이 프로젝트는 스위스 국립 과학 재단 (SNF # 310030-127586/1)에 의해 지원되었다.

1. 척추 디스크 착취 <ol><li> 피부의 존재가 오염의 가능성 (그림 2) 증가 이후 전체 길이 소 꼬리는 피부없이 가능한 경우, 로컬 도살장에서 얻은 것입니다. </li><li> 대형 절단 보드를 준비하고 도마 (그림 2)의 상단에 살균 작업 스테이션과 악기를 준비합니다. </li><li> 멸균 층류 후드 멸균 거즈 아래의 준비는 55mM 나트륨 구연산을 포함하는 0.9 %의 나트륨 염화물과 moistened과 6 잘 플레이트의 각 우물에 넣어. </li><li> 분지를 준비하고 수돗물로 1:100 Betadine 솔루션을 희석. </li><li> 5 분 1 % Betadine 솔루션을 포함 분지 전체 소 꼬리 젖어. </li><li> 간단히 건조 멸균 거즈와 꼬리 및 살균 작업 스테이션에 배치하십시오. </li><li> 조심스럽게 메스 블레이드 # 22 꼬리 주위 근육을 제거합니다. </li><li> 필요하지 않다 꼬리 부분, 비교적 크고 아주 작은 포함된 꼬리 일반적으로 양쪽을 잘라 거리IVDs (그림 3). </li><li> 메스 블레이드 # 10을 사용하여 IVD 주위 더욱 근육과 힘줄을 낸다. 디스크의 바깥 고리를 잘라하지 조심. </li><li> 외과 피부 마커와 IVD의 앞쪽에 표시 (이 단계는 선택 사항입니다, 우리의 생물 반응기의 축 회전의 중심을 결정하는 데 도움). </li><li> 부드럽게 꼬리를 이동하여 IVD와 척추의 연결 지점을 찾습니다. 메스 블레이드의 지루한 면을 IVD와 뼈 사이의 국경을 느낍니다. cleaving 사이트는 척추쪽으로 IVD의 거리 1-2mm해야합니다. 장소 지정이 cleaving 사이트 (그림 4)에서 산업 블레이드 홀더했다. </li><li> 사용자 정의 - 만든 산업 블레이드 홀더 (그림 3)의 위에 망치질로 다니엘 IVD 및 척추골. </li><li> IVD - 척추골 연결의 반대편에 반복합니다. </li><li> 랩은 55mM 나트륨 구연산을 포함하는 0.9 %의 나트륨 염화물과 moistened 멸균 거즈로 IVD 격리. </li><li> 원하는 샘플 숫자 (보통 6 주변 수있는 IVDs의 절연을 계속) 10-20mm 사이의 직경이 수확됩니다. </li><li> 멸균 Lactated 울리는의 솔루션으로 제트 세척 시스템 (짐머, INC.) 연결, 5L 가방 (또는 멸균 PBS 또는 0.9 % 생리 식염수) 유용한 사이즈입니다. </li><li> 짐머 Pulsavac 제트 세척 시스템 (그림 1C)을 사용 포셉 및 endplate 표면의 제트 세척 양측으로 IVD 잡아. 제트 총 30 사이의 각도로 endplate 표면에 주사한다 - 60 °의 각 면에 약 30 초. (Figs. 1, 7) </li><li> 제트기가 다른 디스크 샘플을 세척하는 동안 6 잘 플레이트와 포장에 다시 IVDs 올려 것은 거즈를 moistened. </li><li> IVDs는 장기 문화와 다운 스트림 응용 프로그램 (예 : 세포 생존 능력, 기계 로딩, 장기 문화) (그림의 1D)에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2. 대표 결과 성공적인 척추 디스크 준비를 판단하는 성과 측정 확산 실험을 할 수있는 작은 분자량 형광 염료 (예 : procion 빨간색)PBS 2 1 %의 솔루션으로 준비가되어 있습니다. IVD 그러면 최소한 100 염료 솔루션의 ML과 염료가 다음 자유 팽창에 따라 24 시간을위한 IVD에 수동적으로 확산하기 위해 허용과 함께 보관됩니다. IVD 다음 액체 질소 플래시 - 냉동 및 객실 온도와 아세톤 전송 시리즈 (첫번째 -80에 ° 다음 C, -20 ° C, 후 4 ° C 마침내 실온에 미리 냉각에 의한 탈수로 다시 데려 ). 