사용 및 축소하기 위해 쉽게하기 좋습니다. ImageJ에서 열린 lsm 형식으로 사진은 서로의 상단에있는 두 개의 채널을 것입니다. 두 채널로 사진을 만들려면 먼저 두 채널을 분리 이후 그들을 병합합니다. 이후 라인 도구는 위에서 설명한대로 거리를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> SigmaStat - 3.5 소프트웨어를 사용하여 예를 들어, 예를 들어 T - 테스트 또는 맨 - 휘트니 순위 ​​합 시험, 통계 프로그램을 사용하여 다른 변종과 치료 사이의 의미 또는 평균 subcellular 거리를 비교합니다. 짧은과 세포에 대한 선택이있을 것이다 때문에 자주 데이터가 정상적으로 배포되지 않습니다모든 신호부터 형광 신호 사이의 거리가 측정되는 동일한 초점 평면에 있어야합니다. 맨 - 휘트니 순위 ​​합 시험은 정규 분포를 부족 데이터 집합의 비교를 허용하면서 데이터가 정규 분포를했을 때 T - 테스트에서만 사용할 수 있습니다. 맨 - 휘트니 순위 ​​합 시험의 평균을 비교하는 동안 T - 테스트에서는 두 개의 서로 다른 데이터 세트의 의미가 비교됩니다. </li></ol> 5. 대표 결과 스트레인 PJ1185 : (H + his7 + : : dis1placR - GFP Chr1 [: : ura4 + hphMX6 lacO] sid4 - mRFP : kanMX6 cut11 - mCherry : natMX6 ura4 - D18 leu1 - 32 ade6 - DN / N)은 EMM에서 재배되었다 . 샘플은 취소 및 소형 성장 챔버에 탑재 및 사진 (그림 1A + N) 찍은되었습니다. 이후 성장 미디어는 EMM W / O ammoniumchlo​​ride (EMM - N)로 교체하고, 전지는 g 있었어요떨고하면서 15 분 동안 rown. 질소 굶주린 세포는 다음 EMM - N 및 사진과 함께 성장 챔버에 탑재되었습니다 것은 (그림 1A - N) 촬영되었습니다. 측정 도구는 현장 (GFP)와 SPB (그림 1B와의 표 1) 사이의 거리를 측정하는 데 사용되었다. 또한, 현장 (GFP)과 NM 사이의 거리는 (그림 1B와 표 2) 측정했습니다. 질소 고갈 이전과 이후 평균 subcellular 거리는 SigmaStat - 3.5 소프트웨어 (표 3)를 사용하여 비교했다. 멀리 SBP 향해 NM에서 이동 유전자 클러스터의 로컬 리 제이션에 통계적으로 의미 변화가 발생했습니다. GFP와 SBP 사이의 거리를 측정 데이터는 t - 테스트 (표 1 및 3)를 사용하여 비교있을 따라서 정규 분포와 평균 거리를 (1.777 μm의 + N 및 1,587 μm의 - N)했다. 두 의미 값 (P = 0.008, T - 테스트) 사이에 상당한 차이가 발생했습니다. GFP와 NM 사이의 거리를 측정 데이터는 정상적인 디가 없었어요stribution하고 따라서 평균 거리 (0 μm의 + N 및 0.390 μm의 - N)은 맨 - 휘트니 순위 합계 검사 (표 2 및 3)을 사용하여 비교했다. 두 평균 값 (P &lt;0.001, 맨 - 휘트니 순위 ​​합계 테스트) 사이에 상당한 차이가 발생했습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> 그림 1. GFP로 표시되어 Chr1라는 유전자의 클러스터의 로컬 리 제이션은, 질소 기아 후에 변경되었습니다. (A) 왼쪽 열에서, + N, EMM 오른쪽 열에 자란 세포, - N, EMM - N에서 자란 세포에서 대표 세포 핵에서 대표 세포 핵. 그린은 Chr1 클러스터를 라벨 GFP 신호이며, 빨간색은 mRFP과 mCherry가 각각 SPB 및 NM을 라벨입니다. (B) 같은 세포 핵으로 (A)하지만 지금은 측정 subnuclear 거리로, 노란색 : 세포 핵의 직경, 파란색 : SPB 및 GFP 신호와 핑크 사이의 거리 : GFP 신호와 핵 막 사이의 거리. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> 표 1. EMM의 성장 PJ1185 변형의 μm의 측정에 subnuclear 거리. 첫 번째 행, 셀 (D), 둘째 행, GFP와 SPB 사이의 거리, 셋째 행, GFP와 NM 사이의 거리의 직경. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> 표 2. EMM - N에서 자란 PJ1185 변형의 μm의 측정에 subnuclear 거리. 첫 번째 행, 셀 (D), 둘째 행, GFP와 SPB 사이의 거리, 셋째 행, GFP와 NM 사이의 거리의 직경. <img고도 = &quot;표 3&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg&quot;/&gt; 표 3. 변형율 PJ1185에서 관찰된 subnuclear 거리의 설명 통계 질소 기아 앞에 (+ N)와 (- N) 후. 첫 번째 행 : 세포의 숫자는 두 번째 행에 측정 : 지름 (D), 셋째 행의 의미 : 평균 직경 (D)를 규정 행 : GFP와 NM 사이의 평균 거리 : GFP와 SPB, 다섯 번째 행 사이의 거리를 의미합니다.

