وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (WE849/16 1 / 2 الى دينار وRW). ونحن ممتنون ليولر توماس (Töbingen والمانيا) لتحفيز QDS البرامج الخفيفة.

الوصف التالي يفترض أن لديه فهم المجرب الأساسية للبنية شبكية العين ، وتسجيل التصحيح ، المشبك ، والفحص المجهري لمدة الفوتون. للحصول على معلومات مفيدة حول إنشاء وتشغيل الإعداد التصحيح ، المشبك واثنين من الفوتون نظام التصوير نرى الحكام [7-12]. 1. الأنسجة الحيوانية وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الماوس مظلمة مكيفة لا يقل عن 3 ساعة في غضون ذلك ، وإعداد 1-2 لتر من حل خارج الخلية التي تتكون من (مم) 125 كلوريد الصوديوم ، و 2.5 بوكل ، 1 CaCl 2 و 1.6 MgCl 2 و 25 NaHCO 3 و 10 مد الجلوكوز ويوازن إلى 7.4 درجة الحموضة بالغاز مع كربوجين (CO 2 5 ٪ في O 2) في درجة حرارة الغرفة. </li> a <li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس في غرفة محكمة الغلق بواسطة جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون 2 تليها خلع عنق الرحم. يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء ، والخطوات التالية في الظلام. استخدام خافت الإضاءة طويلة الموجة (نحن كتلة موجات قصيرة من مصدر ضوء بارد من قبل 690 نانومتر longpasفلتر) لدعم رؤية شخصية مع الحفاظ على أعين الحيوان مظلمة مكيفة (الفئران لا تملك إلا ضعف البصر في الجزء الأحمر من الطيف الضوء). لاستكمال العمل في إنارة الظلام استخدام الأشعة تحت الحمراء (&gt; 800 نانومتر) ، وارتداء نظارات للرؤية الليلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عيون استأصل مع زوج من مقص القزحية المنحنية ونقلها إلى طبق من حل خارج الخلية وضعت تحت مجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القرنية والجسم الهدبي من خلال فتح العين على طول لمبة أورا مشرشر (على الحدود بين الشبكية والجسم الهدبي) مع زوج من مقص الربيع (التي نستخدمها لأول مرة لانسيت اختراق نقطة انطلاق لعدة قطاعات). تأخذ بها العدسة والشبكية منفصلة بعناية من الظهارة الصبغية. إذا كان التوجه للشبكية أمر حاسم لدراستك ، تشير إلى أنه في مثل المرجع [12]. قطع العصب البصري بين شبكية العين والبشرة وإزالة صبغة الشبكية من فنجان العين. لاحظ اتجاه الأسطح الشبكية : داخل الشبكية كرة لولبية من المتابعة هو ganglايون الجانب الخلية ؛ الخارج هو الجانب مبصرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلية عن طريق سحب بلطف تشغيله مع المعونة من مسواك خشبي. لهذا الغرض ، واستخدام وحدة تخزين صغيرة من حل خارج الخلية التي تغطي فقط في شبكية العين. ويمكن سحب العصي الزجاجي إلى مسواك وcentrifugally قبالة الشبكية. ثم ، وتطبيق شقوق قصيرة على طول محيط الشبكية لتسهيل التسوية من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشبكية الى غرفة تسجيل مبصرة ، الجانب السلبي ، تنتشر بها على أسفل الزجاج (نستخدم فرشاة غرامة) ، وذلك مع شل النايلون موتر إطار من الفولاذ المقاوم للصدأ. تعد الثانية في شبكية العين بنفس الطريقة وابقائه في الظلام مكيفة حل carboxygenated خارج الخلية لاستخدامها لاحقا. </li></ol> 2. التسجيلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت غرفة تسجيل في الظلام تحت مجهر المسح الضوئي والليزر تستقيم superfuse إعداد الشبكية باستمرار (لا تقل عن 5 مل / ميلن) مع الحل خارج الخلية carboxygenated تسخينها إلى 35 درجة مئوية. يقع المجهر (مجهزة أيضا مع كاميرا تعمل بالأشعة تحت الحمراء الحساسة CCD) على امتصاص الصدمات الجدول الهواء داخل قفص فاراداي لالتدريع الالكترونية. تغطية القفص مع ستارة غير شفافة للحفاظ على إعدادها في الظلام. نحن أيضا إيقاف شاشة الضوء من شاشات الكمبيوتر التي فيلم شفافة حمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليف ليزر الأشعة تحت الحمراء ل850-870 نانومتر أو