この作品は、ドイツ学術振興（KD及びRWへWE849/16 1 / 2）によってサポートされていました。我々は、光刺激のソフトウェアのQDS用トーマスオイラー（Töbingen、ドイツ）に感謝しています。

以下の説明では、実験者は網膜構造、パッチクランプ記録、および二光子顕微鏡の基本的な理解を持っていることを前提としています。パッチクランプのセットアップと2光子イメージングシステムを確立し、実行する上で有用な情報については文献[7-12]を参照してください。 1。動物と組織の準備<ol><li>マウスは、少なくとも3時間暗順応してくださいcarbogenと処刑によってそれまでの間、から成る細胞外溶液の1〜2リットル（mMで）125のNaCl、2.5 KClを、1のCaCl 2、1.6のMgCl 2、25飽和NaHCO 3、10 D -グルコースを準備し、pH7.4にそれを平衡化（5％O 2でCO 2）室温で。 </li> a <li>頸椎脱臼に続いてCO 2過剰投与によって気密チャンバー内にマウスを安楽死させる。この手順と次の手順は、暗闇の中で実行する必要があります。暗く長い波長の照明を使用して（我々は690 nmのlongpasによる冷光源から短い波長をブロックする動物の目は（マウスは光のスペクトルの赤色部分で視力を持つ）暗順応に保ちながらのフィルタが）個人的なビジョンをサポートする。完全な暗闇での作業のために赤外線照明を使用してください（&gt; 800 nm）と暗視ゴーグルを着用してください。 </li><li>除核するには、湾曲した虹彩のハサミで目と解剖顕微鏡下に置かれ、細胞外液の皿に移す。 </li><li>春のはさみとORAのコナラ（網膜や毛様体の間の境界）（我々が最初に穴を開けるためにカットするための出発点をランセットを使用する）に沿って目の電球を開いて、角膜や毛様体を取り外します。レンズを取り出し、慎重に色素上皮から網膜を分離。網膜の向きは自分の研究に重要な意味を持つ場合、それは文献[12]などを示している。網膜と色素上皮との間の光学的神経を切断し、アイカップから網膜を削除します。網膜表面の方向に注意してください：カールアップ網膜の内側にはganglですイオンのセル側、外側は、感光体の側です。 </li><li>そっと木のつまようじの助けを借りてそれを引っ張って、内側の網膜表面から硝子体を取り除きます。この目的のために、ちょうど網膜をカバーする細胞外液の少量を使用してください。硝子楊枝にスティックと網膜から遠心ドラッグすることができます。その後、組織のフラット化容易にするために網膜周辺部に沿って短い切開を適用します。 </li><li>グラスの底の上に広がって（我々は細かいブラシを使用）とステンレス鋼のナイロン神経質のフレームでそれを固定化、記録室下に光受容側に網膜を移す。同じ方法で第二網膜を準備し、それが後で使用するためにcarboxygenated細胞外液中に暗順応してください。 </li></ol> 2。レコーディング<ol><li>直立レーザー走査型顕微鏡の下で暗闇での録音室をインストールし、（連続して網膜の準備を表面かん流する5以上ミリリットル/マイルcarboxygenated細胞外溶液とn）は35℃に加熱顕微鏡は、（また、赤外感度CCDカメラを搭載）を電磁的に遮蔽するためのファラデーケージの内部に衝撃吸収エアテーブルに位置しています。暗闇の中で準備を保つために、非透明なカーテンでケージを覆う。我々はまた、赤い透明フィルムによって、コンピュータモニターからの光をオフスクリーン。 </li><li> 、850〜870 nm以上長波長側に赤外レーザーをチューニングモードロック状態に切り替え、およびGFP発現細胞を可視化する二光子励起を使用してください。