디스크 다음 폴리 - 메틸 아크릴 레이트 (PMMA)에 포함된 및 100 μm의 두께 섹션을 생산하기 위해 날카로운 칼날로자를 수 있습니다. 이 섹션은 다음 표준 brightfield 현미경으로하지만, 우선적으로 procion 빨간색은 빨간색 형광 (Figs. 5-6)를 방출 이후 형광 현미경의 사용으로 볼 수 있습니다. 뼈다귀 표면 trabeculi은 제트 lavaging 단계 (그림 7) 후 매우 깨끗하게 나타납니다. 성공적인 장기 문화에 대한 매개 변수 오염, 유지 세포 생존의 모든 부재 (Figs. 8-9), 디스크 높이의 첫 번째이며,histological 섹션 및 safranin O / 빠른 그린 얼룩이나 마이어의 Hematoxilin 3 측정 전체 &quot;디스크 무결성&quot;. 우리는 살아 디스크 조직을 얼룩과 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 및 라이브 / 죽은 얼룩 키트 (분자 프로브, Invitrogen, 바젤, 스위스)를 사용하여 3D에서 세포 생존 능력을 검사하는 다른 4,5 출판 프로토콜 및 매크로를 개발했습니다. 우리는 더 이상 3D 조직이나 NIH ImageJ 플랫폼 4-6을 사용하여 3D 통신사 셀 가능성을 추정 계산 자동 세포를 수행하기 위해 매크로와 루틴을 개발했습니다. 대체 프로토콜 pronase 및 collagenase 형식을 사용하여 세포외 기질의 연속 소화를 사용하여 초기 소화하여 디스크 세포의 세포 생존을 결정하는 2 다음 세포 현탁액 7 얼룩이 제안되었습니다. 프로토콜의 이전 버전은 PBS 전에 디스크의 수확 기관 세제곱 후 10 분에 대한 열 배는 더 집중 페니실린 / 스트렙토 마이신 농도를 포함에 인큐베이션 단계를 참여lture. 이 단계 culturing을 위해 도움이 것 때문에 제트 세척 단계이 단계는 쓸모됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" /> 그림 1. 방법론 단계의 개요 그대로 endplates와 뼈의 얇은 레이어 (1-2밀리미터)와 소 coccygeal 척추 디스크를 준비합니다. 척추 디스크 (IVD) 및 영양 경로의) 도식보기. B) 절차 블레이드 - 홀더 정의와 산업 날카로운 칼날로 IVD을 했구요. C) 제트 세척 단계 높은 세포 생존을 보장하고 endplates와 양쪽에 부착 뼈 1-2하셔야 지키는 영양 교환을 활성화합니다. D) 마지막 IVD은 생물 반응기의 표본 챔버에서 교양 수 있습니다 또는 다운 스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" /> 그림 2 TOP :. 전체 길이 신선한 소 꼬리 (이상 obta높은 세포 생존을 보장하기 위해 사후 2-3시간 이내 ined. 하단 : 뼈다귀 endplates (EP)과 척추 단체 (VB) 사이의 성장 플레이트 (GP), 골화의 보조 중심의 존재를 보여주는 육개월 주변의 세 소 꼬리 X - 선 이미지. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" /> 그림 3.) 도구 무균 조건 하에서 소 꼬리를 해부하다 있습니다. B) 맞춤형 블레이드 - 홀더에 척추 디스크를 깎다가 행동에 소 꼬리에서 운동의 세그먼트 아웃 컷. 