الموجات الأطول ، والتحول إلى وضع شرط تأمين ، واستخدام اثنين من الفوتون الإثارة لتصور GFP ، معربا عن الخلايا. التخفيف من انتاج الليزر باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة التي تسيطر عليها الليزر برنامج المسح وصولا الى درجة غير كافية لمجرد اعتراف واضح من الخلية الفلورسنت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن التصحيح ، المشبك التسجيلات الجاري في وضع الزجاج المشبك micropipettes استخدام (البورسليكات نستخدم أنابيب زجاجية قطرها 1.5 مم الخارجي ، وسمك الجدار 0.225 ملم) مليئة حل الخلايا التي تتكون من (مم) 125 K - غلوكونات ، 10 بوكل ، 0.5 EGTA ، 10 HEPES ، معاير لدرجة الحموضة 7.4 مع KOH (إعطاء المقاومة ماصة من حوالي 5 MΩ). علما أن ظروف تجريبية أخرى مثل الجهد المشبك تسجيل تتطلب حلا مختلفا. إذا المطلوب حقن الصبغة ، إضافة مسبار فلوري (10 ملي نستخدم اليكسا فلور 594) أو جزيء التتبع (3 ٪ Neurobiotin). إدراج micropipette في ماسك وتأكد من أن الإلكترود المرجعي (المكلورة الأسلاك الفضية) في اتصال مع حل خارج الخلية في غرفة تسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الضغط على micropipette واستهداف GFP ، معربا عن الخلية (نستخدم الغمر بالماء 40 أضعاف الهدف ؛ NA 1.25). وتقع أجسام الخلايا عديم الاستطالات في طبقة الخلايا العقدية (تحت السطح مباشرة في التوجه الحالي في شبكية العين) وكذلك في الجزء القريب من الطبقة النووية الداخلية (حوالي 55-75 ميكرومتر في أعماق الإعداد). قبل micropipette الاتصال مع الخلية المستهدفة ، ويحد من الغشاء الداخلي (غمد مصنوع من endfeet الدبقية) في شبكية العينالسطح يجب أن يكون اخترق. ومن المسلم به الاختراق الناجحة التي قام بها حل الخلايا التي يتم طردهم من طرف micropipette ويفصل الغشاء الداخلي يحد من أنسجة الشبكية الأساسية كما يمكن ملاحظتها على صورة انتقال الأشعة تحت الحمراء التي تلتقطها كاميرا الأشعة تحت الحمراء لاتفاقية مكافحة التصحر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نهج الخلية المطلوبة من خلال مقارنة موقف سوما من صورة ثنائية الفوتون مع صورة للكاميرا الأشعة تحت الحمراء لاتفاقية مكافحة التصحر التي تبين موقف micropipette التسجيل. علما بأن هذه الخطوة لا يتحقق بسهولة ، ويتطلب بعض الممارسة ، لأن الخلية GFP ، معربا عن أن تكون معترف بها في نقل صورة الأشعة تحت الحمراء من أجل توجيه micropipette تجاهها. ويتم تحقيق الاستهداف الصحيح عند الحافة micropipette الأسباب التنقير من سطح الخلية والتي يمكن مشاهدتها في صورة ثنائية الفوتون. بديل لهذا الإجراء ، واستخدام صبغة الفلورسنت (مثل اليكسا فلور 594 ، 100 ميكرون) في حل الخلايا للكشف عن موقف micropipette في صورة ثنائية الفوتون. ثنائي الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء يسمح مضان كافية من هذه الصبغة لجعل micropipette ملحوظ. لهذا الغرض ، وضبط نطاق الكشف في برنامج المسح بالليزر ليشمل أيضا مضان أحمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن ضغوط من micropipette والحصول على كامل الخلية التصحيح ، المشبك التكوين في وضع المشبك الجاري. وينبغي أن تعطي تسجيل صالحة للاستعمال إمكانات غشاء -50 إلى -55 بالسيارات ومشاركة ما لا يقل عن 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المثيرات البصرية الحالية إنشاؤها بواسطة برنامج التحفيز (نستخدم QDS التي يولر توماس ، من جامعة توبنغن ، ألمانيا) 11 على جهاز الكمبيوتر. ضبط الموضع المكاني للتحفيز أن تركز على الخلية المسجلة : مارك موقف الخلية تظهر على الشاشة صورة انتقال الكاميرا IR - CCD ومركز حافزا الموضعية مثل على ذلك. ضبط كثافة التحفيز عن طريق إدراج مرشحات الكثافة محايدة في مسار الشعاع. لمعايرة رصد الطيف وكثافة انظر المرجع [14]. اختيار prolongeد interstimulus الفاصل الزمني (على سبيل المثال 