Este trabalho foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 a KD e RW). Estamos gratos ao Euler Thomas (Töbingen, Alemanha) para o software QDS luz estimulação.

A descrição a seguir pressupõe que o pesquisador tem um conhecimento básico da estrutura da retina, patch-clamp de gravação e de microscopia de dois fótons. Para obter informações úteis sobre como estabelecer e executar uma instalação de patch-clamp e dois fótons sistema de imagem veja referências [7-12]. 1. Animal e de preparação dos tecidos <ol><li> Mantenha rato de adaptação ao escuro por pelo menos 3 h. Nesse meio tempo, prepare 1-2 l de solução extracelular consistindo de (em mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glicose e equilibrar-o para pH 7,4 por gás com carbogênio (5% de CO 2 em O 2) em temperatura ambiente. </li> um <li> Euthanize o mouse em uma câmara hermética de CO 2 overdose seguido por deslocamento cervical. Este procedimento e os seguintes passos devem ser realizados na escuridão. Use iluminação de longo comprimento de onda dim (que bloquear comprimentos de onda curtos a partir de uma fonte de luz fria por um 690 nm-longpass filtro) para apoiar a visão pessoal, mantendo os olhos do animal de adaptação ao escuro (ratos só têm má visão na parte vermelha do espectro de luz). Para o trabalho na iluminação completa escuridão usar infravermelho (&gt; 800 nm) e usar óculos de visão noturna. </li><li> Enuclear olhos com um par de tesouras curvas íris e transferi-los para um prato de solução extracelular colocadas sob um microscópio de dissecação. </li><li> Remover da córnea e do corpo ciliar, abrindo o bulbo do olho ao longo da ora serrata (a fronteira entre a retina eo corpo ciliar) com uma tesoura de mola (nós usamos primeiro uma lanceta para furar um ponto de partida para o corte). Retire a lente e separe cuidadosamente a retina do epitélio pigmentar. Se a orientação da retina é crucial para o seu estudo, indicam que, como na Ref. [12]. Cortar o nervo óptico entre retina e epitélio pigmentar da retina e remover a partir do ocular. Observe a direção das superfícies da retina: o interior da retina enrolado-up é o Ganglion lado célula; o exterior é o lado fotorreceptoras. </li><li> Remover o vítreo da superfície interna da retina, puxando-o fora com o auxílio de um palito de madeira. Para este fim, use um pequeno volume de solução extracelular que apenas cobre a retina. As varas do vítreo para o palito e podem ser arrastados centrifugamente fora da retina. Em seguida, aplique incisões curtas ao longo do perímetro da retina para facilitar o nivelamento do tecido. </li><li> Transferir a retina para dentro da câmara de gravação fotorreceptoras voltada para baixo, estendeu-o no fundo de vidro (usamos um pincel fino) e imobilizá-lo com um quadro de nylon amarrado de aço inoxidável. Prepare a retina segundo da mesma maneira e mantê-lo de adaptação ao escuro em solução extracelular carboxygenated para uso posterior. </li></ol> 2. Gravações <ol><li> Instalar a câmara de gravação na escuridão sob um microscópio a laser na vertical digitalização e superfuse a preparação da retina continuamente (não inferior a 5 ml / min) com solução extracelular carboxygenated aquecida a 35 ° C. O microscópio (também equipado com uma câmera CCD infravermelho-sensível) está situado em um choque de absorção de mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday para eletrônicos de proteção. Cobrir a gaiola com uma cortina não transparente para manter a preparação em trevas. Nós também fora da tela a luz de monitores de computador por película transparente vermelho. </li><li> Ajustar o laser infravermelho para 850-870 nm ou comprimentos de onda maiores, alterne para modo bloqueado condição e utilização de dois fótons de excitação para visualizar células que expressam GFP. Atenuar a saída do laser usando filtros de densidade neutra controlada pelo software de digitalização a laser até um grau que é apenas suficiente para o reconhecimento claro da célula fluorescentes </li><li> Para patch-clamp gravações em grampo atual modo de usar micropipetas de vidro (utilizamos tubos de vidro de borosilicato de 1,5 mm de diâmetro externo e espessura da parede 0,225 mm) preenchidas com solução intracelular consistindo de (em mM) 125 K gluconato, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, titulada para pH 7,4 com KOH (dando uma resistência pipeta de cerca de 5 mohms). Note-se que outras condições experimentais como tensão-clamp gravação requer uma solução diferente. Se injeções de corante são desejados, adicione uma sonda fluorescente (nós usamos 10 mM Alexa Fluor 594) ou uma molécula marcador (3% Neurobiotin). Insira o micropipeta no suporte e certifique-se que o eletrodo de referência (fio de prata clorada) está em contato com a solução extracelular na câmara de gravação. </li><li> Aplicar pressão ao micropipeta e alvo de uma expressando GFP-célula (usamos um de 40 vezes objetiva de imersão em água; NA 1,25). Corpos celulares amácrinas estão situados na camada de células ganglionares (diretamente abaixo da superfície na orientação atual da retina), bem como na parte proximal da camada nuclear interna (cerca de 55-75 mM profundamente dentro da preparação). Antes de micropipeta contato com a célula-alvo, a membrana limitante interna (a bainha feita de glial endfeet) na retinasuperfície tem de ser penetrada. Penetração bem sucedida é reconhecida pela solução intracelular que é expulso da ponta micropipeta e destaca a membrana limitante interna da retina ao tecido subjacente como pode ser observado em uma imagem de transmissão infravermelha capturada pela câmera IR-CCD. </li><li> Abordagem a célula desejada, comparando