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우리는 공개 아무것도 없어.

지난 10 년 동안 세포 이벤트를 모니터링하는 라이브 세포 이미징의 사용은 점점 더 인기를 끌고있다. 그것은 해파리 Aequorea 빅토리아에서 녹색 형광 단백질의 사용을 시작하여 지금은 다양한 fluorochromes 훨씬 빨간색 (648 NM) 11 청록색 (475 NM)에서 다양한 스펙트럼을 통해 발광 형광 사용할 수 있습니다. immunofluorescence 이상의 라이브 세포 이미징의 주요 장점 중 하나는 세포 따라서 고정 과정에서 가능한 공예품을 피하기 위해, 현미경 전에 포름 알데히드 또는 에탄올 / 아세톤 치료로 해결되지 않은 것입니다. 또한, 라이브 세포 이미징 개별 세포를 따라 세포 사건 12 영화를하는 것이 가능하게, 부화의 시간 또는 일 동안 잦은 간격으로 사진을 찍을 수있는 가능성을 제공합니다. 포유류의 세포는 약 3-4 &amp;의 직경이 작은 효모 세포에 비해, 약 100 μm의 직경을 가진 더 큰 크기를 갖는 장점을 가지고뮤, M. 반면에, 효모와 장점은 쉽게 넘어가지 게놈이다. 상동 재조합은 효모에 아주 효과적으로 발생하고 다른 fluorochromes 3 관심 단백질을 융합하는 데 사용됩니다. 또한, lacO 시퀀스 및 LacR - GFP 단백질의 후속 표현 대상으로 통합을 사용하면 세포 핵이 내의 염색체의 특정 부분의 검색이 가능합니다. S.를 사용하여 그들은 저렴한 비용으로 세포 배양 조건에서 빠른 세대 시간 성장할 자연 단세포 유기체이기 때문에 현미경의 pombe 세포는 추가 이점이 있습니다. 또한, S. 그것이 metazoan 상동 유전자를 가지고 이후 pombe는 훌륭한 진핵세포 모델 생물이다. 이 기술의 주요 한계 중 하나는 진정한 신호의 감지를 방해 효모 세포에 autofluorescence 있습니다. 이 문제는 필터 소독 포도당과 최소 성장 미디어를 사용하는 대신 autoclaved에 의해 극복할 수 있습니다. 에또한 효모 세포는 그들을 장착하기 전에 로그 단계에서 2 일간 성장해야합니다. 여기에 제시 프로토콜은 효모 세포 내에서 단백질의 subcellular 지방화를 결정하는 비교적 간단하지만, 아직 양적 방법을 제공합니다. 또 다른 시간 지점에서 사진을 찍고으로 우리는 세포 이벤트를 추적할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 렉틴 </td><td> 시그마 </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 그리스 </td><td> 다우 코닝 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 레이저 스캐닝 현미경 LSM 700 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> LSM 700 </td><td> 기타 공촛점 현미경을 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3.5 </td><td> 통계 분석을위한 소프트웨어는 사용할 수 있습니다. </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