15 ق) لتجنب التكيف. وتشمل الضوئي ضمن مسار شعاع للحفاظ على سجل توقيت التحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول بدء التحفيز وتسجيل ردود الخفيفة (نستخدم معدل أخذ العينات من 10 كيلوهرتز مع تصفية عند 5 كيلو هرتز لغير التشويك الخلايا ؛ لتسجيل ارتفاع ينصح ارتفاع معدل أخذ العينات مثل 20 كيلو هرتز). استخدام برنامج التحفيز ضوء لتشغيل برنامج تسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصبغ ملء السماح للعامل الفلورسنت منتشر في الخلية المسجلة ل30-45 دقيقة قبل أن يتراجع بعناية micropipette من الخلية. الحرص على عدم سحب خلايا الجسم. إذا تم استخدام غير الفلورسنت Neurobiotin التتبع ، فإنها بحاجة إلى التصور من قبل ملزمة لstreptavidin مترافق إلى fluorophore (نستخدم streptavidin - Cy3 ، 1:400 أكثر من ليلة عند 4 درجة مئوية بعد 20 دقيقة من التثبيت بارافورمالدهيد الشبكية ؛ لاقتران صباغة ويمكن إطالة الدراسات streptavidin الحضانة إلى 3 د). بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن يؤديها مع الحقنأقطاب حادة (&gt; 100 MΩ) عندما يتم دفع الصبغة iontophoretically في الخلية مخوزق (البقول مستطيلة : ،25-1 NA ، و 100 مللي ، 100 مللي الفاصل ، مجموع الوقت 3-6 دقائق). </li></ol> 3. ممثل النتائج : النتائج التالية تنشأ من الدراسة على الماوس التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت مروج للهيدروكسيلاز التيروزين 13،14 ، الانزيم تحفيز معدل الحد خطوة في التوليف الكاتيكولامينات (TH : GFP الماوس). استنادا إلى سطوع GFP اشارة المجموعتان خلية متميزة ومميزة (الشكل 2A). خلايا التعبير عن المستوى العالي GFP تمتلك أجسام الخلايا الموجودة في الطبقة النووية الداخلية (INL ، الشكل 2A) أو المشردين في طبقة الخلايا العقدية (GCL ، الشكل 2B) وتطبق في منتصف طبقة ضفيري الداخلية (IPL ، الشكل 2C) . وحددت على أنها خلايا من النوع 2 14-16 ويمكن أن تدرس بشكل منهجي فيما يتعلق مورفولوجيا (الشكل 3) والمنتخبالنشاط rical (الشكل 4) على الرغم من كثافة سكانها سوى مبالغ إلى 250 خلية / مم 2. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> الشكل 1. التمثيل التخطيطي من الإعداد التجريبية. ثنائي الفوتون الإثارة (أحمر مسار الضوء منقط) من fluorophore - معربا عن الخلايا في شبكية العين سليمة تمكن البصرية التي تستهدف من قبل micropipette (مسار الضوء الأخضر الانبعاثات). يتعرض للمؤثرات البصرية الشبكية عبر المكثف المتوقع من المجهر (أصفر مسار الضوء) ، وتسجل ردود ضوء الخلوية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> الشكل 2. GFP ، معربا عن الخلايا في شبكية العين من flatmount TH : GFP الماوس. ويمكن التمييز بين اثنين من السكان من قبل سطوع الإشارات GFP : 1 نوع الخلايا (خلايا DA) الموجود في INL تظهر مضان ضعيفة (A ، انظر السهام) ونوع الخلايا المسمى مكثف 2مع الهيئات الخلية إما في INL (A ، انظر سهام) أو المشردين في GCL (B) والتراتب شجيري في S3 الطبقة من الشعيرات (C). أشرطة النطاق ، 50 ميكرومتر. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> الشكل 3. المورفولوجيا خلية من النوع 2 حقنوا Neurobiotin التتبع. كان تصور التتبع لاحقا من قبل streptavidin - Cy3 ملزمة (قرمزي). ومجهرية ، وهو يصور أيضا إشارة GFP (أخضر) ، هو الإسقاط من مداخن صورة تغطي GCL والشعيرات. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> الشكل 4. ردود ضوء خلية من النوع 2 الموجود في GCL. نمط الاستجابة إلى الأبيض إنارة كامل الحقل ضوء الكثافة المتزايدة في مجموعة ظلامية. ويرد في كثافة التحفيز photoisomerizations في قضيب في الثانية الواحدة (ره * / قضيب / ثانية). تم استخدام التحفيز لفترات طويلة من 3 ليالي لأفضل متميزةايون من مكونات الاستجابة عند بدء التحفيز (ON الاستجابة) ويقابلها (إيقاف الاستجابة).

