פרויקט זה מומן על ידי הלאומית השוויצרית למדע (SNF # 310030-127586/1).

1. הדיסק הבין חולייתי קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זנב שור שלם באורך מתקבל שחיטה מקומית, אם אפשר בלי עור מאז הנוכחות של העור מעלה את הסיכוי לזיהום (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קרש חיתוך גדול להכין תחנת עבודה סטרילית המכשירים על גבי קרש חיתוך (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תחת מכסה המנוע גזה סטרילי זרימה למינרית סטרילי טבולה סודיום כלוריד 0.9% המכיל ציטרט הנתרן 55mm והכניסו גם בכל צלחת 6-הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אגן לדלל 1:100 פתרון בבטאדין עם מי ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את זנב שור שלם באגן המכיל פתרון בבטאדין 1% עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה הזנב יבש עם גזה סטרילית ולמקם אותו על תחנת עבודה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות שרירים סביב הזנב עם להב אזמל # 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצצים משם את חלקי הזנב אשר אינם זקוקים, בדרך כלל בשני הקצוות של הזנב, אשר מכילים גדולות יחסית קטן מאודIVDs (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך עוד יותר את השרירים והגידים סביב IVD באמצעות להב סכין המנתחים # 10. היזהרו לא לחתוך את annulus החיצוני של הדיסקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן הקדמי של IVD עם סמן עור כירורגית (צעד זה אופציונלי, זה עוזר לקבוע את מרכז הסיבוב צירית ב bioreactor שלנו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את IVD ונקודת חיבור חוליה ידי הזזת הזנב בעדינות. הרגישו את הגבול בין IVD ועצמות עם הצד הקהה של להב סכין המנתחים. האתר ביקוע צריך להיות 1-2 מ&quot;מ במרחק של IVD לכיוון החוליה. מנהג המקום עשה בעל להב תעשייתית באתר ביקוע (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב IVD ואת החוליה על ידי הפטישים על גבי מחזיק מחוייט את הלהב תעשייתי (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרי על הפעולה בצד השני של חיבור IVD-החוליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלישת מבודד IVD עם גזה סטרילית טבולה סודיום כלוריד 0.9% המכיל ציטרט הנתרן 55mm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך בידודה של IVDs למספר המדגם הרצוי (בדרך כלל סביב 6 יכולניתן לקצור בקוטר בין 1-20 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מערכת שטיפה סילון (צימר, Inc.) עם פתרון Ringer Lactated של סטריליות, שקיות 5L הן בגודל שימושי (PBS סטרילי לחילופין או תמיסת מלח 0.9%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את IVD עם מלקחיים סילון שטיפה שני הצדדים של המשטח באמצעות endplate צימר Pulsavac סילון מערכת שטיפה (איור 1C). האקדח סילון צריך לירות על פני השטח endplate בזווית שבין 30-60 מעלות במשך כ -30 בכל צד. (איורים 1 ו -7) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את IVDs חזרה צלחת 6-הבאר לעטוף עם גזה לח בעוד מטוס אחר מדגם כביסה דיסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IVDs