Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 a KD y RW). Damos las gracias a Thomas Euler (Töbingen, Alemania) para el software QDS luz estimulación.

La descripción siguiente se supone que el experimentador tiene una comprensión básica de la estructura de la retina, grabación de patch-clamp, y la microscopia de dos fotones. Para obtener información útil en el establecimiento y ejecución de una instalación de patch-clamp y dos fotones sistema de imagen ver Refs [7-12]. 1. Animales y preparación de tejidos <ol><li> Mantenga ratón adaptada a la oscuridad durante al menos 3 h. Mientras tanto, prepare 2.1 l de la solución extracelular formado por (en mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucosa y equilibrar a un pH de 7,4 por gaseamiento con carbogen (5% de CO 2 en O 2) a temperatura ambiente. </li> un <li> Practicar la eutanasia con el ratón en una cámara hermética de CO 2 sobredosis seguido por dislocación cervical. Este procedimiento y los pasos siguientes se deben realizar en la oscuridad. Use poca longitud de onda larga de iluminación (que bloquean longitudes de onda corta a partir de una fuente de luz fría por un 690 nm-longpass de filtro) para apoyar la visión personal, manteniendo los ojos del animal adaptado a la oscuridad (los ratones sólo tienen una visión pobre en la parte roja del espectro de luz). Para trabajar en la iluminación completa oscuridad el uso de infrarrojos (&gt; 800 nm) y el desgaste gafas de visión nocturna. </li><li> Ojos enucleación con un par de tijeras curvas iris y transferirlos a un plato de la solución extracelular colocado bajo un microscopio de disección. </li><li> Quitar la córnea y cuerpo ciliar mediante la apertura de la bombilla ojo a lo largo de la ora serrata (la frontera entre la retina y el cuerpo ciliar) con un par de tijeras de primavera (que utiliza por primera vez una lanceta para perforar un punto de partida para el corte). Sacar la lente y separar cuidadosamente la retina del epitelio pigmentario. Si la orientación de la retina es crucial para su estudio, indican que, como en la Ref. [12]. Cortar el nervio óptico entre la retina y el epitelio pigmentario de la retina y retirar de la ojera. Tenga en cuenta la dirección de las superficies de la retina: el interior de la retina enrollado es el Gangllado de iones de la célula, el exterior es el lado de los fotorreceptores. </li><li> Eliminar el vítreo de la superficie de la retina interna, tirando de él apagado con la ayuda de un palillo de madera. Para ello, utilice una pequeña cantidad de solución extracelular que sólo cubre la retina. Los palos del vítreo al palillo de dientes y pueden ser arrastrados por centrifugación de la retina. A continuación, aplicar incisiones pequeñas a lo largo del perímetro de la retina para facilitar el aplastamiento de los tejidos. </li><li> Transferencia de la retina en la cámara de grabación de los fotorreceptores hacia abajo, lo extendió sobre el fondo de cristal (se utiliza un pincel fino) e inmovilizarlo con un marco de nylon colgados de acero inoxidable. Prepare la retina segundo de la misma forma y mantenerlo adaptado a la oscuridad en la solución carboxygenated extracelular para su uso posterior. </li></ol> 2. Grabaciones <ol><li> Instale la cámara de grabación en la oscuridad con un microscopio láser de escaneo vertical y superfuse la preparación de retina en forma continua (no menos de 5 ml / min) con la solución extracelular carboxygenated calienta a 35 ° C. El microscopio (también equipado con una cámara sensible al infrarrojo CCD) se encuentra en un amortiguador de aire dentro de la tabla una jaula de Faraday para la protección electrónica. Cubrir la jaula con una cortina no transparente para mantener la preparación en la oscuridad. También fuera de la pantalla la luz de los monitores de ordenador por una película transparente de color rojo. </li><li> Ajustar el láser infrarrojo a 850-870 nm o más longitudes de onda, cambiar a modo bloqueado condición y uso de dos fotones de excitación para visualizar las células que expresan GFP. Atenuar la salida del láser