a posição soma a partir da imagem de dois fótons com a imagem da câmera CCD IR-mostrando a posição da micropipeta de gravação. Note que este passo não é fácil, e exige alguma prática, porque a célula expressando GFP-tem que ser reconhecida na imagem de transmissão infravermelha, a fim de direcionar a micropipeta em direção a ela. Direcionamento correto é alcançado quando a ponta da micropipeta causa ondulações na superfície da célula que pode ser visto na imagem de dois fótons. Alternativa a este procedimento, use um corante fluorescente (por exemplo Alexa Fluor 594, 100 mM) na solução intracelular para revelar a posição micropipeta na imagem de dois fótons. Dois fótons excitação infravermelho permite fluorescência suficiente deste corante para fazer a micropipeta discernível. Para este fim, ajustar o alcance de detecção do software de digitalização a laser para cobrir também a fluorescência vermelha. </li><li> Libertação de pressão da micropipeta e obter uma célula inteira configuração de patch-clamp clamp na corrente de modo. Uma gravação utilizável deve dar um potencial de membrana de -50 a -55 mV e durar pelo menos 20 min. </li><li> Apresentar estímulos visuais criados por um software de estimulação (usamos QDS por Thomas Euler, da Universidade de Tübingen, Alemanha) 11 em um monitor de computador. Ajuste a posição espacial do estímulo a ser centralizado na célula registrados: Mark a posição da célula no monitor que mostra a imagem de transmissão da câmera CCD e IR-centro de um estímulo como o local para ele. Sintonize a intensidade do estímulo através da inserção de filtros de densidade neutra para o caminho do feixe. Para a calibração do espectro monitorar e intensidade ver Ref. [14]. Escolha um prolonged interstimulus intervalo (por exemplo, 15 s) para evitar a adaptação. Incluem um fotodiodo no caminho do feixe de manter registro do tempo de estímulo. </li><li> Iniciar o protocolo de estimulação e gravar as respostas luz (nós usamos uma taxa de amostragem de 10 kHz com filtragem de 5 kHz para não-spiking células; para gravação spike uma maior taxa de amostragem de 20 kHz, como é recomendado). Use o software de estímulo de luz para ativar o software de gravação. </li><li> Para deixar o corante preenchendo difusa agente fluorescente na célula gravada por 30-45 min antes cuidadosamente retração da micropipeta da célula. Tome cuidado para não retirar o corpo da célula. Se o não-traçador fluorescente Neurobiotin foi usado, ele precisa de visualização por ligação a estreptavidina conjugada a um fluoróforo (usamos estreptavidina-Cy3, 1:400 durante a noite a 4 ° C após 20 min paraformaldeído fixação da retina; para a tintura de acoplamento estudos de incubação estreptavidina pode ser prolongado para 3 d). Alternativamente, as injeções também pode ser realizada comeletrodos pontiagudos (&gt; 100 mohms) quando o corante é conduzido para dentro da célula iontophoretically empalado (pulsos retangulares: 0,25-1 nA, 100 ms, intervalo de 100 ms, o tempo total 06/03 min). </li></ol> 3. Resultados representativos: Os seguintes resultados provêm de um estudo sobre um rato que expressam a proteína verde fluorescente (GFP), sob o promotor de tirosina hidroxilase 13,14, a enzima que catalisa a taxa de etapa limitante na síntese de catecolaminas (TH:: GFP mouse). Com base no brilho da GFP sinal de duas populações celulares distintas são distinguíveis (Figura 2A). Células que expressam o nível mais elevado GFP possuem corpos celulares localizados na camada nuclear interna (INL, Figura 2A) ou deslocadas na camada de células ganglionares (GCL, Figura 2B) e estratificar no meio da camada plexiforme interna (IPL, figura 2C) . Eles foram identificados como tipo 2 células 14-16 e poderia ser sistematicamente estudada em relação à morfologia (Figura 3) e elegeratividade rical (Figura 4), ​​embora sua densidade populacional só equivale a 250 células / mm 2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática da instalação experimental. Dois fótons de excitação (caminho da luz vermelha pontilhada) de células que expressam fluoróforo na retina intacta permite visuais segmentação por uma micropipeta (verde caminho emissão de luz). A retina é submetido a estímulos ópticos projetados através do condensador do microscópio (caminho da luz amarela), e as respostas celulares a luz são registradas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> Figura 2. GFP-células que expressam em uma flatmount retina de um TH:: mouse GFP. Duas populações pode ser distinguido pelo brilho da GFP sinal: tipo 1 (células DA) localizada no INL mostrando fluorescência fraca (A, ver pontas de seta) e tipo 2 células intensamente marcadocom corpos celulares tanto no INL (A, ver setas) ou deslocadas na GCL (B) e uma estratificação dendrítica no estrato S3 do IPL (C). Barras de escala, 50 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> Figura 3. Morfologia de uma célula do tipo 2 injetado com o Neurobiotin marcador. O traçador foi posteriormente visualizado por estreptavidina-Cy3 binding (magenta). A micrografia, que também está representando o sinal de GFP (verde), é uma projeção de pilhas de imagens cobrindo o GCL e IPL. Barra de escala, 50 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> Figura 4. Respostas luz de uma célula do tipo 2 localizado na GCL. Padrão de resposta ao branco iluminação de campo total de luz de intensidade crescente na faixa escotópica. Intensidade do estímulo é dado em photoisomerizations por haste por segundo (Rh * / rod / s). Um estímulo prolongado de 3 s foi usado para uma melhor distintosíon dos componentes de resposta no início do estímulo (ON resposta) e offset (OFF resposta).