מוכנים תרבות איבר ולמטה זרם יישומים (למשל כדאיות התא, העמסה מכנית, תרבות איבר) (1D איור). </li></ol> 2. נציג תוצאות מדידות תוצאה לשפוט הכנה מוצלח הדיסק הבין חולייתי יכול להיות ניסוי דיפוזיה שבה לצבוע קטן משקל מולקולרי פלואורסצנטי (למשל procion אדום)מוכן כפתרון 1% PBS 2. IVD נשמרת אז עם לפחות 100 מ&quot;ל של תמיסת צבע ואת צבע מותר אז כדי לפזר באופן פאסיבי לתוך IVD במשך 24 שעות תחת נפיחות חינם. IVD היא אז פלאש מוקפאת בחנקן נוזלי והחזיר בטמפרטורת החדר מיובש על ידי שורה של העברות אצטון (הראשון מראש מקורר ב -80 ° C, ואז -20 ° C, אז 4 ° C ולבסוף בטמפרטורת החדר ). דיסק אז יכול להיות מוטבע poly-methyl-Acrylate (PMMA) וחותכים בסכין חדה כדי לייצר 100 מיקרומטר בעובי חלקים. סעיפים אלה אז יכול להיות שנצפו על ידי מיקרוסקופ כל brightfield סטנדרטי אך מועדף על ידי שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מאז procion אדום פולט הקרינה אדום (איורים 5-6). Trabeculi של פני השטח נראה נקי מאוד גרמי אחרי צעד הסילון lavaging (איור 7). פרמטרים לתרבות איבר מצליחים הראשונה בהעדר כל, הכדאיות זיהום תא שמר (איורים 8-9), גובה הדיסקהכוללת &quot;דיסק שלמות&quot;, נמדד עם סעיפים היסטולוגית ו safranin O / ירוק מהיר כתם או Hematoxilin מאיר 3. פיתחנו פרוטוקולים מאקרו שפורסמו 4,5 במקום אחר להכתים רקמת הדיסק לחיות כדי לסרוק את הכדאיות תא 3D באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה ערכת מכתים חי / מת (בדיקות מולקולריות, Invitrogen, באזל, שוויץ). בנוסף, אנו פיתחו מאקרו שגרתי לבצע ספירת תאים אוטומטיות להערכת כדאיות התא ברקמות 3D או נשאים 3D באמצעות פלטפורמת ImageJ NIH 4-6. פרוטוקולים חלופיים הוצעו על מנת לקבוע כדאיות התא של תאים דיסק ידי עיכול ראשוני באמצעות עיכול רציפים של מטריקס תאית באמצעות pronase וסוג collagenase 2 ואחר כך להכתים את ההשעיה תא 7. הגירסה הקודמת של פרוטוקול מעורב שלב הדגירה של PBS ובו עשר פעמים מרוכז יותר ריכוז פניצילין / סטרפטומיצין עבור 10min לאחר קציר של הדיסקים לפני איבר מ&quot;קlture. עם הצעד שטיפה סילון שלב זה מתיישן שכן צעד זה נראה מועיל למטרות culturing. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה של צעדים מתודולוגיים להכין שור דיסקים חולייתי coccygeal עם endplates שלם שכבה דקה (1-2mm) של העצם. א) Schematic לצפות של הדיסק הבין חולייתי (IVD) ואת המסלולים התזונתי שלה. ב) נוהל לחתוך את IVD עם מותאם אישית בעל להב ו - להב חד תעשייתי. ג) שלב Jet שטיפה כדי להבטיח כדאיות התא גבוהה כדי לאפשר חילופי מזין שמירה על endplates ו 1-2 מ&quot;מ של העצם המצורפת בשני הצדדים. ד) לבסוף IVD יכול להיות מתורבת בחדר הדגימה של bioreactor או לשמש עבור יישומים למטה זרם כלשהו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" /> איור 2 TOP:. אורך מלא טרי זנב שור (רצוי obtaעומד לבחינה תוך 2-3 שעות שלאחר המוות, כדי להבטיח כדאיות התא גבוה. תחתונה: תמונת רנטגן של זנב שור בגיל 6 חודשים בערך הממחישות את קיומם של לוחיות הגדילה (GP), מרכז המשני של התאבנות, בין endplates הגרמית (EP) ואת גופות חוליה (VB). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" /> איור 3.) כלים לנתח את זנב שור בתנאים סטריליים. ב) מותאם אישית להב בעל לחתוך החוצה קטעים motional מזנב שור בפעולה תוך צמצום הדיסק הבין חולייתי. ג) Side-נוכח אישית בעל להב עם להב תעשייתי סטנדרטי (לוץ, גרמניה). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" /> איור 4. ציור תמונה של הזנב בקר לאחר הסרת השריר שמסביב רצועה הממחישות את אתרי ביקוע לחתוך את קטעי motional. חלקי חוליה צריך להיות &quot;סדוק&quot; wiה בעל מחוייט את הלהב באופן אידיאלי 1-2 מ&quot;מ הרחק endplates סחוסי כדי להבטיח משטח עצם מלא. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" /> איור 5. הפגנה של ניקוי יעיל של צעד סילון שטיפה לפני (A) ואחרי (B). שימו לב משטחים גרמי נקי של מגזרים הדיסק הבין חולייתי לאחר ההליך ריסוס. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" /> איור 6. חינם, נפיחות ניסוי דיפוזיה של דיסקים נכרת מוכן טרי זנב שור חולייתי (IVDs) שמאל למשך 24 שעות בתמיסה procion 1% אדום, הוכחת החסימה על ידי אפקט הצלחת הצמיחה. מבט רנטגן דיגיטלי sagittal של IVD עדיין המכילים את צלחת צמיחה שכבה שנייה של תמונת העצם במיקרוסקופ פלואורסצנטי של לחתוך sagittal דרך explant את הדיסק שור coccygeal חולייתי עם endplate סחוסי וגרמי אחרי 24H חינם דיפוזיה. GP: צלחת צמיחה, 2ndry CO: במרכז המשני של התאבנות. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" /> איור 7. חינם, נפיחות של הניסוי נכרת דיסקים מוכן טרי זנב שור חולייתי (IVDs) שמאל למשך 24 שעות בתמיסה procion 1% אדום, הוכחת השפעה של טיפול ניקוי שטיפה סילון. חלקים עבים sagittal (~ 100 מ&quot;מ) של IVDs שור נכרת עם לוחיות ~ 1.5-mmthick סוף גרמי שעברו סילון טיפול שטיפה (משמאל) לצד השליטה ללא טיפול (מימין) סילון lavaged הטיפול. כניסה מציג את דפוס ספריי, אשר שימש ממערכת הטריה פצע צימר 24h ניסויים דיפוזיה חופשית של שור explants הדיסק הבין חולייתי באדום procion 1%. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" /> איור 8. תמונות Live / Dead התחזיות של confocal ערימות דימות (250μm) שנלקחו bovinמגזרים דואר הדיסק הבין חולייתי מוכן עם שיטת סילון שטיפה זה הזמן תחת חופשית נפיחות של 0 ו - 14 ימים בהתאמה עבור pulposus גרעין (NP), הפנימי annulus fibrosus (IA) ואת החיצוני annulus fibrosus (OA). תאים תאים חיים ירוק = מוכתם על ידי calcein AM (methylester אצטיל), תאים אדומים = גרעין תאים מתים מוכתם על ידי ethidium homodimer-1. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" /> איור 9. כדאיות התא של הדיסק הבין חולייתי באמצעות לייזר confocal מיקרוסקופיית על רקמת חיים סריקה מחסנית 3D. הכדאיות של גרעין התא Pulposus (NP) ו Annulus פיברוזיס (AF) על פני התרבות של 21 יום בתנאי חופשי נפיחות. (ממוצע ± SEM, N = 6) הבדלים סטטיסטיים נבדקו באמצעות אי - פרמטרית Kruskal-Wallis חתם סכום מבחן דרגה בין הקבוצות. נמצאו הבדלים משמעותיים בין 21 יום וכל נקודות זמן אחרות NP. בעוד AF הבדלים משמעותיים נמצאו בין יום ל 7יום 0. (* P &lt;0.05, ** p &lt;0.01).

