Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 à KD et RW). Nous sommes reconnaissants à Thomas d&#39;Euler (Töbingen, Allemagne) pour le QDS la lumière du logiciel de stimulation.

La description suivante suppose que l&#39;expérimentateur a une compréhension de base de la structure de la rétine, patch-clamp, et microscopie à deux photons. Pour plus d&#39;informations utiles sur l&#39;établissement et l&#39;exécution d&#39;un setup de patch-clamp et le système d&#39;imagerie à deux photons voir les références [7-12]. 1. Des animaux et de préparation des tissus <ol><li> Gardez la souris adaptés à l&#39;obscurité pendant au moins 3 h. En attendant, préparez 1-2 L de solution extracellulaire constituée d&#39;(en mm) 125 NaCl, KCl 2,5, CaCl 2 1, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucose et s&#39;équilibrer à pH 7,4 par gazage au carbogène (5% de CO 2 en O 2) à température ambiante. </li> d&#39;un <li> Euthanasier la souris dans une chambre étanche à l&#39;air par le CO 2 surdose suivie par dislocation cervicale. Cette procédure et les étapes suivantes doivent être effectuées dans l&#39;obscurité. Utilisez dim longueur d&#39;onde d&#39;illumination (nous bloquons courtes longueurs d&#39;onde d&#39;une source de lumière froide par un 690 nm-longpass filtre) pour appuyer la vision personnelle tout en gardant les yeux de l&#39;animal adaptés à l&#39;obscurité (les souris ont une mauvaise vue que dans la partie rouge du spectre lumineux). Pour travailler dans l&#39;obscurité d&#39;illumination utilisation complète infrarouge (&gt; 800 nm) et l&#39;usure lunettes de vision nocturne. </li><li> Énucléer les yeux avec une paire de ciseaux à iris courbes et les transférer à un plat de solution extracellulaire placé sous un microscope à dissection. </li><li> Retirez la cornée et le corps ciliaire par l&#39;ouverture de l&#39;ampoule oeil le long de la ora serrata (la frontière entre la rétine et du corps ciliaire) avec une paire de ciseaux à ressort (nous utilisons d&#39;abord une lancette pour percer un point de départ pour la coupe). Sortez de la lentille et de séparer soigneusement la rétine de l&#39;épithélium pigmentaire. Si l&#39;orientation de la rétine est crucial pour votre étude, indiquent comme ça, en référence [12]. Couper le nerf optique entre la rétine et l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine et de supprimer de l&#39;œilleton. Notez la direction de la surface rétinienne: l&#39;intérieur de la rétine lovée est le Ganglcôté pile ion; l&#39;extérieur est le côté photorécepteur. </li><li> Enlever le vitré de la surface intérieure de la rétine par le tirant doucement hors à l&#39;aide d&#39;un cure-dent en bois. Pour ce faire, utilisez un petit volume de solution extracellulaire qui couvre juste la rétine. Les bâtons vitreux à le cure-dents et peut être traîné par centrifugation sur la rétine. Puis, appliquez courtes incisions le long du périmètre pour faciliter la rétine aplatissement du tissu. </li><li> Transfert de la rétine dans la chambre d&#39;enregistrement des photorécepteurs vers le bas, l&#39;étaler sur le fond de verre (nous utilisons un pinceau fin) et l&#39;immobiliser avec un châssis de nylon tendus en acier inoxydable. Préparer la rétine seconde de la même manière et le garder adaptés à l&#39;obscurité dans la solution extracellulaire carboxygenated pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 2. Enregistrements <ol><li> Installez la chambre d&#39;enregistrement dans les ténèbres sous un microscope laser verticale de numérisation et de la préparation superfuse rétine en permanence (pas moins de 5 ml / min) avec la solution extracellulaire carboxygenated chauffée à 35 ° C. Le microscope (également équipé d&#39;une caméra infrarouge sensible CCD) est situé sur un amortisseur de table de l&#39;air intérieur d&#39;une cage de Faraday pour la protection électronique. Couvrir la cage avec un rideau opaque pour maintenir la préparation dans l&#39;obscurité. Nous avons également l&#39;écran de la lumière à partir des écrans d&#39;ordinateur par un film transparent rouge. </li><li> Réglez le laser infrarouge pour 850-870 nm ou plus des longueurs d&#39;onde, de passer