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Camundongos foram tratados e sacrificados, em conformidade com as diretrizes institucionais para bem-estar animal e as leis em experimentos com animais emitidos pelo governo alemão.

Este método oferece a possibilidade de estudar as propriedades elétricas de neurônios específicos na retina intacta sob orientação visual, sem influenciar a condição de adaptação da retina. É particularmente adequado para a caracterização de células que estão actualmente bastante mal estudada, devido à baixa densidade populacional como a maioria das populações de células amácrinas. Dois fótons excitação permite imagens de alta resolução e alto contraste até mesmo de partes mais profundas do tecido 17, um pré-requisito para uma mira precisa e bem sucedida patch-fixação de células particularmente no INL, com sua alta densidade de corpos celulares. A retina do rato isolada é viável para 3-4 h nas condições experimentais. Se a retina segundo é armazenado em completa escuridão sob gaseamento carbogênio contínua, mantém a cor púrpura do fotopigmento crus e pode ser usado depois de terminar experimentos com a retina em primeiro lugar. No início, visando acélulas selecionado com a micropipeta na wholemount da retina é um pouco desafiador e requer alguma prática, especialmente quando se trabalha na escuridão. Incluindo um corante fluorescente na micropipeta pode simplificar o procedimento, porque celular e micropipeta são visíveis sob dois fótons de excitação, ao mesmo tempo. No entanto, a adição de componentes à solução intracelular podem impedir a formação de gigaseal ou causar a qualidade de gravação a sofrer. Uma vez alcançado com sucesso, uma boa gravação pode durar cerca de 1 h. Considerando que a luz de excitação infravermelho si só é mal absorvido por fotorreceptores da retina, animado células que expressam GFP emite luz na parte visível do espectro. No entanto, fluoróforos está animado apenas em um pequeno volume focal que não é susceptível de alterar a condição de adaptação da retina. Ainda mais excitação, só é necessária para segmentação e pode ser desligado durante a gravação de respostas luz. O usefulness desta abordagem já está demonstrada por estudos em populações específicas de células amácrinas 14,18 a partir do qual as gravações eletrofisiológicas de outra forma teria sido possível apenas por acidente 12. Finalmente, esta poderosa técnica pode ainda ser prorrogado, incluindo uma abordagem farmacológica 14, Ca 2 + 19 ou imagem usando células injetadas para estudos imunocitoquímicos ou microscopia eletrônica. Dessa forma, a posição funcional de um dado tipo de célula no circuito da retina podem ser desvendados.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / equipamentos de </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Óculos de visão noturna </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Alemanha </td><td> Xtron F1 </td><td> inclui uma fonte de luz 800 nm </td></tr><tr><td> Filtro óptico </td><td> Schott, Mainz, Alemanha </td><td> RG9 </td><td> longpass filtro com corte em 690 nm </td></tr><tr><td> Iris tesoura </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 14061-09 </td><td> curvo com 22 milímetros de lâmina </td></tr><tr><td> Tesoura primavera </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15000-00 </td><td> em linha reta com 3 milímetros de lâmina </td></tr><tr><td> Câmara de gravação </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Alemanha </td><td> 200-100 500 0180 Tipo A (CT) </td><td> Teflon câmara com fundo montado lamínula de vidro (aprox. 0,15 mm; n º 2-100 500 0182) </td></tr><tr><td> Aquecedor de fluxo </td><td> Sistemas de multicanal, Reutlingen, Alemanha </td><td> PH01, TC01 </td><td> cânula de perfusão aquecido com a temperatura scontrolador de Ensor e temperatura </td></tr><tr><td> Microscópio de varredura a laser </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> controlada pelo Software Leica Confocal </td></tr><tr><td> Air tabela </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> Modo bloqueado tsunami Ti: safira de laser </td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> pco AG, Kelheim, Alemanha </td><td> PixelFly QE </td><td> incluindo software de controle </td></tr><tr><td> Micropipeta capilares de vidro </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Alemanha </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta extrator </td><td> Instrumento Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> corante fluorescente </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> não traçador fluorescente </td></tr><tr><td> Estreptavidina-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Alemanha </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> motorizada Mini25 unidade manipulador com display SM-5 </td></tr><tr><td> Amplificador de patch-clamp </td><td> npi electronic GmbH, Tamm, Alemanha </td><td> SEC-05LX npi </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> De aquisição de dados software WinWCP </td><td> John Dempster, University of Scotland, Glasgow, Reino Unido </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> QDS gerador de estímulo visual </td><td> Thomas Euler, da Universidade de Tübingen, Alemanha </td><td></td><td> tem que ser operado em um computador separado controlar dois monitores (interface do usuário, estímulo monitor) </td></tr><tr><td> Os filtros de densidade neutra </td><td> ITOS, Mainz, Alemanha </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