<ol>
	<li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc:+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies.">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li><li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells:+a+feasibility+study+using+organ+culture.">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li><li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion.">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li><li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-J&#252;nger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+protocols+for+live/dead+staining+in+three-dimensional+carriers.">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li><li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds.">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc/endplate+culture+model:+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system.">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li><li>Gantenbein, B., Gr&#252;nhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates:+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs.">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li><li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent.">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li><li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology.">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li><li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential.">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

הצעד הראשון לתרבות איברים מוצלחת היא לוודא כי explant לא צריך להיות מזוהמים. הזנב צריך להיות עור לפני שאתם מתחילים עם ההליך. כל שערה חיה הביא למעבדה סטרילית יכול להיות בעייתי מבחינת זיהום. זנב שור אידיאלי צריך להיות טרי ככל האפשר (זה משפיע על כדאיות התא הראשוני). יתר על כן,...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td colspan="4"> דיסק חולייתי טריים שור רקמה מן זנב שור, מבית השחיטה המקומית (רצוי תוך שעות שלאחר המוות בלי העור). </td></tr><tr><td> Pulsavac פלוס AC מערכת </td><td> צימר inc. שוויץ </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> הביצועים הטובים ביותר עם ראש היפ תרסיס ועם אספקת החשמל (אחד עם 8 סוללות AA עושה גם עבודה אבל היא פחות נוחה) </td></tr><tr><td> קיבולת גבוהה מניפה תרסיס w / Splash מגן, אורך 12.7cm </td><td> צימר inc. שוויץ </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> ישנם כמה ראשי תרסיס זמין, בדקנו את זה בהצלחה </td></tr><tr><td> להבי אזמל # 22 ו # 10 </td><td> סוואן, מורטב, אנגליה </td><td> # 10: 0201 # 22: 0208 </td><td></td></tr><tr><td> להב בעל איזמל # 3 ו # 4 </td><td> האוסמן, גרמניה </td><td> # 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> לוץ תעשייתי להב </td><td> לוץ, גרמניה </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) </td><td> Invitrogen, שוויץ </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco של הנשר השתנה בינוני (DMEM) </td><td> Gibco, שוויץ </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated Ringer של פתרון (ללא סוכר) </td><td> Bichsel, שוויץ </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6 גם רב גם צלחת </td><td> TPP, שוויץ </td><td> 92006 </td><td></td></tr><tr><td> בבטאדין פתרון </td><td> Mundipharma, שוויץ </tד&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> עור כירורגי סמן </td><td> Porex כירורגי, שוויץ </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> לוח חיתוך גדול </td><td></td><td></td><td> כל מותג אפשרי </td></tr></tbody></table>

