وقد أيد هذا المشروع من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (SNF 310030-127586/1 #).

1. حصاد القرص الفقرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الحصول على كامل طول ذيل الأبقار من مسلخ المحلية ، إذا كان ذلك ممكنا من دون وجود منذ الجلد من الجلد يزيد من فرصة للتلوث (الشكل رقم 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعداد كبيرة لوح التقطيع والتحضير المعقمة محطة العمل والأدوات في أعلى لوحة القطع (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مبلل تحت شاش معقم غطاء تدفق الصفحي العقيمة مع كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ تحتوي على 55mM سترات الصوديوم ووضعها في كل بئر من لوحة 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حوض وتمييع الحل 1:100 Betadine مع مياه الحنفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الذيل كله الأبقار في حوض يحتوي على 1 ٪ حل Betadine لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الذيل الجافة لفترة وجيزة مع شاش معقم ووضعه على محطة العمل العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية العضلات حول الذيل مع شفرة مشرط رقم 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم بعيدا أجزاء من الذيل والتي لا حاجة ، وعادة طرفي الذيل ، والتي تحتوي كبيرة نسبيا وصغيرة جداIVDs (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم مزيد من العضلات والأوتار حول IVD باستخدام شفرة مشرط رقم 10. حذار لا لقطع الحلقة الخارجية للأقراص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة الأمامي من IVD مع علامة الجلد الجراحية (هذه الخطوة اختيارية ، فإنه يساعد على تحديد مركز الدوران المحوري في مفاعل حيوي لدينا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد فقرة وIVD نقطة اتصال عن طريق تحريك الذيل برفق. يشعر الحدود بين IVD والعظام مع الجانب مملة من شفرة المشرط. وينبغي أن يكون في موقع الشق 1-2 ملم بعيدا من IVD نحو فقرة. أدلى مكان مخصص الصناعية حامل شفرة على موقع الشق (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويلتصق IVD فقرة التي يدق على رأس حامل شفرة مصنوعة خصيصا الصناعية (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر على الجانب الآخر من الاتصال IVD - فقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعزولة التفاف IVD بشاش معقم مبلل مع كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ تحتوي على 55mM سترات الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة عزل IVDs لعدد العينة المطلوب (عادة حوالي 6 يمكنيمكن حصادها مع القطر بين 10-20 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل نظام غسيل الطائرات (زيمر ، المؤتمر الوطني العراقي.) مع الحل رينغر Lactated العقيمة ، و5L الحقائب هي الحجم مفيدة (PBS العقيمة بدلا من محلول ملحي أو 0.9 ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد IVD مع ملقط غسيل والنفاثة كلا الجانبين من سطح endplate باستخدام زيمر Pulsavac النفاثة نظام غسيل (الشكل 1C). وينبغي أن أطلقوا النار على طائرة بندقية على سطح endplate بزاوية بين 30 -- 60 درجة لمدة 30S على كل جانب. (الشكلان 1 و 7) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع IVDs إلى لوحة 6 جيدا والتفاف مع شاش مبلل أثناء الغسيل طائرة عينة أخرى