표준 산업 블레이드 (Lutz, 독일)와 블레이드 홀더 - 사용자 정의의 C) 측면 - 볼 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" /> 그림 4. 그리기와 운동의 세그먼트를 잘라 cleaving 사이트를 설명하는 주변 근육과 인대를 제거 후 소 꼬리 그림. 부분 척추골은 WI를 &quot;금이&quot;이어야합니다사용자 정의 만든 블레이드 홀더 회 이상 1~2mm 떨어진 연골 endplates에서 전체 뼈 표면을 보장합니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" /> 그림 5. 전에 제트 세척 단계의 효과적인 세척의 데모 (A)과 후 (B). 분사 절차 후 척추 디스크 세그먼트의 깨끗한 뼈다귀 표면을 확인할 수 있습니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" /> 그림 6. 성장 판으로 차단 효과를 보여주는 1 % procion 빨간색 용액에 24 시간 남은 신선한 excised 소 꼬리 척추 디스크 (IVDs)의 자유 팽창 확산 실험. 의 디지털 X - 레이 화살보기 2 후에도 연골과 뼈가 endplate와 coccygeal 소 척추​​ 디스크 explant 통해 성장 판과 화살 컷의 뼈 형광 현미경 이미지의 두 번째 레이어를 포함한 IVD4h 무료로 확산. GP : 성장 플레이트, 2ndry CO : 골화 중심의 보조. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" /> 그림 7. 1 % procion 빨간색 용액에 24 시간 남은 신선한 excised 소 꼬리 척추 디스크 (IVDs)의 자유 팽창 실험, 제트 세척 치료의 효과를 보여주는 청소. 치료 (오른쪽) 제트 lavaged 치료하지 않고 제트 세척 치료 (왼쪽) 제어 측면을 받았습니다 ~ 1.5 mmthick 뼈다귀 엔드 플레이트와 excised 소 IVDs의 화살 굵은 부분 (~ 100mm). 입구는 스프레이 짐머 상처 debridement 시스템에서 사용되던 패턴 1 % procion의 빨간색으로 소 척추​​ 디스크 explants의 24 시간 무료로 확산 실험.을 보여줍니다 <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" /> 그림 8. 공촛점 이미징 스택의 예측의 라이브 / 죽은 이미지 (250μm) bovin에서 촬영한E 척추 디스크 세그먼트는 핵 pulposus (NP), 내부 고리를 fibrosus (IA)과 바깥 고리 fibrosus (OA)에 각각 0, 14 일 무료 팽창에 따라 보관이 제트 세척 방법으로 준비했습니다. ethidium homodimer - 1에 의해 스테인드 calcein AM (아세틸 methylester)에 의해 스테인드 = 라이브 세포, 붉은 세포가 = 죽은 세포의 핵 그린 세포. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" /> 그림 9. 살아있는 조직을 3 차원 스택 검사에 대한 현미경을 검색 공촛점 레이저를 사용하여 척추 디스크의 세포 생존 능력. 자유 팽창 상태에서 21 일 문화를 통해 본질 Pulposus (NP)와 고리 섬유증 (AF)의 세포 생존 능력. (± SEM, N = 6 평균) 통계 차이가 아닌 파라메 트릭 Kruskal - 월리스는 그룹 간의 순위 합 테스트를 체결 사용하는 테스트되었습니다. 중요한 차이점은 21 일 NP 다른 모든 시간 지점 사이에 발견되었다. AF 중요한 차이점에 일 7 일 사이 찾을 수있는 동안일 0. (* P &lt;0.05, ** P &lt;0.01).