preparation of intact bovine tail intervertebral discs for organ culture

הדיסק הבין חולייתי (IVD) הוא המפרק המחבר את עמוד השדרה מחוליה לחוליה. זה תפקידי להעביר טעינה של עמוד השדרה ולתת גמישות עמוד השדרה. הוא מלחין של שלושה מדורים: pulposus הגרעין הפנימי ביותר (NP) המקיף ידי fibrosus annulus (AF), ושני endplates סחוס המחבר בין NP ו - AF לגוף השדרה משני הצדדים. הכאב נגרם ככל הנראה על ידי Discogenic מחלה ניוונית הדיסק הבין חולייתי (DDD) ו herniations הדיסק זוהה כבעיה מרכזית בחברה המודרנית שלנו. כדי לחקור מנגנונים אפשריים של ניוון IVD, בתרבות חוץ גופית מערכות איברים עם תאים חיים הדיסק הם מאוד מושך. בתרבות במבחנה של שלם IVDs coccygeal שור התקדמה למערכת מודל רלוונטי, המאפשר את לימוד mechano ביולוגית היבטים בסביבה מבוקר היטב פיזיולוגיים מכני. IVDs זנב שור ניתן להשיג בקלות יחסית במספרים גבוהים יותרד דומים מאוד IVDs המותני האדם ביחס צפיפות התאים, אוכלוסיית התאים ממדים. עם זאת, טכניקות קודמות שור הזנב קצירת IVD שמירה endplates סחוסי ו endplates גרמי נכשל לאחר 1-2 ימים של התרבות מאז המסלולים תזונה נחסמו על ידי ברור דם קרוש. IVDs הם האיברים avascular הגדול ביותר, ולכן, את החומרים המזינים את התאים NP תלויים אך ורק על דיפוזיה דרך בלוטות נימי מהגוף השדרה הסמוכה. נוכחות של פסולת עצם ודם קרוש על פני השטח endplate יכול לעכב דיפוזיה מזין למרכז הדיסק תא הכדאיות פשרה. הקבוצה שלנו הוקמה פרוטוקול מהיר יחסית &quot;סדק&quot;, את IVDs מזנב עם סיכון נמוך לזיהום. אנו מסוגלים permeabilize טרי לחתוך משטחים endplate גרמי באמצעות סילון כירורגית שטיפה המערכת, אשר מסיר את קרישי דם ופסולת חיתוך ביעילות רבה מחדש את מסלול דיפוזיה תזונהלמרכז IVD. הנוכחות של צלחות גידול משני צידי העצם בחוליות יש להימנע להסירו לפני התרבות. בסרטון זה, אנו המתאר את הפעולות מכריע במהלך הכנת ולהפגין המפתח תרבות איבר מוצלח שמירה כדאיות התא גבוהה במשך 14 ימים תחת תרבות נפיחות חינם. השעה התרבות יכול להיות ארוך כאשר הסביבה מכני מתאים יכול להישמר באמצעות bioreactor טעינה מכני. הטכניקה הפגינו כאן ניתן להרחיב בעלי חיים אחרים כגון חזירי, ovine ו leporine בידוד IVD הזנב ואת המותני.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture at JoVE.com

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

פרוטוקול זה מדגים טכניקה קצירת עבור coccygeal דיסקים חולייתי שור לתרבות עבור איבר<em&gt; במבחנה</em&gt; איבר תרבות.

הכנת אינטקט דיסקים זנב שור חולייתי לתרבות איברים

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting  vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give  ...

preparation-intact-bovine-tail-intervertebral-discs-for-organ

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K Views.  University of Bern. פרוטוקול זה מדגים טכניקה קצירת עבור coccygeal דיסקים חולייתי שור לתרבות עבור איבר במבחנה איבר תרבות.

Video: Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

הכנת 3D הפיברין פיגומים יישומים סלולריים גזע תרבות

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

לדוגמא הכנת אסטרטגיות להדמית ספקטרומטריית המסה של מודלי תרבית תאי 3D

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

לומד את ההרכב של עוריות Growth Factor Receptor בתאים השלמים באמצעות מתאם מיקרוסקופית

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Fragility Assessment of Bovine Cortical Bone Using Scratch Tests

Bone is a complex hierarchical material with five distinct levels of organization. Factors like aging and diseases like osteoporosis increase the fragility of bone, making it fracture-prone. Owing to the large socio-economic impact of bone fracture in our society, there is a need for novel ways to assess the mechanical performance of each hierarchical level of bone. Although stiffness and strength can be probed at all scales &#8211; nano-, micro-, meso-, and macroscopic &#8211; fracture assessment has so far been confined to macroscopic testing. This limitation restricts our understanding of bone fracture and constrains the scope of laboratory and clinical studies. In this research, we investigate the fracture resistance of bone from the microscopic to the mesoscopic length scales using micro scratch tests combined with nonlinear fracture mechanics. The tests are performed in the short longitudinal orientation on bovine cortical bone specimens. A meticulous experimental protocol is developed and a large number (102) of tests are conducted to assess the fracture toughness of cortical bone specimens while accounting for the heterogeneity associated with bone microstructure.

This study assesses the fracture toughness of bovine cortical bone at the sub-meso levels using microscopic scratch tests. This is an original, objective, rigorous, and reproducible method proposed to probe fracture toughness below the macroscopic scale. Potential applications are studying changes in bone fragility due to diseases like osteoporosis.