蛍光細胞の明確な認識のための丁度十分な程度にレーザースキャニングソフトウェアによってダウン制御NDフィルターを使用してレーザーの出力を減衰させる</li><li>で構成される細胞内液（mMで）125 K -グルコン酸、10のKCl、0.5 EGTで満たされた電流クランプモードの使用のガラスのマイクロピペットのパッチクランプ記録（我々が1.5mm外径と0.225ミリメートル、肉厚のホウケイ酸ガラス管を使用する）ためのKOH（MΩ約5のピペットの抵抗を与える）でpH7.4に滴定、10 HEPES、。電圧クランプ記録のような他の実験条件が異なるソリューションが必要であることに注意してください。色素の注射が必要な場合は、蛍光プローブ（我々は10 mMのAlexa Fluor 594のを使用）またはトレーサー分子（3％Neurobiotin）を追加します。ホルダーにマイクロピペットを挿入し、参照電極（塩化銀線が）録音室内の細胞外溶液に接触していることを確認してください。 </li><li>マイクロピペットへの圧力を適用し、対象とGFP発現細胞を（我々は40倍の水浸対物レンズを使用して、NA 1.25）。アマクリン細胞体は、内顆粒層の近位部（準備中55から75μm程度の深さ）における神経節細胞層（直接網膜の現在の方向で表面下）と同様に位置しています。標的細胞、網膜における内境界膜（グリアendfeet製シース）付きマイクロピペットの接触の前に表面は浸透する必要があります。成功した侵入は、マイクロピペットの先端から追い出さとIR - CCDカメラで撮影した赤外線透過像を観察することができるように基本的な網膜組織から内境界膜を切り離している細胞内液で認識されます。 </li><li>録音のマイクロピペットの位置を示すIR - CCDカメラの画像で2つの光子画像から細胞体の位置を比較することにより、所望の細胞に近づく。 GFP発現細胞はそれに向かってマイクロピペットを指示するために赤外透過画像で認識する必要があるため、このステップは簡単に達成されないことに注意してくださいといくつかの練習が必要です。マイクロピペットの先端は、2光子画像に見られる細胞表面のえくぼ形成させる際に、正しいターゲットが達成されます。この手順の代わりに、二光子画像にマイクロピペットの位置を明らかにするために細胞内液中の蛍光色素（例えばAlexa Fluor 594の、100μM）を使用してください。二光子赤外線励起のマイクロピペットを識別できるようにするには、この色素の十分な蛍光が可能になります。この目的のために、また、赤色蛍光をカバーするためにレーザースキャンソフトウェアで検出範囲を調整する。 </li><li>マイクロピペットからの圧力を解放し、電流クランプモードで全細胞パッチクランプの設定を取得します。使用可能な録音は、少なくとも20分間、-50〜-55 mVと最後の膜電位を与える必要があります。 </li><li>コンピュータのモニタ上に刺激のソフトウェアによって作成された現在の視覚刺激（我々はトーマスオイラー、テュービンゲン大学、ドイツでQDSを使用する）11。記録された細胞を中心とする刺激の空間的位置を調整する：IR - CCDカメラと中心その上にスポット状の刺激の透過画像を示すモニタ上のセルの位置をマークします。光路内にNDフィルターを挿入することで刺激強度をチューニングします。モニターのスペクトルと強度のキャリブレーションのために文献[14]を参照してください。曳索を選択してください適応を避けるために、dを刺激間隔（例えば15秒）。刺激のタイミングの記録を残すためにビームのパス内にフォトダイオードが含まれています。 </li><li>刺激のプロトコルを起動し、光反応を（我々は非スパイク細胞に5 kHzでのフィルタリングでは10kHzのサンプリングレートを使用して、スパイクの記録のために20 kHzのようなより高いサンプリングレートを推奨します）を記録。