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	<li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc:+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies.">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li><li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells:+a+feasibility+study+using+organ+culture.">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li><li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion.">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li><li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-J&#252;nger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+protocols+for+live/dead+staining+in+three-dimensional+carriers.">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li><li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds.">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc/endplate+culture+model:+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system.">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li><li>Gantenbein, B., Gr&#252;nhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates:+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs.">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li><li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent.">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li><li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology.">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li><li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential.">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li></ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

성공적인 장기 문화에 대한 첫 번째 단계는 explant가 오염해서는 안됩니다 있는지 확인하는 것입니다. 당신이 절차를 시작하기 전에 꼬리는 피부해야합니다. 무균 실험실로 데려 모든 동물의 머리는 오염의 측면에서 문제가 될 수 있습니다. 소 꼬리가 이상 (이것은 초기 세포 생존에 영향을 미치는) 가능한 신선해야합니다. 또한 betadine의 세척 단계는 더욱 오염의 위험을 줄이기 위해 권장합니다. ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td colspan="4"> 지역 도축 하우스 (이상적으로 시간 사후 이내에 피부없이)에서 소 꼬리에서 신선한 소 척추​​ 디스크 조직. </td></tr><tr><td> Pulsavac 플러스 AC 시스템 </td><td> 짐머 INC., 스위스 </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> 힙합 스프레이 머리와 AC 전원 공급 장치와 함께 최고의 성능 (8 AA 배터리 팩이 하나도 작동하지만, 덜 편리 않습니다) </td></tr><tr><td> 고용량 팬 스프레이 W / 플래쉬 실드, 12.7cm 길이 </td><td> 짐머 INC., 스위스 </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> 사용 가능한 여러 가지 스프레이 헤드가 있습니다, 우리는 성공적으로이 테스트를 </td></tr><tr><td> 메스 블레이드 # 22 # 10 </td><td> 스완 - 모트영국에 </td><td> # 10 : 0201 # 22 : 0208 </td><td></td></tr><tr><td> 메스 블레이드 홀더 # 3와 # 4 </td><td> Hausmann, 독일 </td><td> # 3 : 06.103.00 # 4 : 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> Lutz 산업 블레이드 </td><td> Lutz, 독일 </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 식염수 (PBS)를 버퍼 </td><td> Invitrogen, 스위스 </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM) </td><td> Gibco, 스위스 </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated 울리는의 솔루션 (포도당 제외) </td><td> Bichsel, 스위스 </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 잘 멀티 잘 플레이트 </td><td> TPP, 스위스 </td><td> 92,006 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine 용액 </td><td> Mundipharma, 스위스 </tD&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> 외과 피부 마커 </td><td> Pore​​x 외과, 스위스 </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> 대형 절삭 보드 </td><td></td><td></td><td> 모든 브랜드는 가능합니다 </td></tr></tbody></table>