<ol>
	<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+plan+of+the+retina.">The fundamental plan of the retina.</a> Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li><li>Baccus, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+computation+in+inner+retinal+circuitry.">Timing and computation in inner retinal circuitry.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionally+selective+calcium+signals+in+dendrites+of+starburst+amacrine+cells.">Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells.</a> Nature. 418, 845-852 (2002).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Jackson, M. B., Gerfen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+voltage+clamp+recording.">Whole-cell voltage clamp recording.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (1997).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pf&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).</li><li>Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , (2005).</li><li>Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope+-+optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.">Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pfl&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).</li><li>Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+tyrosine+hydroxylase+promoter+activity+during+midbrain+dopaminergic+neuron+development.">Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development.</a> J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).</li><li>Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+underlying+the+ON-OFF+light+responses+of+type+2+wide-field+amacrine+cells+in+TH-GFP+mice.">Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice.</a> J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).</li><li>Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+genetically+labeled+catecholamine+neurons+in+the+mouse+retina.">Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina.</a> Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).</li><li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina.">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla M&#252;ller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina.">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li><li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina.">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li></ol>

وقد تم التعامل مع الفئران والموت الرحيم وفقا لمبادئ توجيهية مؤسسية لرعاية الحيوان والقوانين المتعلقة التجارب على الحيوانات التي تصدرها الحكومة الألمانية.