القرص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IVDs مستعدون للثقافة وأسفل الجهاز دفق التطبيقات (على سبيل المثال بقاء الخلية ، وتحميل الميكانيكية والثقافة الجهاز) (الشكل 1D). </li></ol> 2. ممثل النتائج ويمكن قياس نتائج ناجحة للحكم على إعداد القرص الفقرية تكون التجربة حيث نشر صغيرة الوزن الجزيئي صبغة الفلورسنت (مثل أحمر procion)مستعد كحل 1 ٪ في برنامج تلفزيوني 2. ثم يتم الاحتفاظ IVD مع ما لا يقل عن 100 مل من محلول الصبغة ، ويسمح بعد ذلك لنزع فتيل صبغة سلبية في IVD عن تورم تحت 24H الحرة. وIVD ومن ثم فلاش مجمدة في النيتروجين السائل واعادته الى درجة حرارة الغرفة والمجففة من خلال سلسلة من التحويلات الأسيتون (أول ما قبل تبريده في -80 درجة مئوية ، ثم -20 درجة مئوية ، ثم 4 درجات مئوية ، وأخيرا إلى درجة حرارة الغرفة ). ثم يمكن أن يكون جزءا لا يتجزأ من القرص في بولي ميثيل اكريليت (PMMA) وقطع مع شفرة حادة لانتاج 100 ميكرون سميكة المقاطع. ويمكن بعد ذلك أن ينظر إلى هذه المقاطع من قبل أي المجهر brightfield القياسية ولكن تفضيلي بواسطة استخدام المجهر مضان منذ procion الحمراء تنبعث مضان أحمر (الشكلان 5-6). وtrabeculi السطح العظمي تظهر نظيفة جدا بعد خطوة lavaging طائرة (الشكل 7). المعلمات من أجل ثقافة الجهاز الناجحة هي الأولى من غياب كل من وتلوث بقاء الخلية حافظ (الشكلان 8-9) ، وارتفاع القرصعموما &quot;وحدة القرص&quot; ، ويقاس مع المقاطع النسيجية وsafranin O / أخضر سريع وصمة عار أو Hematoxilin ماير 3. طورنا بروتوكولات وحدات الماكرو نشرت 4،5 في أماكن أخرى لصبغ الأنسجة الحية لفحص القرص وبقاء الخلية في 3d باستخدام مجهر المسح الضوئي والليزر مبائر عدة تلطيخ العيش / الميت (المسابر الجزيئية ، Invitrogen ، بازل ، سويسرا). علينا مواصلة تطوير ماكرو وروتينية لأداء الخلية الفرز الآلي لتقدير جدوى الخلية في النسيج 3D أو الناقلين 3D باستخدام منصة ImageJ المعاهد الوطنية للصحة و 4-6. وقد اقترحت بروتوكولات بديلة لتحديد الجدوى خلية من خلايا القرص بواسطة الهضم الأولية باستخدام الهضم متتابعة من المصفوفة خارج الخلية باستخدام pronase كولاجيناز واكتب 2 ثم إلى وصمة عار على تعليق الخلية 7. إصدار سابق من البروتوكول المعنية خطوة الحضانة في برنامج تلفزيوني يحتوي على عشر مرات أكثر تركيزا تركيز البنسلين / الستربتومايسين ل10min بعد الحصاد من الأقراص قبل هيئة مكعبlture. مع الطائرة خطوة غسل هذه الخطوة يصبح عفا عليها الزمن منذ هذه الخطوة يبدو مفيدا لأغراض زراعة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" /> الشكل 1 لمحة عامة عن الخطوات المنهجية لإعداد الأقراص الفقرية العصعصية البقري مع endplates سليمة وطبقة رقيقة (1 - 2mm و) من العظام. أ) عرض تخطيطي للقرص الفقرية (IVD) وممراتها الغذائية. ب) إجراء لقطع IVD مع تخصيص شفرة حامل والصناعية شفرة حادة. C) جت الخطوة غسيل عالية لضمان بقاء الخلية ، وتمكين تبادل المغذيات حفظ endplates و 1-2 ملم من العظم يعلق على كلا الجانبين. D) وأخيرا يمكن أن يكون المثقف في IVD في غرفة عينة من مفاعل حيوي أو استخدامها لأي تطبيق أسفل النهر. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" /> الشكل 2 TOP : طول الذيل البقري الطازج كامل (مثالي obtaINED ضمن 2-3 ساعات بعد الوفاة لضمان استمرارية ارتفاع الخلية. القاع : الأشعة السينية صورة ذيل الأبقار تتراوح اعمارهم بين 6 أشهر تبين وجود لوحات النمو (GP) ، ومركز التعظم الثانوي ، وبين endplates العظمية (EP) والهيئات فقرة (VB). <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" /> الشكل 3. وأدوات) لتشريح ذيل الأبقار تحت ظروف معقمة. ب) مخصص شفرة حامل لخفض التدريجي شرائح الحركي من الذيل البقري في العمل في حين خفض القرص الفقرية. C) الجانبية نظرا لتخصيص شفرة حامل بشفرة الصناعية القياسية (لوتز ، ألمانيا). <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" /> الشكل 4. رسم وصورة للذيل الأبقار بعد إزالة العضلات المحيطة بها والتي توضح مواقع الرباط الشق لقطع شرائح الحركي. وينبغي أن يكون جزئيا فقرة &quot;تصدع&quot; وايصاحب ال شفرة مصنوعة خصيصا مثالي 1-2 ملم بعيدا عن endplates الغضروفية لضمان كامل سطح العظام. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" /> الشكل 5. تظاهرة للتنظيف الفعال للخطوة قبل غسل النفاثة (A) وبعد (B). لاحظ السطوح النظيفة العظمي من قطاعات القرص الفقري بعد إجراء الرش. <img alt="الشكل 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" /> الشكل 6. الحرة تورم تجربة نشر الطازجة رفعه الأقراص الفقرية ذيل الأبقار (IVDs) ترك لمدة 24 ساعة في محلول 1 ٪ procion الحمراء ، مما يدل على تأثير الحصار عن لوحة النمو. IVD والأشعة السينية الرقمية نظرا لسهمي التي لا تزال تتضمن لوحة النمو ، وطبقة ثانية من العظام صورة المجهر الفلورسنت من خلال خفض السهمي العصعصية البقري يزدرع القرص الفقرية مع endplate الغضروفية العظمية وبعد 24H نشر مجانا. سباق الجائزة الكبرى : لوحة النمو ، 2ndry ثاني : مركز ثانوي من التحجر. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" /> الرقم 7. الحرة تورم تجربة الطازجة رفعه الأقراص الفقرية ذيل الأبقار (IVDs) ترك لمدة 24 ساعة في محلول 1 ٪ procion الحمراء ، مما يدل على تأثير العلاج التنظيف غسل طائرة. سميكة المقاطع السهمي (~ 100 ملم) من الأبقار IVDs رفعه مع لوحات ~ 1.5 mmthick نهاية العظمية التي خضعت الطائرة غسل المعالجة (يسار) الجانب السيطرة من دون علاج (يمين) النفاثة lavaged العلاج. مدخل يظهر نمط الرش ، التي كانت تستخدم من نظام إنضار الجرح زيمر 24H التجارب نشرها خالية من الأبقار explants القرص الفقرية في أحمر procion 1 ٪. <img alt="الشكل 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" /> الرقم 8. الصور الحية / الميت من اسقاطات مداخن التصوير مبائر (250μm) مأخوذة من بوفينه قطاعات القرص الفقرية أعدت مع هذا الأسلوب النفاثة غسل قيد تورم خالية من 0 و 14 يوما على التوالي لالنواة اللبية (NP) ، والحلقة الليفية الداخلية (IA) والخارجي الحلقة الليفية (OA). أخضر = الخلايا خلايا حية ملطخة AM بواسطة calcein (methylester الاسيتيل) ، خلايا الدم الحمراء = نواة الخلايا الميتة التي اتسخت بسبب إيثيديوم homodimer - 1. <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" /> الرقم 9. بقاء الخلية من الأقراص الفقرية باستخدام الليزر مبائر المجهر على الأنسجة الحية و3D مسح المكدس. بقاء الخلية من النواة اللبية (NP) والتليف الحلقة (بالعربية) على مدى 21 يوما في إطار ثقافة حرة تورم الشرط. (متوسط ​​± SEM ، ن = 6) تم اختبار الفروق الإحصائية باستخدام غير المعلمية ، كروسكال واليس وقعت رتبة اختبار مبلغ بين الجماعات. تم العثور على اختلافات كبيرة بين يوم 21 و جميع النقاط مرة أخرى في NP. بينما في الخلافات AF كبيرة تم العثور على ما بين 7 إلى اليوماليوم 0. (* ع &lt;0.05 ** ، ع &lt;0.01).