preparation of intact bovine tail intervertebral discs for organ culture

척추 디스크 (IVD)는 척추에 척추를 연결하는 척추 관절입니다. 그것은 척추의로드를 전송하고 척추에 유연성을주는 기능을 수행합니다. 그것은 세 가지 구획의 작성할 : 환대 fibrosus (AF), 그리고 양쪽의 척추 기관에 NP와 AF를 연결하는 두 연골 endplates에 의해 포함한 내면 핵의 pulposus (NP)를. 아마도 퇴행성 척추 디스크 질환 (DDD)와 디스크 herniations에 의한 Discogenic 고통은 우리의 현대 사회의 주요 문제로 확인되었습니다. IVD 변성 가능한 메커니즘을 연구하기 위해, 라이브 디스크 세포로 체외 장기 문화 시스템에서 매우 매력적입니다. 그대로 소 coccygeal IVDs의 체외 문화가 잘 제어 생리학 및 기계적 환경에서 메카 - 생물 학적 측면의 연구를 수있는 관련 모델 시스템으로 고급하고 있습니다. 소의 꼬리 IVDs가 높은 숫자를 비교적 쉽게 구할 수 있습니다D 세포 밀도, 세포 인구 및 크기와 관련하여 인간의 허리 IVDs 매우 유사합니다. 영양 경로가 명백하게 응고된 피가에 의해 차단된 이후 단, 연골이 endplates 및 뼈다귀 endplates을 유지 이전 소 꼬리 IVD 수확 기술 문화 1-2 일 후에 실패했습니다. IVDs 가장 큰 avascular 장기 있으며, 따라서 NP에있는 세포에 영양분은 인접 척추 신체에서 모세관 꽃봉오리를 통해 확산에 전적으로 의존하고 있습니다. endplate 표면에 뼈 파편과 응고된 피가의 존재는 디스크와 손상 세포 생존의 중심에 영양 보급을 저해 수 있습니다. 우리 그룹은 오염에 대한 낮은 위험 아웃 꼬리에서 IVDs을 &quot;균열&quot;에 비교적 빠른 프로토콜을 설립했습니다. 우리는 혈전 및 절단 부스러기를 제거하고 매우 효율적으로 영양 보급 경로를 다시 태어난다 수술 제트 세척 시스템을 사용하여 갓 컷 뼈다귀 endplate 표면을 permeabilize 수 있습니다IVD의 중심 있습니다. 척추 뼈 양쪽에 성장 플레이트의 존재는 피할 수 있으며, 문화 이전에 제거할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 준비 중에 중요한 단계를 설명합니다 무료 붓기 문화에 따라 14 일 동안 높은 세포 생존을 유지하는 성공적인 장기 문화의 열쇠를 보여줍니다. 문화 시간은 적절한 기계적 환경 기계 로딩 생물 반응기를 사용하여 유지 수있을 때 확장할 수 있습니다. 기술 여기서 보여주는 등 돼지의, 양의와 토끼 꼬리와 허리 IVD 격리와 같은 다른 동물 종으로 확장될 수 있습니다.

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Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

이 프로토콜은을 위해 장기 문화에 대한 coccygeal 소 척추​​ 디스크 수확 기술을 보여줍니다<em&gt; 체외에서</em&gt; 장기 문화.

조직 문화에 대한 손상 소의 꼬리 척추 디스크의 준비

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting  vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give  ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K 조회수.  University of Bern. 이 프로토콜은을 위해 장기 문화에 대한 coccygeal 소 척추​​ 디스크 수확 기술을 보여줍니다 체외에서 장기 문화.

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Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

연구

생체공학

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3 차원 세포 배양 모델의 질량 분석 이미징을위한 준비 전략 샘플

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

상호 현미경을 사용하여 본래 세포의 표피 성장 인자 수용체의 화학 양론을 공부

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Fragility Assessment of Bovine Cortical Bone Using Scratch Tests

Bone is a complex hierarchical material with five distinct levels of organization. Factors like aging and diseases like osteoporosis increase the fragility of bone, making it fracture-prone. Owing to the large socio-economic impact of bone fracture in our society, there is a need for novel ways to assess the mechanical performance of each hierarchical level of bone. Although stiffness and strength can be probed at all scales &#8211; nano-, micro-, meso-, and macroscopic &#8211; fracture assessment has so far been confined to macroscopic testing. This limitation restricts our understanding of bone fracture and constrains the scope of laboratory and clinical studies. In this research, we investigate the fracture resistance of bone from the microscopic to the mesoscopic length scales using micro scratch tests combined with nonlinear fracture mechanics. The tests are performed in the short longitudinal orientation on bovine cortical bone specimens. A meticulous experimental protocol is developed and a large number (102) of tests are conducted to assess the fracture toughness of cortical bone specimens while accounting for the heterogeneity associated with bone microstructure.

This study assesses the fracture toughness of bovine cortical bone at the sub-meso levels using microscopic scratch tests. This is an original, objective, rigorous, and reproducible method proposed to probe fracture toughness below the macroscopic scale. Potential applications are studying changes in bone fragility due to diseases like osteoporosis.