utilizando filtros de densidad neutra controlado por el software de escaneo láser de hasta un grado que apenas es suficiente para el reconocimiento claro de la célula fluorescente </li><li> De patch-clamp grabaciones en micropipetas actual-clamp modo de uso de vidrio (que utilizan tubos de vidrio de borosilicato de 1,5 mm de diámetro exterior y espesor de pared de 0,225 mm) lleno de solución intracelular formado por (en mM) 125 K-gluconato, 10 de KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, pH a 7,4 con KOH (dando una resistencia pipeta de alrededor de 5 MW). Tenga en cuenta que otras condiciones experimentales como la grabación de voltaje-clamp requiere una solución diferente. Si las inyecciones de colorante se desea, agregue una sonda fluorescente (usamos 10 mM Alexa Fluor 594) o una molécula trazadora (3% Neurobiotin). Inserte la micropipeta en el soporte y asegúrese de que el electrodo de referencia (hilo de plata clorada) está en contacto con la solución extracelular en la cámara de grabación. </li><li> Aplique presión a la micropipeta y un objetivo que expresan GFP de células (se utiliza un objetivo de 40 veces el agua de inmersión; NA 1,25). Cuerpos de células amacrinas se encuentran en la capa de células ganglionares (justo debajo de la superficie en la orientación actual de la retina), así como en la parte proximal de la capa nuclear interna (alrededor de 55-75 micras de profundidad dentro de la preparación). Antes de ponerse en contacto con la micropipeta célula objetivo, la membrana limitante interna (una funda hecha de endfeet gliales) en la retinala superficie tiene que ser penetrado. Penetración exitosa es reconocido por la solución intracelular que es expulsado de la punta de la micropipeta y se desprende de la membrana limitante interna del tejido retiniano subyacente como puede observarse en una imagen de la transmisión por infrarrojos capturado por la cámara CCD-IR. </li><li> Acercarse a la celda deseada mediante la comparación de la posición de soma de la imagen de dos fotones con la imagen de la cámara CCD IR-que muestra la posición de la micropipeta de grabación. Tenga en cuenta que este paso no es fácil de lograr y requiere algo de práctica, porque las células que expresan GFP tiene que ser reconocido en la transmisión de imágenes por infrarrojos con el fin de dirigir la micropipeta hacia ella. Orientación correcta se consigue cuando la punta de la micropipeta provoca hundimientos en la superficie celular que se puede ver en la imagen de dos fotones. Alternativa a este procedimiento, utilice un colorante fluorescente (por ejemplo, Alexa Fluor 594, 100 mM) en la solución intracelular para revelar la posición micropipeta en la imagen de dos fotones. De excitación de dos fotones infrarrojos permite la fluorescencia suficiente de este medio de contraste para hacer que la micropipeta discernible. Para ello, ajuste el rango de detección del software de escaneo láser para abarcar también fluorescencia de color rojo. </li><li> Liberar la presión de la micropipeta y obtener un conjunto de células patch-clamp de configuración en modo de corriente-clamp. Una grabación utilizable debe dar un potencial de membrana de -50 a -55 mV y una duración de al menos 20 min. </li><li> Presentar estímulos visuales creado por un software de estimulación (usamos QDS por Thomas Euler, de la Universidad de Tübingen, Alemania), 11 en un monitor de computadora. Ajustar la posición espacial de la estimulación que se centra en la celda registrado: Marque la posición de la célula en el monitor muestra la imagen de la transmisión de la cámara IR-CCD y un centro de estímulo terreno como en la misma. Ajustar la intensidad del estímulo mediante la inserción de filtros de densidad neutra en la trayectoria del haz. Para la calibración del monitor de espectro y la intensidad de ver Ref. [14]. Elegir un Prolonged interestímulo intervalo (por ejemplo, 15 s) para evitar la adaptación. Incluyen un fotodiodo en la trayectoria del haz de llevar un registro de los tiempos de estímulo. </li><li> Iniciar el protocolo de estimulación y registrar