レコーディングソフトウェアをトリガするために、光刺激のソフトウェアを使用してください。 </li><li>染料は、慎重に後退細胞からマイクロピペットを前に30-45分のための記録された細胞内に蛍光剤の拡散を聞かせ充填するための。セル本体を抜かないように注意してください。非蛍光トレーサーNeurobiotinが使用されている場合、それは（私は4で一晩ストレプトアビジン- Cy3を、1:400を使用して° C蛍光体に結合したストレプトアビジンに結合することにより可視化を必要と網膜の20分のパラホルムアルデヒド固定後、色素カップリング用研究ストレプトアビジンのインキュベーション）が3日に延長することができます。また、注射もして行うことができます。色素がimpaledセル（：0.25から1 nAの、100ミリ秒、間隔100ミリ秒、合計時間3月6日分の矩形パルス）にiontophoretically駆動されるシャープの電極（MΩ&gt; 100）。 </li></ol> 3。代表的な結果： 以下の結果は、チロシン水酸化酵素13,14のためのプロモーター下に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するマウス、カテコールアミン合成（：：GFPマウスTH）の速度律速段階を触媒する酵素の研究に由来する。 GFP -シグナル二つの異なる細胞集団の明るさに基づいて（図2A）区別することができる。高いGFPレベルを発現する細胞は、内顆粒層にある細胞体（INL、図2A）を持っているか、神経節細胞層に変位（GCL、図2B）および内網状層の真ん中（IPL、図2C）で階層化する。彼らは、タイプ2のセル14から16として同定され、体系的に形態に関して（図3）に師事し、選出することができるrical活動（図4）、その人口密度はわずか250細胞/ mm 2にのぼるにもかかわらず。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> 図1。実験装置の模式図。無傷の網膜における蛍光体発現細胞の二光子励起（赤色の点線の光路は）マイクロピペット（緑色発光の光路）によって標的視覚可能になります。網膜は、顕微鏡のコンデンサー（黄色の光路）を介して投影光学刺激にさらされ、そして細胞の光の応答が記録されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> 図2。 THの網膜flatmountにおけるGFP発現細胞：：GFPマウス。タイプ2細胞に弱い蛍光を示すINLにあるタイプ1細胞（DA細胞）（、矢印を参照）と激しくラベル付け：2つの集団はGFP -信号の明るさによって区別す​​ることができますINLのいずれかの細胞体（、矢印を参照）またはGCL（B）とIPLの地層S3（C）における樹状成層に避難。スケールバーは50μm。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> 図3。トレーサーNeurobiotinを注入された2型細胞の形態。トレーサーは、ストレプトアビジン- Cy3を結合（マゼン​​タ）で続いて可視化した。また、GFPのシグナル（緑）を描いたている顕微鏡写真は、、GCLとIPLをカバーする画像スタックの投影です。スケールバーは50μm。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> 図4。 GCLに位置する2型細胞の光反応。暗所視の範囲で増加する強度の白色光のフルフィールド照明への応答パターン。刺激強度は毎秒ロッドあたりphotoisomerizations（RH * /ロッド/ s）で与えられる。 3秒の長時間の刺激は、より良い別個に使用された刺激開始（レスポンスON）とオフセット（応答OFF）での応答の成分のイオン。