en mode verrouillage de l&#39;état et l&#39;utilisation excitation à deux photons pour visualiser exprimant la GFP cellules. Atténuer la sortie du laser à l&#39;aide de filtres de densité neutre contrôlé par le logiciel de numérisation laser, jusqu&#39;à un degré qui est juste suffisante pour une reconnaissance claire de la cellule fluorescente </li><li> Pour les enregistrements de patch-clamp dans le mode actuel micropipettes-clamp en verre (nous utilisons des tubes en verre borosilicate de 1,5 mm de diamètre extérieur et 0,225 mm d&#39;épaisseur) rempli avec une solution composée de intracellulaires (en mm) 125 K-gluconate, 10 KCl, 0,5 EGTA 10, HEPES, titrée à pH 7,4 avec KOH (donnant une résistance pipette d&#39;environ 5 MW). Notez que d&#39;autres conditions expérimentales comme la tension-clamp nécessite une solution différente. Si les injections de colorant sont désiré, ajouter une sonde fluorescente (nous utilisons 10 mM Alexa Fluor 594) ou une molécule traceur (3% Neurobiotin). Insérez la micropipette dans le support et s&#39;assurer que l&#39;électrode de référence (fil d&#39;argent chlorés) est en contact avec la solution extracellulaire dans la chambre d&#39;enregistrement. </li><li> Appliquer une pression à la micropipette et de cibler une cellule exprimant la GFP (nous utilisons un objectif de 40 fois l&#39;eau d&#39;immersion; NA 1,25). Corps cellulaires amacrines sont situés dans la couche des cellules ganglionnaires (directement sous la surface dans l&#39;orientation actuelle de la rétine) ainsi que dans la partie proximale de la couche nucléaire interne (environ 55 à 75 um profondément dans la préparation). Avant le contact avec la cellule micropipette ciblées, la membrane limitante interne (une gaine faite de cellules gliales endfeet) à la rétinesurface doit être pénétré. Pénétration réussie est reconnue par la solution intracellulaire qui est chassé de la pointe de micropipette et se détache de la membrane limitante interne de la rétine tissus sous-jacents que l&#39;on peut observer sur une image infrarouge en transmission capturée par la caméra IR-CCD. </li><li> Approche de la cellule souhaitée en comparant la position soma de l&#39;image à deux photons avec l&#39;image de la caméra IR-CCD montrant la position de la micropipette enregistrement. Notez que cette étape n&#39;est pas facile à réaliser et nécessite une certaine pratique, car la cellule exprimant la GFP doit être reconnu à l&#39;image de transmission infrarouge afin de diriger la micropipette vers elle. Ciblage correct est atteint lorsque la pointe micropipette causes de capitons de la surface cellulaire qui peut être vu dans l&#39;image à deux photons. Alternative à cette procédure, utilisez un colorant fluorescent (par exemple, Alexa Fluor 594, 100 pM) dans la solution intracellulaire de révéler la position micropipette dans l&#39;image à deux photons. Excitation à deux photons infrarouges permet de fluorescence suffisante de ce colorant pour rendre la micropipette perceptible. Pour ce faire, réglez la plage de détection du logiciel de numérisation laser pour couvrir également la fluorescence rouge. </li><li> Communiqué de la pression de la micropipette et obtenir une cellule entière de patch-clamp de configuration dans le courant-clamp mode. Un enregistrement exploitable devrait donner un potentiel de membrane de -50 à -55 mV et durer au moins 20 min. </li><li> Présent stimuli visuels créés par un logiciel de stimulation (nous utilisons QDS par Thomas d&#39;Euler, Université de Tübingen, Allemagne) 11 sur un écran d&#39;ordinateur. Ajustez la position spatiale de la stimulation à être centré sur la cellule enregistrés: Marquer la position de la cellule sur le moniteur montrant l&#39;image de transmission de la caméra IR-CCD et un centre de stimulation place, comme sur celle-ci. Tune l&#39;intensité du stimulus en insérant filtres de densité neutre dans le trajet du faisceau. Pour l&#39;étalonnage du spectre de surveiller et de l&#39;intensité voir réf [14]. Choisir un Prolonged interstimulus intervalle (par exemple 15 s) afin d&#39;éviter d&#39;adaptation. Inclure une photodiode dans le trajet du faisceau de garder une trace du