스크래치 테스트를 사용 하 여 소 피 질 골의 취약성 평가

Bone is a complex hierarchical material with five distinct levels of organization. Factors like aging and diseases like osteoporosis increase the ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Stretchable, 듀얼 채널, 미세 기관 칩의 확장 가능한 제작

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and medical intervention in rural environments and military medicine applications where ophthalmic care is not readily available. Untreated injuries are susceptible to infection after the eye has lost its watertight seal, as well as loss of tissue viability due to intraocular hypotension. Therapeutics to temporarily seal open globe injuries, if properly developed, may be able to restore intraocular pressure and prevent infection until proper ophthalmic care is possible. To facilitate product development, detailed here is the use of an anterior segment organ culture open globe injury platform for tracking therapeutic performance for at least 72 h post-injury. Porcine anterior segment tissue can be maintained in custom-designed organ culture dishes and held at physiological intraocular pressure. Puncture injuries can be created with a pneumatic-powered system capable of generating injury sizes up to 4.5 mm in diameter, similar to military-relevant injury sizes. Loss of intraocular pressure can be observed for 72 h post-injury confirming proper injury induction and loss of the eye&#39;s watertight seal. Therapeutic performance can be tracked by application to the eye after injury induction and then tracking intraocular pressure for multiple days. Further, the anterior segment injury model is applicable to widely used methods for functionally and biologically tracking anterior segment physiology, such as assessing transparency, ocular mechanics, corneal epithelium health, and tissue viability. Overall, the method described here is a necessary next step toward developing biomaterial therapeutics for temporarily sealing open globe injuries when ophthalmic care is not readily available.

Open globe eye injuries may go untreated for multiple days in rural or military-relevant scenarios, resulting in blindness. Therapeutics are needed to minimize loss of vision. Here, we detail an organ culture open globe injury model. With this model, potential therapeutics for stabilizing these injuries can be properly evaluated.

오픈 글로브 부상 및 치료 성능을 추적하기위한 전방 세그먼트 장기 문화 플랫폼

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...

소 폐 ECM 하이드로겔에 대한 탈세포화 기법 비교 연구

Development and Characterization of Decellularized Lung Extracellular Matrix Hydrogels

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural environment in vitro. However, maintaining the native biochemical content of the ECM, achieving mechanical stability, and comprehending the impact of the decellularization process on the mechanical properties of the ECM hydrogels are challenging. Here, a pipeline for decellularization of bovine lung tissue using two different protocols, downstream characterization of the effectiveness of decellularization, fabrication of reconstituted decellularized lung ECM hydrogels and assessment of their mechanical and cytocompatibility properties were described. Decellularization of the bovine lung was pursued using a physical (freeze-thaw cycles) or chemical (detergent-based) method. Hematoxylin and Eosin staining was performed to validate the decellularization and retention of major ECM components. For the evaluation of residual collagen and sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content within the decellularized samples, Sirius red and Alcian blue staining techniques were employed, respectively. Mechanical properties of the decellularized lung ECM hydrogels were characterized by oscillatory rheology. The results suggest that decellularized bovine lung hydrogels can provide a reliable organotypic<span style="font-size: 11pt; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">&#160;alternative to commercial ECM products by retaining most native ECM components. Furthermore, these findings reveal that the decellularization method of choice significantly affects gelation kinetics as well as the stiffness and viscoelastic properties of resulting hydrogels.

저자 스포트라이트: 유기형 하이드로겔을 위한 소 폐 탈세포화 최적화

The protocol elucidates two distinct decellularization methodologies applied to native bovine pulmonary tissues, providing a comprehensive account of their respective characterizations.

탈세포화된 폐 세포외 기질 하이드로겔의 개발 및 특성 분석

The use of extracellular matrix (ECM)-derived hydrogels in tissue engineering has become increasingly popular, as they can mimic cells&#39; natural ...