las respuestas de la luz (se utiliza una frecuencia de muestreo de 10 kHz con el filtrado a 5 kHz para no clavar las células, para la grabación de pico de una frecuencia de muestreo 20 kHz más alto como se recomienda). Utilice el software de estimulación de la luz para activar el software de grabación. </li><li> Para el tinte de llenado permiten la difusión del agente fluorescente en las células registrado durante 30-45 minutos antes de la retracción de la micropipeta con cuidado de la célula. Tenga cuidado de no sacar el cuerpo de la célula. Si el marcador no fluorescente Neurobiotin fue utilizado, es necesario la visualización mediante la unión a la estreptavidina conjugada con un fluoróforo (usamos estreptavidina-Cy3, 1:400 durante la noche a 4 ° C después de 20 min paraformaldehído fijación de la retina, para el tinte de acoplamiento estudios de incubación estreptavidina se puede prolongar hasta 3 d). Por otra parte, las inyecciones también se puede realizar conelectrodos aguda (&gt; 100 MW) cuando el medio es conducido a la celda iontoforética empalado (pulsos rectangulares: 0,25-1 nA, 100 ms, el intervalo de 100 ms, el tiempo total 3-6 min). </li></ol> 3. Los resultados representativos: Los siguientes resultados proceden de un estudio de un ratón que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el promotor de la tirosina hidroxilasa 13,14, la enzima que cataliza el paso limitante en la síntesis de catecolaminas (TH:: GFP ratón). En función del brillo de la señal de las buenas prácticas agrarias y dos poblaciones de células diferenciadas se distinguen (Figura 2A). Las células que expresan el nivel de las buenas prácticas agrarias más alto poseen los cuerpos celulares situados en la capa nuclear interna (INL, Figura 2A) o desplazados en la capa de células ganglionares (GCL, Figura 2B) y estratificar en el centro de la capa plexiforme interna (IPL, Figura 2 C) . Fueron identificados como de tipo 2 células 14-16 y sistemática podría ser estudiados con respecto a la morfología (Figura 3) y elegiractividad Rical (Figura 4) a pesar de su densidad de población sólo llega a 250 células / mm 2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> Figura 1. Representación esquemática de la instalación experimental. Excitación de dos fotones (camino de luz roja punteada) de fluoróforo células que expresan en la retina intacta permite visual dirigidos por una micropipeta (emisión verde trayectoria de la luz). La retina es sometido a estímulos ópticos proyectados a través del condensador del microscopio (paso de luz amarilla), y la respuesta celular de luz se registran. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> Figura 2. GFP-células que expresan en un flatmount la retina de un TH:: GFP ratón. Dos poblaciones se pueden distinguir por el brillo de la señal de las buenas prácticas agrarias: tipo 1 (células DA), ubicado en el INL que presentan una fluorescencia débil (A, ver las puntas de flecha) y el tipo de intensidad que marca 2 célulascon cuerpos de las células, ya sea en el INL (A, ver las flechas) o desplazados en el GCL (B) y una estratificación dendríticas en el estrato S3 de la IPL (C). Las barras de escala, de 50 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> Figura 3. Morfología de un tipo 2 células inyectadas con la Neurobiotin marcador. El marcador fue posteriormente visualizadas por estreptavidina-Cy3 vinculante (magenta). La micrografía, que también se representa la señal de GFP (verde), es una proyección de imagen que cubre las pilas de la CGT y la IPL. Barra de escala, de 50 micras. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> Figura 4. La luz de las respuestas de tipo 2 celda ubicada en la GCL. Respuesta patrón de luz blanca todo el campo de iluminación de intensidad creciente en el rango de escotópica. La intensidad del estímulo se da en photoisomerizations por varilla por segundo (Rh * / barra / s). Un estímulo prolongado de 3 s se utiliza para mejorar distintosiones de los componentes de la respuesta al inicio del estímulo (respuesta en ON) y desplazamiento (OFF respuesta).