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	<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+plan+of+the+retina.">The fundamental plan of the retina.</a> Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li><li>Baccus, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+computation+in+inner+retinal+circuitry.">Timing and computation in inner retinal circuitry.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionally+selective+calcium+signals+in+dendrites+of+starburst+amacrine+cells.">Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells.</a> Nature. 418, 845-852 (2002).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Jackson, M. B., Gerfen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+voltage+clamp+recording.">Whole-cell voltage clamp recording.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (1997).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pf&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).</li><li>Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , (2005).</li><li>Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope+-+optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.">Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pfl&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).</li><li>Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+tyrosine+hydroxylase+promoter+activity+during+midbrain+dopaminergic+neuron+development.">Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development.</a> J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).</li><li>Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+underlying+the+ON-OFF+light+responses+of+type+2+wide-field+amacrine+cells+in+TH-GFP+mice.">Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice.</a> J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).</li><li>Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+genetically+labeled+catecholamine+neurons+in+the+mouse+retina.">Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina.</a> Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).</li><li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina.">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla M&#252;ller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina.">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li><li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina.">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li></ol>

マウスは、制度的な動物福祉のためのガイドラインとドイツの政府が発行する動物実験に関する法律に従って処理して安楽死させた。

このメソッドは、網膜のadaptational状態に影響を与えることなく、視覚的な指導の下で無傷の網膜の特定の神経細胞の電気的特性を研究するために可能性を提供しています。それは、特に現在ではむしろ悪いアマクリン細胞の大部分の集団のような低人口密度のために研究されているセルの特性評価に適しています。二光子励起は、高解像度と高コントラストでも、組織17の深い部分からのイメージング、正確に目標を定めるための前提条件と成功を、特に細胞体のその高密度とINLの細胞のパッチクランプを可能にします。 分離されたマウスの網膜では、実験条件下で3〜4時間のための実行可能です。第二網膜が連続carbogenのガス発生で完全な暗闇に格納されている場合、それは無漂白の光色素の紫の色を保持し、最初の網膜での実験を終えた後に使用することができます。初めに、ターゲット網膜wholemountのマイクロピペットで選択したセルは、暗闇で作業する場合は特に、少し挑戦的であり、いくつかの練習が必要です。セルとマイクロピペットは、同時に2つの光子励起下の表示されているので、マイクロピペットで蛍光色素を含むことは、手続きを簡素化することができます。しかし、細胞内液にコンポーネントを追加することgigaseal形成を阻害したり、記録品質が低下する可能性があります。一度成功達成、良好な記録は約1時間持続できる赤外励起光自体がわずかしか網膜光受容体によって吸収されるのに対し、励起GFP発現細胞では、スペクトルの可視部分で光を発する。しかし、蛍光体は、網膜のadaptational条件を変更される可能性が低い小型の焦点ボリュームに興奮している。すべてのより多くの、励起は標的のために必要とされ、光反応の録画中にオフにすることができます。 usefulnこのアプローチのESSは、すでに電気生理学的記録は、そうでない場合だけ事故を12で可能だった14,18、そこからアマクリン細胞の特定の集団の研究によって実証されている。最後に、この強力な技術は、さらに薬理学的ア ​​プローチ14、Ca 2 +動態のイメージング19を含めることにより、または免疫細胞化学的研究や電子顕微鏡のための注入された細胞を使用して拡張することができます。そうすれば、網膜回路内の特定の細胞型の機能的な位置を解明することができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/資機材</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>暗視ゴーグル</td><td>グートツァイト社、Warthausen、ドイツ</td><td> xtronのF1 </td><td> 800nm​​の光源を含んで</td></tr><tr><td>光学フィルタ</td><td> Schott社、マインツ、ドイツ</td><td> RG9 </td><td> 690 nmのカットオフでフィルタをロングパス</td></tr><tr><td>アイリスはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14061〜09 </td><td> 22 mmのブレードで湾曲</td></tr><tr><td>春のはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15000〜00 </td><td>ストレート3 mmの刃を持つ</td></tr><tr><td>記録室</td><td> Luigs＆ノイマン社、ラティンゲン、ドイツ</td><td> 200〜100 500 0180型（TC） </td><td>ボトムマウント型のガラス製カバースリップを持つテフロンチャンバー（約0.15ミリメートル、第200〜100 500 0182） </td></tr><tr><td>フローヒーター</td><td>マルチチャンネルシステム、ロイトリンゲン、ドイツ</td><td> PH01、TC01 </td><td>温度のある加熱可能な血流カニューレアンソールと温度コントローラ</td></tr><tr><td>レーザー走査顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> DM LFS </td><td>ライカ共焦点のソフトウェアによって制御</td></tr><tr><td>空気テーブル</td><td>ニューポート</td><td> VH 3036W - OPT </td><td></td></tr><tr><td>レーザー</td><td>スペクトラフィジックス</td><td></td><td>津波のモード同期Ti：サファイアレーザー</td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td> PCO AG、Kelheim、ドイツ</td><td> PixelFly QE </td><td>制御ソフトウェアを含む</td></tr><tr><td>マイクロピペットガラスキャピラリー</td><td> Hilgenberg製、Malsfeld、ドイツ</td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>サッターインストゥルメント</td><td> P - 97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594の</td><td>インビトロジェン</td><td> - 20004 </td><td>蛍光色素</td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC - SP - 1120 - M050 </td><td>非蛍光トレーサー</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン- Cy3の</td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td>マイクromanipulator </td><td> Luigs＆ノイマン社、ラティンゲン、ドイツ</td><td> 210〜100 000 0010 </td><td>ディスプレイSM - 5の電動Mini25マニピュレータユニット</td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ</td><td> NPI電子社、タム、ドイツ</td><td> SEC - 05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td>デジタイザー</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td> BNC - 2090 </td><td></td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェアWinWCP </td><td>ジョンデンプスター、スコットランドの大学、グラスゴー、イギリス</td><td></td><td> http://spider.science.strath。 ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td>視覚刺激発生器のQDS </td><td>トーマスオイラー、テュービンゲン大学、ドイツ</td><td></td><td> 2台のモニタを（ユーザーインターフェース、刺激モニター）を制御する別のコンピュータ上で動作する必要があります</td></tr><tr><td> NDフィルター</td><td> ITOS、マインツ、ドイツ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