Estudar as propriedades fisiológicas e conexões sinápticas de neurônios específicos no tecido intacto é um desafio para as células que evidente falta características morfológicas ou mostrar uma baixa densidade populacional. Isso vale principalmente para células amácrinas da retina, uma classe de interneurônios excepcionalmente multiformes que compõem cerca de 30 subtipos em mamíferos 1. Apesar de ser uma parte crucial do processamento visual, moldando a saída da retina 2, a maioria desses subtipos não foram estudadas até agora em um contexto funcional, pois encontrar essas células com um eletrodo de gravação é um evento raro. Recentemente, uma infinidade de linhas de camundongo transgênico que está disponível marcadores fluorescentes expressar como a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle de promotores de receptores de membrana ou enzimas que são específicos para apenas um subconjunto de neurônios em um dado tecido 3,4. Estas células pré-rotulados são, portanto, accessible para microeletrodo dirigido segmentação sob controle microscópico, permitindo o estudo sistemático de suas propriedades fisiológicas in situ. No entanto, a excitação de marcadores fluorescentes é acompanhada pelo risco de fototoxicidade para o tecido vivo. Na retina, esta abordagem é adicionalmente prejudicada pelo problema que a luz de excitação faz com que a estimulação adequada dos fotorreceptores, assim, infligir fotopigmento branqueamento e transferência dos circuitos da retina em uma condição de luz adaptado. Estas desvantagens são superadas usando excitação infravermelho entregue por um mode-locked laser em pulsos curtos da faixa de femtossegundos. Excitação de dois fotões fornece energia suficiente para a excitação fluoróforo e, ao mesmo tempo restringe a excitação a um pequeno volume de tecido a minimização dos perigos de photodamage 5. Além disso, ele deixa a retina sensíveis aos estímulos visuais desde a luz infravermelha (&gt; 850 nm) só é mal absorvido pelo fotopigmentos 6. em gravações situ de células que expressam GFP que são visualmente alvo de dois fótons excitação. A retina é preparada e mantida no escuro e pode ser submetido a estímulos ópticos, que são projetadas através do condensador do microscópio (Figura 1). Patch-clamp gravação de respostas a luz pode ser combinado com a tintura de enchimento para revelar a morfologia e para verificar se há corante gap-junction mediada acoplamento para as células vizinhas, de modo que a célula-alvo pode por estudadas em diferentes níveis experimental.

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Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Este artigo descreve a gravação de células individuais de fluorescente etiquetado populações neuronais na retina do rato intacto. Usando dois fótons infravermelhos excitação transgenetically células marcadas foram alvo de patch-clamp de gravação para estudar as respostas de luz, as propriedades de campo receptivo, e morfologia.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K visualizações.  University of Oldenburg. Este artigo descreve a gravação de células individuais de fluorescente etiquetado populações neuronais na retina do rato intacto. Usando dois fótons infravermelhos excitação transgenetically células marcadas foram alvo de patch-clamp de gravação para estudar as respostas de luz, as propriedades de campo receptivo, e morfologia.

Vídeo: Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Neurociência

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

O isolamento de populações de células distintas do cerebelo em desenvolvimento por Microdissecção

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

In Vitro Caracterização das propriedades eletrofisiológicas das fibras aferentes do cólon em ratos

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...