timing de relance. </li><li> Démarrez le protocole de stimulation et d&#39;enregistrer les réponses de lumière (nous utilisons un taux d&#39;échantillonnage de 10 kHz avec un filtrage à 5 kHz pour les non-dopage cellules; pour l&#39;enregistrement de pic un taux plus élevé d&#39;échantillonnage de 20 kHz, comme il est recommandé). Utilisez le logiciel stimulation lumineuse pour déclencher le logiciel d&#39;enregistrement. </li><li> Pour le remplissage de colorant laisser le diffuse agent fluorescent dans la cellule enregistrée pendant 30-45 min avant attentivement rétractant la micropipette de la cellule. Prenez soin de ne pas sortir le corps de la cellule. Si le non-fluorescent traceur Neurobiotin a été utilisé, il doit la visualisation en se liant à la streptavidine conjuguée à un fluorophore (nous utilisons la streptavidine-Cy3, 1:400 pendant la nuit à 4 ° C après 20 min de fixation paraformaldéhyde de la rétine; pour le colorant de couplage Des études streptavidine incubation peut être prolongée à 3 d). Alternativement, les injections peuvent aussi être réalisées avecélectrodes forte (&gt; 100 MQ) lorsque le colorant est entraîné par iontophorèse dans la cellule empalé (impulsions rectangulaires: de 0,25 à 1 nA, 100 ms, l&#39;intervalle de 100 ms, temps total 3-6 min). </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Les résultats suivants proviennent d&#39;une étude sur les souris exprimant une protéine fluorescente verte (GFP) sous le promoteur de la tyrosine hydroxylase 13,14, l&#39;enzyme catalysant l&#39;étape limitante dans la synthèse des catécholamines (TH:: GFP souris). Basé sur la luminosité des deux signaux GFP-populations de cellules distinctes se distinguent (figure 2A). Les cellules exprimant le niveau supérieur GFP possèdent des corps cellulaires situés dans la couche nucléaire interne (INL, figure 2A) ou déplacées dans la couche des cellules ganglionnaires (GCL, figure 2B) et stratifier au milieu de la couche interne plexiforme (IPL, figure 2C) . Ils ont été identifiés comme des cellules de type 2 14-16 et pourraient être systématiquement étudiés par rapport à la morphologie (figure 3) et élireriques d&#39;activité (figure 4), même si sa densité de population ne s&#39;élève qu&#39;à 250 cellules / mm 2. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique du dispositif expérimental. Excitation à deux photons (rouge trajet de la lumière en pointillés) du fluorophore cellules exprimant dans la rétine intacte permet visuelle ciblage par une micropipette (chemin vert émission de lumière). La rétine est soumis à des stimuli optiques projetée à travers le condenseur du microscope (trajet de la lumière jaune), et les réponses cellulaires légers sont enregistrés. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> Figure 2. GFP cellules exprimant dans un flatmount rétinienne d&#39;un TH:: la souris GFP. Deux populations peuvent être distinguées par l&#39;éclat de la GFP-signal: le type 1 (cellules DA), situé à l&#39;INL montrant une faible fluorescence (A, voir flèches) et le type intensément marquées 2 cellulesavec les corps cellulaires, soit dans l&#39;INL (A, voir flèches) ou déplacées dans la GCL (B) et une stratification dendritiques dans la strate S3 de l&#39;IPL (C). Barres d&#39;échelle, 50 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> Figure 3. Morphologie d&#39;un type 2 de cellules injectées avec le Neurobiotin traceur. Le traceur est ensuite visualisé par streptavidine-Cy3 contraignant (magenta). La micrographie, qui est également représentant le signal GFP (green), est une projection de piles d&#39;images couvrant la GCL et l&#39;IPL. La barre d&#39;échelle, 50 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> Figure 4. Lumière des réponses d&#39;une cellule de type 2 situé dans le GCL. Modèle de réponse à la lumière blanche plein champ d&#39;illumination d&#39;intensité croissante dans la gamme scotopique. L&#39;intensité du stimulus est donné dans photoisomerizations par canne par seconde (Rh * / tige / s). Un stimulus prolongé de 3 s a été utilisé pour une meilleure distinctesions des éléments de réponse au début du stimulus (sur la réponse) et offset (OFF réponse).