<ol>
	<li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc:+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies.">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li><li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells:+a+feasibility+study+using+organ+culture.">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li><li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion.">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li><li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-J&#252;nger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+protocols+for+live/dead+staining+in+three-dimensional+carriers.">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li><li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds.">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc/endplate+culture+model:+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system.">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li><li>Gantenbein, B., Gr&#252;nhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates:+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs.">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li><li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent.">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li><li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology.">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li><li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential.">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

الخطوة الأولى للثقافة الجهاز الناجح هو للتأكد من أنه لا ينبغي أن تكون ملوثة يزدرع. وينبغي أن البشرة الذيل قبل البدء لهذا الإجراء. يمكن لأي وبر جلبت الى مختبر معقم يكون إشكاليا من حيث التلوث. وينبغي أن يكون الذيل البقري الطازج مثالي ممكن (وهذا يؤثر على بقاء الخلية الأو?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td colspan="4"> الأبقار الطازجة الأنسجة القرص الفقرية من ذيول البقر ، من المسلخ المحلي (مثالي في غضون ساعات بعد الوفاة وبدون الجلد). </td></tr><tr><td> Pulsavac بلاس نظام AC </td><td> زيمر المؤتمر الوطني العراقي. وسويسرا </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> أفضل أداء مع رئيس الهيب مع الرش وتزويد طاقة التيار المتناوب (واحد مع حزمة بطارية AA 8 لا يعمل أيضا ولكنها أقل ملاءمة) </td></tr><tr><td> القدرات العالية فان الرذاذ ث / درع سبلاش ، وطول 12.7cm </td><td> زيمر المؤتمر الوطني العراقي. وسويسرا </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> نحن اختبار هناك العديد من رؤساء الرش المتاحة ، وهذا واحد بنجاح </td></tr><tr><td> شفرات المشرط # 22 و # 10 </td><td> سوان ، مورتعلى وانكلترا </td><td> # 10 : 0201 # 22 : 0208 </td><td></td></tr><tr><td> مشرط حامل شفرة # # 3 و 4 </td><td> هوسمان ، ألمانيا </td><td> # 3 : 06.103.00 # 4 : 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> لوتز الصناعية شفرة </td><td> لوتز ، ألمانيا </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) </td><td> Invitrogen ، سويسرا </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM) </td><td> Gibco ، سويسرا </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated محلول رينغر (بدون سكر) </td><td> Bichsel ، سويسرا </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6 جيدا متعددة كذلك لوحة </td><td> TPP ، سويسرا </td><td> 92006 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine الحل </td><td> Mundipharma ، سويسرا </tد&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> الجلد الجراحية علامة </td><td> Porex الجراحية ، سويسرا </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> قطع كبيرة متنها </td><td></td><td></td><td> أي نوع من الممكن </td></tr></tbody></table>