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Los ratones fueron manipulados y sacrificados de acuerdo con las directrices institucionales para el bienestar de los animales y las leyes sobre experimentos con animales emitidos por el gobierno alemán.

Este método ofrece la posibilidad de estudiar las propiedades eléctricas de neuronas específicas en la retina intacta bajo la guía visual, sin influir en el estado de adaptación de la retina. Es especialmente adecuado para la caracterización de las células que están en la actualidad en vez poco estudiada debido a la baja densidad de población como la mayoría de las poblaciones de células amacrinas. De dos fotones de excitación permite alta resolución y alto contraste de imagen, incluso de las partes más profundas del tejido 17, un requisito previo para mayor precisión y éxito de patch-clamp de células en particular en el INL con su alta densidad de los cuerpos celulares. La retina del ratón aislado es viable para 3-4 h en las condiciones experimentales. Si la retina segunda se almacena en la oscuridad bajo carbogen gas continua, mantiene el color púrpura de fotopigmento crudo y se puede utilizar después de terminar los experimentos con la retina en primer lugar. En un principio, el objetivocelda seleccionada con la micropipeta en el wholemount la retina es un poco difícil y requiere algo de práctica, especialmente cuando se trabaja en la oscuridad. Incluyendo un tinte fluorescente en la micropipeta se puede simplificar el procedimiento, porque las células y micropipeta son visibles bajo la excitación de dos fotones, al mismo tiempo. Sin embargo, la adición de componentes de la solución intracelular puede impedir la formación de gigaseal o hacer que la calidad de la grabación a sufrir. Una vez alcanzado con éxito, una buena grabación puede durar alrededor de 1 h. Mientras que la luz de excitación infrarroja es en sí mismo sólo absorbe poco por fotorreceptores de la retina, emocionado GFP-que expresan las células emiten luz en la parte visible del espectro. Sin embargo, fluoróforos están entusiasmados sólo en un pequeño volumen de actividad que no es probable que cambie la condición de adaptación de la retina. Aún más, la excitación sólo es necesario para la selección y puede ser apagado durante la grabación de las respuestas de la luz. El usefulnceso de este enfoque es que ya han demostrado estudios en poblaciones específicas de células amacrinas 14,18 de la cual los registros electrofisiológicos de lo contrario hubiera sido posible sólo por accidente 12. Por último, esta técnica de gran alcance se puede ampliar aún más mediante la inclusión de un enfoque farmacológico 14, Ca 2 + de imágenes de 19 o mediante el uso de las células inyectadas para los estudios de inmunohistoquímica o microscopía electrónica. De esta manera, la posición funcional de un tipo de célula en el circuito de la retina puede ser descifrado.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo / Equip-ción </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Gafas de visión nocturna </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Alemania </td><td> Xtron F1 </td><td> incluye una fuente de luz de 800 nm </td></tr><tr><td> Filtro óptico </td><td> Schott, Mainz, Alemania </td><td> RG9 </td><td> paso largo con filtro de corte de 690 nm </td></tr><tr><td> Iris tijeras </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14061-09 </td><td> curva con hoja de 22 mm </td></tr><tr><td> Primavera tijeras </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15000-00 </td><td> recta con hoja de 3 mm </td></tr><tr><td> Grabación de la cámara </td><td> Luigs y Neumann GmbH, Ratingen, Alemania </td><td> 2-100 500 0180 tipo A (TC) </td><td> Teflon cámara con deslizamiento montada abajo cubierta de vidrio (aprox. 0,15 mm, N º 2-100 500 0182) </td></tr><tr><td> El flujo del calentador </td><td> Sistemas multicanal, Reutlingen, Alemania </td><td> PH01, TC01 </td><td> cánula de perfusión climatizada con la temperatura scontrolador de Ensor y la temperatura </td></tr><tr><td> Microscopio de barrido láser </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> controlados por Leica Confocal Software </td></tr><tr><td> Aire mesa </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Láser </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> En modo bloqueado tsunami Ti: zafiro láser </td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> pco AG, Kelheim, Alemania </td><td> PixelFly QE </td><td> incluyendo el software de control </td></tr><tr><td> Micropipeta capilares de vidrio </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Alemania </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta extractor </td><td> Sutter instrumento </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> colorante fluorescente </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> no fluorescente marcador </td></tr><tr><td> Estreptavidina-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs y Neumann GmbH, Ratingen, Alemania </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> motorizados Mini25 unidad manipulador con pantalla SM-5 </td></tr><tr><td> Patch-clamp amplificador </td><td> npi electronic GmbH, Tamm, Alemania </td><td> SEC-05LX npi </td><td></td></tr><tr><td> Digitalizador </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> De adquisición de datos de software WinWCP </td><td> John Dempster, de la Universidad de Escocia, Glasgow, Reino Unido </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> Visual QDS estímulo generador </td><td> Thomas Euler, de la Universidad de Tübingen, Alemania </td><td></td><td> tiene que ser operado en un equipo distinto el control de dos monitores (interfaz de usuario, el estímulo del monitor) </td></tr><tr><td> Filtros de densidad neutra </td><td> ITOS, Mainz, Alemania </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