هذا الأسلوب يتيح إمكانية لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية المحددة في الشبكية سليمة تحت إشراف البصرية دون التأثير على حالة adaptational الشبكية. هي مناسبة خاصة وأنها لتوصيف الخلايا التي هي في الوقت الحاضر بدلا درس سيئة بسبب الكثافة السكانية المنخفضة مثل معظم السكان من الخلايا عديم الاستطالات. ثنائي الفوتون الإثارة تصاريح التصوير عالية الدقة وعالية التباين ، وحتى من أعمق أجزاء من الأنسجة 17 ، شرطا مسبقا لاستهداف دقيقة وناجحة التصحيح - لقط من خلايا خاصة في INL مع كثافة عالية من الهيئات الخلية. شبكية العين هي معزولة الماوس قابلة للح 3-4 في ظل الظروف التجريبية. إذا تم تخزين شبكية العين الثانية في ظلام دامس تحت بالغاز كربوجين مستمرة ، فإنه يحتفظ اللون الأرجواني من صباغ متبدل بالضوء غير المبيض ، ويمكن استخدامها بعد الانتهاء من التجارب على شبكية العين الأولى. في البداية ، واستهدافالخلية المحددة مع micropipette wholemount في شبكية العين قليلا تحديا ويتطلب بعض الممارسة ، وخصوصا عندما تعمل في الظلام. يمكن بما في ذلك صبغة الفلورسنت في micropipette تبسيط الإجراءات ، وذلك لأن الخلية وmicropipette مرئية تحت ثنائية الفوتون الإثارة في نفس الوقت. ومع ذلك ، قد إضافة مكونات إلى حل بين الخلايا يعرقل تشكيل gigaseal أو التسبب في جودة التسجيل للمعاناة. مرة واحدة حققت بنجاح ، يمكن تسجيل جيدة للمشاركة حوالي 1 ساعة. في حين أن ضوء الأشعة تحت الحمراء هي سيئة الإثارة فقط استوعبت نفسها مبصرات الشبكية ، متحمس GFP - معربا عن الخلايا ينبعث الضوء في الجزء المرئي من الطيف. ومع ذلك ، نحن متحمسون fluorophores فقط في حجم تنسيق والصغيرة التي ليس من المرجح أن تغير الشرط adaptational من شبكية العين. وهناك حاجة فقط عن أكثر ، والإثارة لاستهداف ويمكن مغلقا خلال تسجيل الاستجابات الخفيفة. وusefulnويتجلى بالفعل وفاق سطيف لهذا النهج من الدراسات على فئات معينة من السكان من الخلايا التي عديم الاستطالات 14،18 من التسجيلات الكهربية لولاها لكان ممكنا فقط عن طريق الصدفة 12. أخيرا ، يمكن أيضا أن تكون هذه التقنية القوية التي تقدمها بما في ذلك اتباع نهج الدوائية 14 ، كا 2 + 19 أو التصوير باستخدام خلايا حقن للدراسات immunocytochemical أو المجهر الإلكتروني. بهذه الطريقة ، يمكن كشف موقف الوظيفية من نوع خلية معينة في الدوائر الشبكية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> كاشف / جهز السالح </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> نظارات للرؤية الليلية </td><td> Gutzeit محدودة ، Warthausen وألمانيا </td><td> Xtron F1 </td><td> يتضمن مصدر الضوء 800 نانومتر </td></tr><tr><td> تصفية البصرية </td><td> شوت ، ماينز ، ألمانيا </td><td> RG9 </td><td> longpass فلتر مع قطع تبلغ 690 نانومتر </td></tr><tr><td> مقص القزحية </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 14061-09 </td><td> منحني مع النصل 22 مم </td></tr><tr><td> مقص الربيع </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 15000-00 </td><td> مستقيم مع شفرة 3 ملم </td></tr><tr><td> غرفة تسجيل </td><td> وLuigs نيومان محدودة ، Ratingen ، ألمانيا </td><td> 200-100 500 0180 نوع A (TC) </td><td> تفلون مع غرفة أسفل محمولة على الزجاج زلة تغطية (حوالي 0.15 ملم ، 500 رقم 0182 200-100) </td></tr><tr><td> تدفق سخان </td><td> نظم متعددة ، ريوتلنجن وألمانيا </td><td> PH01 ، TC01 </td><td> مع صفيحة تسخين قنية التروية مع درجة الحرارة لياليودرجة الحرارة وحدة تحكم إنسور </td></tr><tr><td> مجهر المسح الضوئي ليزر </td><td> لايكا مايكروسيستمز </td><td> DM LFS </td><td> متحد البؤر التي تسيطر عليها برامج لايكا </td></tr><tr><td> الجدول الهواء </td><td> نيوبورت </td><td> VH - 3036W الأراضي الفلسطينية المحتلة </td><td></td></tr><tr><td> الليزر </td><td> الأطياف ، الفيزياء </td><td></td><td> الوضع غير الساحلية تسونامي تي : ليزر الياقوت </td></tr><tr><td> كاميرا CCD </td><td> AG PCO ، Kelheim وألمانيا </td><td> PixelFly QE </td><td> بما في ذلك البرمجيات السيطرة </td></tr><tr><td> Micropipette الزجاج الشعيرات الدموية </td><td> Hilgenberg ، Malsfeld وألمانيا </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette مجتذب </td><td> سوتر الصك </td><td> P - 97 </td><td></td></tr><tr><td> الكسا فلور 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A - 20004 </td><td> صبغة الفلورسنت </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC - SP - 1120 - M050 </td><td> غير الفلورسنت التتبع </td></tr><tr><td> Streptavidin - Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> هيئة التصنيع العسكريromanipulator </td><td> وLuigs نيومان محدودة ، Ratingen ، ألمانيا </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> بمحركات Mini25 حدة تتلاعب مع عرض SM - 5 </td></tr><tr><td> التصحيح ، المشبك مكبر للصوت </td><td> NPI الإلكترونية محدودة ، تام ، ألمانيا </td><td> SEC - 05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td> التحويل الرقمي </td><td> الصكوك الوطنية </td><td> BNC - 2090 </td><td></td></tr><tr><td> الحصول على البيانات البرمجيات WinWCP </td><td> جون ديمبستر ، جامعة اسكتلندا ، غلاسكو ، المملكة المتحدة </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> QDS التحفيز البصري مولد </td><td> توماس أويلر ، جامعة توبنغن في ألمانيا </td><td></td><td> يجب أن تعمل على كمبيوتر منفصل التحكم 2 مراقبين (واجهة المستخدم ، ورصد الحوافز) </td></tr><tr><td> مرشحات الكثافة محايدة </td><td> ITOS ، ماينز ، ألمانيا </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