몇 가지 현미경 기술은 세포 내에서 특정 단백질을 감지할 수 오늘날 사용할 수 있습니다. 지난 10 년 동안 직접 관심의 단백질에 부착된 녹색 형광 단백질 (GFP) 같은 fluorochromes를 사용하여 라이브 세포 이미징은 1 점차 인기를 끌고있다. GFP 및 이와 유사한 fluorochromes 사용 단백질의 subcellular localisations과 움직임은 형광 현미경에서 검출 수 있습니다. 더욱이, 또한 염색체의 특정 지역의 subnuclear 지방화이 기술을 사용하여 공부하실 수 있습니다. GFP는 LAC 억제 단백질 (LacR)에 융합하고 ectopically lacO 시퀀스 협동 반복이 염색체 2의 관심 영역에 삽입되었습니다 셀에 표시됩니다. LacR - GFP는 lacO 반복과 염색체의 부분은 형광 현미경에 녹색 점이 표시로 볼 수에 바인딩합니다. 효모는 특히 동종 때문에 조작이 유형에 적합합니다재조합은 매우 효율적이고함으로써 lacO 반복 및 GFP 3 엔지니어링 융합 단백질의 대상으로 통합이 가능합니다. 여기 우리는 분열 효모의 라이브 세포 분석을위한 양적 방법을 설명합니다. 분열 효모의 라이브 세포 분석을위한 추가적인 프로토콜을 찾을 수 meiotic 염색체 행동 4 동영상을 만드는 방법에 대한 예를 들어. 이 특정 실험에서 우리는 subnuclear 조직에 어떻게 그것이 유전자 유도하는 동안 영향을받습니다 중점을두고 있습니다. 우리는 유전자의 주변에 lacO 바인딩 사이트의 소개에 의해 Chr1라는 유전자 클러스터를, 분류했습니다. 유전자 클러스터는 분열 효모 5 질소 결핍시 초기 유도 아르 유전자에 대한 풍부합니다. 변형에서 핵 막 (NM)이 빨간색 형광 신호 상승을주는 NM 단백질 Cut11에 mCherry의 첨부 파일에 의해 표시됩니다. 스핀들 장대 바디 (SPB) 화합물 Sid4은 빨간색 형광 단백질 (Sid4 - mRFP) 6 융합이다 </s최대&gt;. vegetatively 성장 효모 세포에서 centromeres은 항상 NM 7에 포함된 SPB에 붙어 있습니다. SPB는 NM에 큰 원형 구조로 식별됩니다. 전에 이미지 20 분으로 질소 소스의 고갈 이후 우리는 유전자 클러스터 (GFP)과 NM / SPB 사이의 거리를 확인할 수 있습니다. 질소 고갈 이전과 이후 평균 또는 평균 거리는 비교하고 있으며 따라서 질소 고갈 후 유전자 클러스터의 subcellular 지방화에 변화가 있는지 여부를 계량하실 수 있습니다.

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Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

분열 효모,<em&gt; Schizosaccharomyces pombe의</em&gt; 기본적인 세포 프로세스를 연구하는 좋은 모델 시스템입니다. 여기 우리는 분열 효모의 양적 라이브 세포 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 특정 실험에서 우리는 세포 핵 내의 염색체의 조직에 초점을하지만, 방법도 cytosolic 요인을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

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Biology

20.1K 조회수.  University of Uppsala. 분열 효모, Schizosaccharomyces pombe의 기본적인 세포 프로세스를 연구하는 좋은 모델 시스템입니다. 여기 우리는 분열 효모의 양적 라이브 세포 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 특정 실험에서 우리는 세포 핵 내의 염색체의 조직에 초점을하지만, 방법도 cytosolic 요인을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

연구

생물학

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

양적 휘트니스 분석 워크플로우

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...