El estudio de las propiedades fisiológicas y las conexiones sinápticas de neuronas específicas en el tejido intacto es un reto para las células que carecen de características morfológicas visibles, o mostrar una baja densidad de población. Esto se aplica particularmente a la retina las células amacrinas, una clase excepcional multiforme de las interneuronas que comprenden aproximadamente 30 subtipos de los mamíferos 1. A pesar de ser una parte crucial del procesamiento visual de la configuración de la salida de la retina 2, la mayoría de estos subtipos no se han estudiado hasta ahora en un contexto funcional, porque encontrar estas células con un electrodo de registro es un evento raro. Recientemente, una multitud de líneas de ratones transgénicos que expresan está disponible fluorescentes marcadores como la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de los promotores de los receptores de membrana o las enzimas que son específicas de sólo un subconjunto de neuronas en un determinado tejido 3,4. Estas células pre-etiquetados, por lo tanto accessible para microelectrodos dirigida dirigidos bajo control microscópico, lo que permite el estudio sistemático de sus propiedades fisiológicas in situ. Sin embargo, la excitación de los marcadores fluorescentes es acompañado por el riesgo de fototoxicidad para el tejido vivo. En la retina, este enfoque es además obstaculizada por el problema de que la luz de excitación causa una estimulación adecuada de los fotorreceptores, por lo tanto causando fotopigmento blanqueo y la transferencia de los circuitos de la retina en una condición de luz adaptadas. Estos inconvenientes se superan mediante el uso de la excitación por infrarrojos dictada por un modo bloqueado en pulsos cortos de láser de la gama de femtosegundo. De excitación de dos fotones proporciona la energía suficiente para la excitación fluoróforo y al mismo tiempo que restringe la excitación en un pequeño volumen de tejido minimizando los riesgos de daño solar 5. Además, deja en la retina sensible a los estímulos visuales ya que la luz infrarroja (&gt; 850 nm) sólo se absorbe mal por fotopigmentos 6. en las grabaciones in situ de las buenas prácticas agrarias-que expresan las células que son visualmente el blanco de dos fotones de excitación. La retina está preparado y mantenido en la oscuridad y pueden ser sometidos a estímulos ópticos que se proyectan a través del condensador del microscopio (Figura 1). Patch-clamp grabación de las respuestas de la luz puede ser combinado con un tinte de relleno para revelar la morfología y para comprobar si hay diferencias unión mediada tinte de acoplamiento a las células vecinas, de modo que la célula diana puede por estudiar en diferentes niveles de experimentación.

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Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Este artículo describe la grabación de las células individuales de marcado con fluorescencia poblaciones neuronales en la retina del ratón intacto. Mediante el uso de excitación de dos fotones infrarrojos células transgenetically etiquetado fueron objeto de grabación de patch-clamp para estudiar la luz de sus respuestas, las propiedades de campo receptivo, y la morfología.

Caracterización electrofisiológica de las buenas prácticas agrarias que expresan las poblaciones de células en la retina intacta

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K vistas.  University of Oldenburg. Este artículo describe la grabación de las células individuales de marcado con fluorescencia poblaciones neuronales en la retina del ratón intacto. Mediante el uso de excitación de dos fotones infrarrojos células transgenetically etiquetado fueron objeto de grabación de patch-clamp para estudiar la luz de sus respuestas, las propiedades de campo receptivo, y la morfología.

Video: Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Caracterización histológica de avería Microdevices Brain-implantado y el tejido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

El aislamiento de las poblaciones celulares distinto del cerebelo en desarrollo por Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

In Vitro Caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las fibras aferentes colónicas en ratas

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...