preparation of intact bovine tail intervertebral discs for organ culture

القرص بين الفقرات (IVD) هو مشترك في العمود الفقري لربط فقرة فقرة. وهو يعمل على إحالة التحميل للعمود الفقري واعطاء المرونة للعمود الفقري. انه يؤلف من ثلاث مقصورات : النواة اللبية الأعمق (NP) التي تضم الحلقة الليفية (AF) ، واثنين endplates غضروفية تربط NP وAF الفقري للجسم على كلا الجانبين. وقد تم تحديد الألم قرصي المنشأ الذي ربما حدث بسبب الأمراض التنكسية القرص الفقرية (DDD) وفتوق القرص باعتباره مشكلة رئيسية في مجتمعنا الحديث. لدراسة الآليات الممكنة للانحطاط IVD ، في نظم المختبر مع خلايا الجهاز الثقافة قرص العيش وجذابة للغاية. تقدمت في المختبر من ثقافة سليمة IVDs العصعصية الأبقار إلى نظام النموذجية ذات الصلة ، والتي تسمح بدراسة الجوانب البيولوجية mechano في بيئة جيدة للرقابة الفسيولوجية والميكانيكية. ويمكن الحصول على IVDs ذيل الأبقار سهلة نسبيا في ارتفاع أعداد anد متشابهة الى حد بعيد في IVDs القطني الإنسان فيما يتعلق كثافة الخلية ، والسكان ، وأبعاد الخلية. ومع ذلك ، فشلت البقري الذيلية السابقة تقنيات حصاد IVD الاحتفاظ endplates الغضروفية العظمية وendplates بعد 1-2 أيام من الثقافة منذ سدت الواضح مسارات التغذية عن طريق الدم متخدر. IVDs هي أكبر الأجهزة اوعائي ، وبالتالي ، فإن المواد الغذائية إلى الخلايا في NP تعتمد فقط على نشر عبر البراعم الشعرية من جسم الفقري المتاخمة لها. يمكن وجود حطام العظام والدم المتجلط على السطوح endplate تعرقل نشر المواد الغذائية في مركز القرص وسطا بقاء الخلية. أنشئت مجموعتنا بروتوكول سريع نسبيا &quot;الكراك&quot; التدريجي للIVDs من الذيل مع مخاطر منخفضة للتلوث. ونحن قادرون على permeabilize وطازجة وقطع الأسطح endplate العظمية باستخدام طائرة غسيل جراحية النظام ، الذي يزيل الجلطات الدموية والحطام وقطع بكفاءة عالية تعيد فتح ممر نشر التغذيةللوسط IVD. وجود لوحات النمو على جانبي العمود الفقري والعظام التي ينبغي تجنبها ، ويمكن إزالتها قبل الثقافة. في هذا الفيديو ، ونحن الخطوط العريضة للخطوات حاسمة خلال إعداد وشرح المفتاح لنجاح الجهاز ثقافة الحفاظ على سلامة الخلية عالية لمدة 14 يوما في ظل ثقافة تورم الحرة. ويمكن تمديد الوقت الذي يمكن فيه ثقافة الحفاظ على البيئة المناسبة الميكانيكية باستخدام مفاعل حيوي ميكانيكية التحميل. ويمكن تمديد هذه التقنية أثبتت هنا لأنواع الحيوانات الأخرى مثل الخنزير والأغنام والعزلة جذامي IVD الذيلية والقطنية.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture at JoVE.com

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

يوضح هذا البروتوكول تقنية حصاد للأقراص الفقرية العصعصية البقري للثقافة الجهاز لل<em&gt; في المختبر</em&gt; الجهاز الثقافة.

إعداد أقراص سليمة الذيل البقري الفقرية للثقافة الجهاز

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting  vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give  ...

preparation-intact-bovine-tail-intervertebral-discs-for-organ

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K Views.  University of Bern. يوضح هذا البروتوكول تقنية حصاد للأقراص الفقرية العصعصية البقري للثقافة الجهاز لل في المختبر الجهاز الثقافة.

Video: Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

ألجينات الهلاميات المائية للثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد من المبيضين وناقلة البيضات

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

إعداد الفايبرين 3D السقالات لتطبيقات الجذعية زراعة الخلايا

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

عينة استراتيجيات التحضير للتصوير الطيف الكتلي لل3D الثقافة خلية نماذج

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

دراسة رياضيات الكيمياء من البشرة عامل نمو مستقبلات في الخلايا السليمة باستخدام الميكروسكوب المتلازم

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

تلفيق والتحقق من صحة نظام الجهاز على رقاقة مع أقطاب متكاملة لقياس المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال مباشرة

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Fragility Assessment of Bovine Cortical Bone Using Scratch Tests

Bone is a complex hierarchical material with five distinct levels of organization. Factors like aging and diseases like osteoporosis increase the fragility of bone, making it fracture-prone. Owing to the large socio-economic impact of bone fracture in our society, there is a need for novel ways to assess the mechanical performance of each hierarchical level of bone. Although stiffness and strength can be probed at all scales &#8211; nano-, micro-, meso-, and macroscopic &#8211; fracture assessment has so far been confined to macroscopic testing. This limitation restricts our understanding of bone fracture and constrains the scope of laboratory and clinical studies. In this research, we investigate the fracture resistance of bone from the microscopic to the mesoscopic length scales using micro scratch tests combined with nonlinear fracture mechanics. The tests are performed in the short longitudinal orientation on bovine cortical bone specimens. A meticulous experimental protocol is developed and a large number (102) of tests are conducted to assess the fracture toughness of cortical bone specimens while accounting for the heterogeneity associated with bone microstructure.

This study assesses the fracture toughness of bovine cortical bone at the sub-meso levels using microscopic scratch tests. This is an original, objective, rigorous, and reproducible method proposed to probe fracture toughness below the macroscopic scale. Potential applications are studying changes in bone fragility due to diseases like osteoporosis.