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina.">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li></ol>

Les souris ont été traitées et euthanasiés conformément aux directives institutionnelles pour la protection des animaux et les lois sur l&#39;expérimentation animale délivré par le gouvernement allemand.

Cette méthode offre la possibilité d&#39;étudier les propriétés électriques des neurones spécifiques de la rétine intacte sous guidage visuel sans influencer la condition d&#39;adaptation de la rétine. Il est particulièrement adapté pour la caractérisation des cellules qui sont à présent assez mal étudiés en raison de la faible densité démographique, comme la plupart des populations de cellules amacrines. Excitation à deux photons permet l&#39;imagerie à haute résolution et haut contraste même de parties plus profondes du tissu 17, une condition préalable pour un ciblage précis et réussi le patch-clamp de cellules en particulier dans l&#39;INL avec sa forte densité de corps cellulaires. La rétine de souris isolé est viable pour les 3-4 h dans les conditions expérimentales. Si la rétine seconde est stocké dans l&#39;obscurité totale dans le gazage carbogène continue, il conserve la couleur pourpre du photopigment écrus et peut être utilisé après avoir terminé les expériences avec la rétine en premier. Au début, en ciblant lescellule sélectionnée à la micropipette dans la rétine wholemount est un peu difficile et requiert une certaine pratique, surtout quand on travaille dans l&#39;obscurité. Incluant un colorant fluorescent dans la micropipette peut simplifier la procédure, car la cellule et micropipette sont visibles sous excitation à deux photons dans le même temps. Toutefois, l&#39;ajout de composants de la solution intracellulaire peut entraver la formation ou de causer gigaseal la qualité d&#39;enregistrement à souffrir. Une fois réalisée avec succès, un bon enregistrement peut durer pendant environ 1 h. Alors que la lumière d&#39;excitation infrarouge lui-même est seulement mal absorbée par les photorécepteurs rétiniens, excité exprimant la GFP cellules émettent de la lumière dans la partie visible du spectre. Toutefois, les fluorophores sont excités seulement dans un petit volume focal qui n&#39;est pas susceptible de modifier la condition d&#39;adaptation de la rétine. D&#39;autant plus, l&#39;excitation est nécessaire seulement pour le ciblage et peut être désactivée pendant l&#39;enregistrement des réponses de lumière. Le usefulnESS de cette approche est déjà démontré par des études sur des populations spécifiques de cellules amacrines 14,18 à partir de laquelle des enregistrements électrophysiologiques, autrement, aurait été possible que par accident 12. Enfin, cette technique puissante peut encore être prolongée par une approche pharmacologique incluant 14, Ca 2 + imagerie 19 ou en utilisant des cellules injectées pour des études immunocytochimiques ou la microscopie électronique. De cette façon, la position fonctionnelle d&#39;un type cellulaire donné dans le circuit de la rétine peut être démêlé.

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactif / Equip-ment </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Lunettes de vision nocturne </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Allemagne </td><td> Xtron F1 </td><td> comprend une source de lumière à 800 nm </td></tr><tr><td> Filtre optique </td><td> Schott, Mayence, Allemagne </td><td> RG9 </td><td> longpass filtre avec coupure à 690 nm </td></tr><tr><td> Ciseaux Iris </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14061-09 </td><td> courbé avec lame 22 mm </td></tr><tr><td> Ciseaux de printemps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-00 </td><td> droite avec 3 lames mm </td></tr><tr><td> Chambre d&#39;enregistrement </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Allemagne </td><td> 200 à 100 500 0180 type A (TC) </td><td> Teflon chambre avec fond monté sur lamelle de verre (environ 0,15 mm, n ° 200-100 500 0182) </td></tr><tr><td> Chauffe-eau </td><td> Systèmes multicanaux, Reutlingen, Allemagne </td><td> PH01, TC01 </td><td> canule de perfusion chauffable avec la température scontrôleur de température et Ensor </td></tr><tr><td> Microscope à balayage laser </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM EPA </td><td> contrôlée par Leica Confocal Software </td></tr><tr><td> Air de table </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> Mode verrouillé tsunami Ti: saphir au laser </td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> BCP SA, Kelheim, Allemagne </td><td> PixelFly QE </td><td> y compris les logiciels de contrôle </td></tr><tr><td> Micropipette de verre capillaires </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Allemagne </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette extracteur </td><td> Instrument Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> colorant fluorescent </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> non fluorescent traceur </td></tr><tr><td> Streptavidine-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Allemagne </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> motorisée Mini25 unité de manipulateur avec affichage SM-5 </td></tr><tr><td> Amplificateur de patch-clamp </td><td> npi electronic GmbH, Tamm, Allemagne </td><td> SEC-05LX npi </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acquisition de données du logiciel WinWCP </td><td> John Dempster, Université de l&#39;Ecosse, Glasgow, Royaume-Uni </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> QDS générateur de stimulus visuel </td><td> Thomas Euler, Université de Tübingen, Allemagne </td><td></td><td> doit être exploité sur un ordinateur séparé la commande de 2 moniteurs (interface utilisateur, relance le moniteur) </td></tr><tr><td> Les filtres neutres </td><td> ITOS, Mainz, Allemagne </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