無傷の組織内の特定の神経細胞の生理学的特性とシナプス結合を研究することは顕著な形態的特徴を欠いたり、低人口密度を示すこれらの細胞のための挑戦である。これは、特に網膜アマクリン細胞、哺乳類1で約30のサブタイプを構成する介在ニューロンの非常に多形のクラスに適用されます。記録電極と、これらの細胞に遭遇することはまれな事象であるため、網膜出力の2を形成することによって視覚処理の重要な一部であるものの、これらのサブタイプのほとんどは、機能的なコンテキストでこれまで検討されていない。 最近、トランスジェニックマウス系統の多数は、特定の組織3,4の神経細胞のサブセットだけに固有の膜受容体や酵素のプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）のような蛍光マーカーを発現することが可能です。これらの事前に標識された細胞は、それゆえaccessiblですその場でそれらの生理学的特性の体系的研究を可能にして、微細な制御下で標的指向微小電極への電子。しかし、蛍光マーカーの励起は、生体組織のための光毒性の危険性を伴っている。網膜では、このアプローチはさらに、励起光は、このように明順応状態に網膜回路を漂白し、転送する光色素を被らせる、光受容体の適切な刺激を引き起こすという問題によって妨げられている。これらの欠点は、フェムト秒領域の短パルスのモード同期レーザーによって提供される赤外励起を使用することによって克服される。二光子励起は、蛍光体の励起のための十分なエネルギーを提供すると同時に、光損傷5の危険性を最小限に抑え、小さな組織のボリュームへの励起を制限します。赤外光を（&gt; 850 nm）の唯一の悪いphotopigments 6によって吸収されるためにも、それは視覚刺激に応答網膜を残します。 場の録音で電気生理学的達成するためにトランスジェニックマウスの網膜の使用方法を示す。網膜が準備され、暗闇の中で維持され、顕微鏡のコンデンサー（図1）を介して投影される光の刺激に供することができるさ。光反応のパッチクランプ記録は、色素が形態を明らかにし、標的細胞がによって異なる実験的なレベルで検討できるように、隣接するセルに結合するギャップジャンクショ​​ンを介した色素をチェックするための充填と組み合わせることができます。

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Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

この記事は、そのままマウスの網膜における蛍光標識神経集団から個々のセルの記録を示しています。二光子赤外線励起を使用してtransgenetically標識された細胞は、それらの光反応、受容野の特性、及び形態を研究するためのパッチクランプ記録を対象としていた。

無傷の網膜におけるGFP発現細胞集団の電気生理学的特性

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K ビュー.  University of Oldenburg. この記事は、そのままマウスの網膜における蛍光標識神経集団から個々のセルの記録を示しています。二光子赤外線励起を使用してtransgenetically標識された細胞は、それらの光反応、受容野の特性、及び形態を研究するためのパッチクランプ記録を対象としていた。

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Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

神経科学

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

脳移植マイクロデバイス及び周辺組織の無傷の組織学的性状

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

マイクロダイセクションによる開発小脳とは異なる細胞集団の単離

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

電気生理学的研究のための成体マウスの網膜の水平スライスの調製

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

体外ラットの結腸求心性線維の電気生理学的特性の評価

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...