تقييم هشاشة العظام القشرية الأبقار باستخدام اختبارات الصفر

Bone is a complex hierarchical material with five distinct levels of organization. Factors like aging and diseases like osteoporosis increase the ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

تصنيع قابلة المط ومزدوجة القناة، رقائق موائع جزيئية الجهاز

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and medical intervention in rural environments and military medicine applications where ophthalmic care is not readily available. Untreated injuries are susceptible to infection after the eye has lost its watertight seal, as well as loss of tissue viability due to intraocular hypotension. Therapeutics to temporarily seal open globe injuries, if properly developed, may be able to restore intraocular pressure and prevent infection until proper ophthalmic care is possible. To facilitate product development, detailed here is the use of an anterior segment organ culture open globe injury platform for tracking therapeutic performance for at least 72 h post-injury. Porcine anterior segment tissue can be maintained in custom-designed organ culture dishes and held at physiological intraocular pressure. Puncture injuries can be created with a pneumatic-powered system capable of generating injury sizes up to 4.5 mm in diameter, similar to military-relevant injury sizes. Loss of intraocular pressure can be observed for 72 h post-injury confirming proper injury induction and loss of the eye&#39;s watertight seal. Therapeutic performance can be tracked by application to the eye after injury induction and then tracking intraocular pressure for multiple days. Further, the anterior segment injury model is applicable to widely used methods for functionally and biologically tracking anterior segment physiology, such as assessing transparency, ocular mechanics, corneal epithelium health, and tissue viability. Overall, the method described here is a necessary next step toward developing biomaterial therapeutics for temporarily sealing open globe injuries when ophthalmic care is not readily available.

Open globe eye injuries may go untreated for multiple days in rural or military-relevant scenarios, resulting in blindness. Therapeutics are needed to minimize loss of vision. Here, we detail an organ culture open globe injury model. With this model, potential therapeutics for stabilizing these injuries can be properly evaluated.

الجزء الأمامي منصة ثقافة الجهاز لتتبع إصابات الكرة الأرضية المفتوحة والأداء العلاجي

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional (3D) structures. One of the main functions of epithelia is the formation of barriers that protect the underlining tissues against physical and chemical insults and infectious agents. In addition, epithelia mediate the transport of nutrients, hormones, and other signaling molecules, often creating biochemical gradients that guide cell positioning and compartmentalization within the organ. Owing to their central role in determining organ-structure and function, epithelia are important therapeutic targets for many human diseases that are not always captured by animal models. Besides the obvious species-to-species differences, conducting research studies on barrier function and transport properties of epithelia in animals is further compounded by the difficulty of accessing these tissues in a living system. While two-dimensional (2D) human cell cultures are useful for answering basic scientific questions, they often yield poor in vivo predictions. To overcome these limitations, in the last decade, a plethora of micro-engineered biomimetic platforms, known as organs-on-a-chip, have emerged as a promising alternative to traditional in vitro and animal testing. Here, we describe an Open-Top Organ-Chip (or Open-Top Chip), a platform designed for modeling organ-specific epithelial tissues, including skin, lungs, and the intestines. This chip offers new opportunities for reconstituting the multicellular architecture and function of epithelial tissues, including the capability to recreate a 3D stromal component by incorporating tissue-specific fibroblasts and endothelial cells within a mechanically active system. This Open-Top Chip provides an unprecedented tool for studying epithelial/mesenchymal and vascular interactions at multiple scales of resolution, from single cells to multi-layer tissue constructs, thus allowing molecular dissection of the intercellular crosstalk of epithelialized organs in health and disease.

The present protocol describes the capabilities and the essential culture modalities of the Open-Top Organ-Chip for the successful establishment and maturation of full-thickness organ-on-chip cultures of primary tissues (skin, alveolus, airway, and intestine), providing the opportunity to investigate different functional aspects of the human epithelial/mesenchymal and vascular niche interface in vitro.

إعادة تشكيل العمارة الخلوية ووظيفة الأنسجة الظهارية البشرية على رقاقة عضو مفتوحة

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...