Étudier les propriétés physiologiques et les connexions synaptiques des neurones spécifiques dans le tissu intact est un défi pour les cellules qui manque flagrant caractéristiques morphologiques ou afficher une faible densité de population. Ceci s&#39;applique particulièrement aux cellules amacrines rétiniennes, une classe exceptionnelle multiformes des interneurones qui composent environ 30 sous-types de mammifères 1. Bien qu&#39;étant une partie cruciale de la transformation visuelle par la rétine façonner la sortie 2, la plupart de ces sous-types n&#39;ont pas été étudiés jusqu&#39;à présent, dans un contexte fonctionnel parce rencontrer ces cellules avec une électrode d&#39;enregistrement est un événement rare. Récemment, une multitude de lignées de souris transgéniques est disponible qui expriment des marqueurs fluorescents comme la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de promoteurs pour les récepteurs membranaires ou des enzymes qui sont spécifiques à un sous-ensemble de neurones dans un tissu donné 3,4. Ces cellules pré-étiquetés sont donc accessible à microélectrode dirigé ciblant sous contrôle microscopique, permettant l&#39;étude systématique de leurs propriétés physiologiques in situ. Cependant, l&#39;excitation des marqueurs fluorescents est accompagné par le risque de phototoxicité pour les tissus vivants. Dans la rétine, cette approche est entravé par le problème que la lumière d&#39;excitation provoque une stimulation appropriée des photorécepteurs, infligeant ainsi photopigment blanchiment et le transfert des circuits rétiniens dans un état de lumière adaptés. Ces inconvénients sont surmontés en utilisant une excitation à infrarouge livré par un mode bloqué au laser dans de courtes impulsions de la gamme femtoseconde. D&#39;excitation à deux photons fournit suffisamment d&#39;énergie pour l&#39;excitation fluorophore et dans le même temps restreint l&#39;excitation pour un volume de tissu de petites minimisant les risques d&#39;agression solaire 5. Aussi, il quitte la rétine sensible aux stimuli visuels depuis une lumière infrarouge (&gt; 850 nm) est seulement mal absorbé par photopigments 6. dans les enregistrements in situ à partir de cellules exprimant la GFP qui sont visuellement ciblés par excitation à deux photons. La rétine est préparé et maintenu dans l&#39;obscurité et peut être soumis à des stimuli optiques qui sont projetées par le condenseur du microscope (figure 1). Patch-clamp enregistrement des réponses de lumière peut être combiné avec de la teinture de remplissage pour révéler la morphologie et pour vérifier l&#39;écart de jonction à médiation colorant couplage à des cellules voisines, de sorte que la cellule cible peut par étudiés sur différents niveaux d&#39;expérimentation.

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Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Cet article décrit l&#39;enregistrement des cellules individuelles de fluorescence taggés populations neuronales dans la rétine de souris intactes. En utilisant deux photons d&#39;excitation infrarouge cellules transgenetically étiquetés ont été ciblés pour patch-clamp pour étudier leurs réponses lumière, les propriétés des champs réceptifs, et la morphologie.

Populations cellulaires Caractérisation électrophysiologique des exprimant la GFP dans la rétine intacte

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K vues.  University of Oldenburg. Cet article décrit l'enregistrement des cellules individuelles de fluorescence taggés populations neuronales dans la rétine de souris intactes. En utilisant deux photons d'excitation infrarouge cellules transgenetically étiquetés ont été ciblés pour patch-clamp pour étudier leurs réponses lumière, les propriétés des champs réceptifs, et la morphologie.

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Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Culture organotypique d&#39;exprimant la GFP embryons de souris pour les images en temps réel d&#39;excroissance des nerfs périphériques

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Intact Caractérisation histologique du cerveau Microdevices-implantées et les tissus environnants

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Enregistrement électrophysiologique dans le cerveau d&#39;Intact poisson zèbre adulte

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Évaluation de la régénération vasculaire dans le SNC Utilisation de la rétine de souris

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

Isolement des populations cellulaires distinctes du cervelet en développement par microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

En profondeur Physiological Analyse des populations de cellules définies dans le tissu Tranches aiguë de l&#39;Vomeronasal Organ Souris

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Préparation des horizontales Tranches de souris adultes Retina pour les études électrophysiologiques

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

In Vitro Caractérisation des propriétés électrophysiologiques des fibres afférentes du côlon chez le rat

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...