הערכה השבריריות של שור קליפת העצם שקצרנו באמצעות בדיקות שריטה

Bone is a complex hierarchical material with five distinct levels of organization. Factors like aging and diseases like osteoporosis increase the ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

ייצור מדרגי של הערוץ מתיחה, כפול, צ'יפס Microfluidic איברים

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and medical intervention in rural environments and military medicine applications where ophthalmic care is not readily available. Untreated injuries are susceptible to infection after the eye has lost its watertight seal, as well as loss of tissue viability due to intraocular hypotension. Therapeutics to temporarily seal open globe injuries, if properly developed, may be able to restore intraocular pressure and prevent infection until proper ophthalmic care is possible. To facilitate product development, detailed here is the use of an anterior segment organ culture open globe injury platform for tracking therapeutic performance for at least 72 h post-injury. Porcine anterior segment tissue can be maintained in custom-designed organ culture dishes and held at physiological intraocular pressure. Puncture injuries can be created with a pneumatic-powered system capable of generating injury sizes up to 4.5 mm in diameter, similar to military-relevant injury sizes. Loss of intraocular pressure can be observed for 72 h post-injury confirming proper injury induction and loss of the eye&#39;s watertight seal. Therapeutic performance can be tracked by application to the eye after injury induction and then tracking intraocular pressure for multiple days. Further, the anterior segment injury model is applicable to widely used methods for functionally and biologically tracking anterior segment physiology, such as assessing transparency, ocular mechanics, corneal epithelium health, and tissue viability. Overall, the method described here is a necessary next step toward developing biomaterial therapeutics for temporarily sealing open globe injuries when ophthalmic care is not readily available.

Open globe eye injuries may go untreated for multiple days in rural or military-relevant scenarios, resulting in blindness. Therapeutics are needed to minimize loss of vision. Here, we detail an organ culture open globe injury model. With this model, potential therapeutics for stabilizing these injuries can be properly evaluated.

פלטפורמת תרבות איברים מגזריי חיצוני למעקב אחר פציעות גלובוס פתוח וביצועים טיפוליים

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional (3D) structures. One of the main functions of epithelia is the formation of barriers that protect the underlining tissues against physical and chemical insults and infectious agents. In addition, epithelia mediate the transport of nutrients, hormones, and other signaling molecules, often creating biochemical gradients that guide cell positioning and compartmentalization within the organ. Owing to their central role in determining organ-structure and function, epithelia are important therapeutic targets for many human diseases that are not always captured by animal models. Besides the obvious species-to-species differences, conducting research studies on barrier function and transport properties of epithelia in animals is further compounded by the difficulty of accessing these tissues in a living system. While two-dimensional (2D) human cell cultures are useful for answering basic scientific questions, they often yield poor in vivo predictions. To overcome these limitations, in the last decade, a plethora of micro-engineered biomimetic platforms, known as organs-on-a-chip, have emerged as a promising alternative to traditional in vitro and animal testing. Here, we describe an Open-Top Organ-Chip (or Open-Top Chip), a platform designed for modeling organ-specific epithelial tissues, including skin, lungs, and the intestines. This chip offers new opportunities for reconstituting the multicellular architecture and function of epithelial tissues, including the capability to recreate a 3D stromal component by incorporating tissue-specific fibroblasts and endothelial cells within a mechanically active system. This Open-Top Chip provides an unprecedented tool for studying epithelial/mesenchymal and vascular interactions at multiple scales of resolution, from single cells to multi-layer tissue constructs, thus allowing molecular dissection of the intercellular crosstalk of epithelialized organs in health and disease.

The present protocol describes the capabilities and the essential culture modalities of the Open-Top Organ-Chip for the successful establishment and maturation of full-thickness organ-on-chip cultures of primary tissues (skin, alveolus, airway, and intestine), providing the opportunity to investigate different functional aspects of the human epithelial/mesenchymal and vascular niche interface in vitro.

שחזור ציטוארכיטקטורה ותפקוד של רקמות אפיתל אנושיות על שבב-איבר פתוח

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...