دراسة الخصائص الفيزيولوجية واتصالات متشابك معينة من الخلايا العصبية في أنسجة سليمة يشكل تحديا لتلك الخلايا التي تفتقر إلى السمات المورفولوجية واضح أو إظهار كثافة السكانية المنخفضة. هذا ينطبق بشكل خاص على الخلايا الشبكية عديم الاستطالات ، وهي فئة استثنائية في interneurons المتعددة الأشكال والتي تضم ما يقرب من 30 في الثدييات فرعية 1. على الرغم من كونها جزءا مهما من معالجة البصرية من خلال وضع الإخراج الشبكية 2 ، لم تكن معظم هذه الأنواع الفرعية درست حتى الآن في سياق وظيفي لمواجهة هذه الخلايا مع القطب تسجيل هو حدث نادر. في الآونة الأخيرة ، عدد كبير من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تتوفر علامات التعبير عن بروتين فلوري مثل الفلورسنت الأخضر (GFP) تحت سيطرة المروجين لمستقبلات الغشاء أو الانزيمات التي هي محددة لمجموعة فرعية فقط من الخلايا العصبية في نسيج معين 3،4. هذه الخلايا ما قبل المسمى بالتالي فهي accessibl<html> ه لتوجيه microelectrode استهداف تحت السيطرة المجهرية ، والسماح للدراسة منهجية خصائصها الفسيولوجية في الموقع. ومع ذلك ، ويرافق إثارة علامات الفلورسنت من خطر الضيائية للأنسجة الحية. في شبكية العين ، ويعوق هذا النهج بالإضافة إلى المشكلة التي تسبب الإثارة ضوء التحفيز المناسب للمبصرات مما كبد صباغ متبدل بالضوء تبيض ونقل الدوائر الشبكية في حالة الضوء مكيفة. يتم التغلب على هذه العوائق باستخدام الأشعة تحت الحمراء الإثارة التي تقدمها ليزر وضع تخوض نبضات قصيرة من نطاق الفيمتو ثانية. الإثارة ثنائي الفوتون يوفر طاقة كافية لاستثارة fluorophore ، وفي الوقت نفسه يحد من الإثارة إلى وحدة تخزين صغيرة الأنسجة التقليل من مخاطر photodamage 5. أيضا ، فإنه يترك الشبكية تستجيب لمحفزات بصرية منذ ضوء الأشعة تحت الحمراء (&gt; 850 نانومتر) هو ضعيف فقط تمتصه photopigments 6. ق = &quot;jove_content&quot;&gt; نحن في هذه المقالة لشرح استخدام الفأرة في شبكية العين وراثيا لتحقيق الكهربية في تسجيلات الموقع من GFP ، معربا عن الخلايا التي يتم استهداف بصريا من قبل اثنين من الفوتون الإثارة. مستعدة شبكية العين والمحافظة عليها في الظلام ويمكن أن يتعرض للمؤثرات الضوئية التي يتوقع عبر المكثف من المجهر (الشكل 1). ويمكن الجمع بين التصحيح ، المشبك تسجيل الاستجابات ضوء صبغ مع ملء الكشف عن التشكل وصبغ للتحقق من مفرق بوساطة الفجوة اقتران إلى الخلايا المجاورة ، بحيث يمكن دراستها من قبل الخلية الهدف على مستويات مختلفة التجريبية.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina at JoVE.com

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

هذا المقال يصور تسجيل الخلايا العصبية الفردية من السكان الموسومة fluorescently في الشبكية الماوس سليمة. باستخدام اثنين الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء تم استهداف الخلايا المسمى transgenetically عن التصحيح ، المشبك تسجيل لدراسة ردودهم الخفيفة ، وخصائص الحقل تقبلا ، والتشكل.

توصيف بالسكان خلية كهربية من GFP - يعرب عن السليمة في الشبكية

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K Views.  University of Oldenburg. هذا المقال يصور تسجيل الخلايا العصبية الفردية من السكان الموسومة fluorescently في الشبكية الماوس سليمة. باستخدام اثنين الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء تم استهداف الخلايا المسمى transgenetically عن التصحيح ، المشبك تسجيل لدراسة ردودهم الخفيفة ، وخصائص الحقل تقبلا ، والتش...

Video: Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

عضوي النمط من الثقافة شريحة GFP - معربا عن أجنة الفئران لريال مدريد في الوقت ثمرة تصوير الأعصاب الطرفية

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

توصيف نسيجية سليمة من الأجهزة بالغة الصغر زرع الدماغ والأنسجة المحيطة بها

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

تسجيل الكهربية في الدماغ سليمة من اسماك الزرد الكبار

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

عزل بالسكان خلية متميزة من المخيخ تطوير من تسليخ مجهري

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

في التحليل المتعمق الفسيولوجية لبالسكان خلية المعرفة في الحادة الأنسجة شرائح من الميكعي الجهاز ماوس

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

في المختبر توصيف الخصائص الكهربية لألياف الزبائ Colonic في الفئران

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...