Dieses Projekt wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF # 310030-127586/1) unterstützt.

1. Bandscheiben-Harvesting <ol><li> Ganze Länge Rinder Schwanz ist von einem örtlichen Schlachthof erhalten, wenn möglich, ohne Haut, da die Anwesenheit der Haut erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination (Abb. 2). </li><li> Bereiten Sie große Schneidebrett und bereiten sterile Arbeitsplatz und Instrumente auf einem Schneidebrett (Abb. 2). </li><li> Bereiten Sie unter der sterilen Laminarströmungshaube steriler Gaze angefeuchtet mit 0,9% Natriumchlorid enthalten, 55mm Natriumcitrat und in jedes Well der 6-Well-Platte. </li><li> Bereiten Sie eine Schüssel und verdünnt 1:100 Betadine Lösung mit Leitungswasser. </li><li> Tauchen Sie den gesamten Rinder-tail in einem Becken mit 1% Betadine Lösung für 5 min. </li><li> Kurz trocknen Schwanz mit steriler Gaze und legen Sie sie auf sterile Arbeitsplatz. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Muskeln rund um den Schwanz mit Skalpell Nr. 22. </li><li> Hacken weg die Teile des Schwanzes, die nicht benötigt werden, in der Regel an beiden Enden des Schwanzes, die relativ große und sehr kleine enthaltenIVD (Abb. 3). </li><li> Trim weiter die Muskeln und Sehnen auf der ganzen IVD mit Skalpell Nr. 10. Vorsicht nicht auf die äußeren Ring der Scheiben schneiden. </li><li> Mark der vorderen des IVD mit einem chirurgischen Hautmarker (dieser Schritt ist optional, hilft es, das Zentrum für axiale Rotation in unsere Bioreaktor zu bestimmen). </li><li> Suchen Sie den IVD und Wirbel Anschlusspunkt, indem Sie den Schwanz sanft. Spüren Sie die Grenze zwischen IVD und Knochen mit der stumpfen Seite eines Skalpell. Die Spaltung Website sollte 1-2 mm entfernt von der IVD in Richtung des Wirbels werden. Legen Sie maßgeschneiderte industrielle Messerhalter auf die Spaltung Website (Abb. 4). </li><li> Cleave IVD und Wirbel durch Hämmern auf der Oberseite des maßgeschneiderten industriellen Messerhalter (Abb. 3). </li><li> Wiederholen Sie auf der anderen Seite des IVD-Wirbel-Verbindung. </li><li> Wrap isoliert IVD mit steriler Gaze angefeuchtet mit 0,9% Natriumchlorid enthalten, 55mm Natriumcitrat. </li><li> Fahren Sie mit der Isolierung von IVD, um die gewünschte Sample-Nummer (in der Regel rund 6 könnengeerntet werden mit einem Durchmesser zwischen 10-20 mm). </li><li> Schließen Sie das Jet-Lavage System (Zimmer, inkl..) Mit steriler Ringer-Laktat-Lösung werden 5L Beutel eine nützliche Größe (alternativ sterile PBS oder 0,9% iger Kochsalzlösung). </li><li> Halten Sie die IVD mit einer Pinzette und Jet-Lavage beiden Seiten der Endplatte Oberfläche mit Zimmer Pulsavac Jet-Lavage System (Abb. 1C). Die Jet-Pistole sollte auf der Endplatte Oberfläche in einem Winkel zwischen 30 Schuss - 60 ° für ca. 30s auf jeder Seite. (Abb. 1 und 7) </li><li> Setzen Sie den IVD zurück zu den 6-Well-Platte und wickeln mit angefeuchteten Mull, während Jet Waschen eine andere Disc Probe. </li><li> IVD sind bereit für Orgel Kultur und down-stream-Applikationen (zB die Lebensfähigkeit der Zellen, mechanische Belastung, Orgelkultur) (Abb. 1D). </li></ol> 2. Repräsentative Ergebnisse Outcome-Messungen zu einer erfolgreichen Bandscheiben-Vorbereitung Richter kann eine Diffusion Experiment sein, wo ein kleines Molekulargewicht Fluoreszenzfarbstoff (zB Procion Red)bereit ist, als eine 1% ige Lösung in PBS 2. Der IVD ist dann mit mindestens 100 ml Farbstofflösung und der Farbstoff wird dann erlaubt, passiv diffundieren in die IVD für 24 Stunden unter freiem Schwellung gehalten. Der IVD ist dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren und brachte wieder auf Raumtemperatur und dehydrierte durch eine Reihe von Aceton Transfers (first in -80 ° C, dann -20 ° C, dann 4 ° C und schließlich auf Raumtemperatur vorgekühlt ). Die Disc kann dann in Poly-Methyl-Acrylat (PMMA) eingebettet und mit einem scharfen Messer bis 100 Mikrometer dicke Schnitte erzeugen. Diese Abschnitte können dann von jedem Standard-Hellfeld-Mikroskop, sondern vorzugsweise durch Verwendung von Fluoreszenz-Mikroskopie seit Procion Red emittiert eine rote Fluoreszenz (Abb. 5-6) eingesehen werden. Die trabeculi der knöchernen Oberfläche erscheinen sehr sauber nach dem jet lavaging Schritt (Abb. 7). Parameter für eine erfolgreiche Orgelkultur sind in erster Linie das Fehlen von Verschmutzungen, erhalten die Lebensfähigkeit der Zellen (Abb. 8-9), Disc-Höhe undGesamt-Wertung &quot;Disc Integrität&quot;, mit histologischen Schnitten und Safranin O / schnell grün färben oder Meyers Hämatoxilin 3 gemessen. Wir entwickelten Protokolle und Makros an anderer Stelle veröffentlicht 4,5 zu leben Bandscheibengewebe färben und die Lebensfähigkeit der Zellen in 3D mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop und dem Live / Dead Färbekit (Molecular Probes, Invitrogen, Basel, Schweiz) zu scannen. Wir weiterentwickelt einem Makro und Routine, um automatisierte Zellzählung, um die Lebensfähigkeit der Zellen in 3D-Gewebe-oder 3D-Träger mit dem NIH ImageJ-Plattform 6.4 Schätzung durchzuführen. Alternate-Protokolle wurden vorgeschlagen, um die Lebensfähigkeit der Zellen des Disc-Zellen durch anfängliche Verdauung mit sequentiellen Verdau der extrazellulären Matrix mit Pronase und Kollagenase Typ zu bestimmen 2 und dann auf die Zelle Aufhängung 7 Fleck. Eine frühere Version des Protokolls beteiligt einem Inkubationsschritt in PBS, die zehn Mal stärker konzentriert Penicillin / Streptomycin-Konzentration für 10 Minuten nach der Ernte der Scheiben vor Organ culture. Mit dem Jet-Lavage Schritt dieser Schritt hinfällig, da dieser Schritt vorteilhaft erscheint für die Kultivierung Zwecke. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" /> Abbildung 1. Überblick über die methodischen Schritte an Rinder coccygeal Bandscheiben mit intakten Endplatten und eine dünne Schicht (1-2mm) von Knochen vorzubereiten. A) Schematische Darstellung der Bandscheibe (IVD) und ihre ernährungsphysiologischen Wege. B) Verfahren zum Ausschneiden der IVD mit einer angepassten Klinge-Halter und ein industrielles scharfe Klinge. C) Jet Lavage Schritt, um eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen und Stoffaustausch halten die Endplatten und 1-2 mm Knochen auf beiden Seiten angebracht zu ermöglichen. D) Schließlich wird die IVD kann in der Probenkammer eines Bioreaktors kultiviert werden oder für jede down-stream-Anwendung verwendet werden. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" /> Abbildung 2 TOP:. Volle Länge frischem Rind Schwanz (idealerweise obtainiert innerhalb von 2-3 Stunden post mortem zu hohen Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Unten: Röntgenaufnahme eines Rinder-Schwanz um 6 Monate, welche die Existenz der Wachstumsfugen (GP), sekundäre Zentrum von Verknöcherung, zwischen den knöchernen Endplatten (EP) und der Wirbelkörpern (VB) im Alter. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" /> Abbildung 3. A) Tools, um die Rinder Schwanz unter sterilen Bedingungen zu sezieren. B) Customized Blade-Inhaber, cut-out Bewegungs-Segmente aus der Rinder-Schwanz in Aktion während des Schneidens der Bandscheibe. C) Side-Blick auf den kundenspezifischen Blade-Halter mit einem Standard-Industrie-Klinge (Lutz, Deutschland). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" /> Abbildung 4. Zeichnen und Bild von der Rinder-tail nach dem Entfernen der umgebenden Muskeln und Bänder, welche die Spaltung von Websites zum Ausschneiden der Bewegungs-Segmente. Teilweise Wirbel sollte &quot;geknackt&quot; werden with die maßgeschneiderte Messerhalter idealerweise 1-2 mm entfernt von der knorpeligen Endplatten, um sicherzustellen, voller Knochenoberfläche. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" /> Abbildung 5. Demonstration der effektiven Reinigung des Jet-Lavage Schritt vor (A) und nach (B). Beachten Sie die saubere Knochenoberflächen der Bandscheibe Segmente nach dem Sprühverfahren. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" /> Abbildung 6. Free-Schwellungen Diffusionsversuch an frisch zubereiteten herausgeschnitten Rinder Schwanz Bandscheiben (IVD) für 24 Stunden in 1% Procion rote Lösung links, demonstriert Blockade-Effekt durch das Wachstum Platte. Ein digitales Röntgen sagittale Ansicht eines IVD noch mit dem Wachstum Platte und eine zweite Schicht von Knochen Fluoreszenzmikroskopie Bild sagittal durchschnitten des Steißbeins Rinder Bandscheibe Explantation mit knorpeligen und knöchernen Endplatte nach 24h freie Diffusion. GP: Epiphysenfuge, 2ndry CO: Mittelzentrum der Verknöcherung. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" /> Abbildung 7. Free-Schwellungen Experiment an frisch zubereiteten herausgeschnitten Rinder Schwanz Bandscheiben (IVD) für 24 Stunden in 1% Procion rote Lösung links, zeigt reinigende Wirkung der Jet Lavage Behandlung. Sagittal dicke Abschnitte (~ 100 mm) von Rindern herausgeschnitten IVD mit ~ 1,5-mmthick knöchernen Endplatten, die Jet-Lavage Behandlung (links) Steuerseite ohne Behandlung (rechts) jet-gespült Behandlung unterzog. Inlet zeigt das Spritzbild, die aus dem Zimmer Wundreinigung verwendet wurde 24 Stunden freie Diffusion Experimente von Rindern Bandscheibe Explantate in 1% Procion rot. <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" /> Abbildung 8. Live / Dead Bilder von Projektionen der konfokalen Imaging-Stacks (250μm) aus bovin genommene Bandscheibe Segmente mit diesem Jet-Lavage-Methode unter freien Schwellungen für 0 und 14 Tagen jeweils für den Nucleus pulposus (NP), der inneren Faserring (IA) und dem äußeren Faserring (OA) gehalten vorbereitet. Grüne Zellen = lebende Zellen von Calcein AM (Acetyl-Methylester) gefärbt, rote Blutkörperchen = tote Zellen Kern von Ethidium Homodimer-1 gefärbt. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" /> Abbildung 9. Zellviabilitätsmessungen der Bandscheibe mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie an lebenden Gewebe und 3D-Stapel scannen. Die Lebensfähigkeit der Zellen des Nucleus pulposus (NP) und Faserring (AF) über die 21-Tage-Kultur unter free-Schwellungen Zustand. (Mittelwert ± SEM, N = 6) Statistische Unterschiede wurden mit nicht-parametrischen Kruskal-Wallis unterzeichnet Rangsummentest zwischen den Gruppen. Signifikante Unterschiede wurden zwischen Tag 21 und allen anderen Zeitpunkten in NP gefunden. Während in AF signifikanten Unterschiede zwischen Tag 7 gefundenTag 0. (* P &lt;0,05, ** p &lt;0,01).

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	<li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc:+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies.">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li><li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells:+a+feasibility+study+using+organ+culture.">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li><li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion.">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li><li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-J&#252;nger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+protocols+for+live/dead+staining+in+three-dimensional+carriers.">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li><li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds.">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc/endplate+culture+model:+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system.">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li><li>Gantenbein, B., Gr&#252;nhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates:+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs.">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li><li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent.">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li><li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology.">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li><li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential.">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Der erste Schritt für eine erfolgreiche Orgelkultur ist, um sicherzustellen, dass die Explantation sollte nicht kontaminiert werden. Die Rute sollte gehäutet, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen. Jedes Tier Haare in ein steriles Labor gebracht werden konnte in Bezug auf die Kontamination problematisch. Die Rinder Schwanz sollte idealerweise so frisch wie möglich (dies betrifft zunächst die Lebensfähigkeit der Zellen). Darüber hinaus ist die betadine Waschschritt empfohlen, das Risiko einer Kontamination weiter zu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td colspan="4"> Frischem Rind Bandscheibengewebe aus Rinder-Tails aus den örtlichen Schlachthof (im Idealfall innerhalb weniger Stunden post mortem und ohne Haut). </td></tr><tr><td> Pulsavac Plus AC-System </td><td> Zimmer inkl.., Schweiz </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> Beste Leistung mit dem Hip-Sprühkopf und mit AC-Netzteil (das mit der 8 AA Akkus hat auch, ist aber weniger komfortabel) </td></tr><tr><td> High Capacity Fan Spray w / Splash Shield, 12,7 cm Länge </td><td> Zimmer inkl.., Schweiz </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> Es gibt mehrere Sprühköpfe zur Verfügung, testeten wir diese erfolgreich </td></tr><tr><td> Skalpellklingen Nr. 22 und Nr. 10 </td><td> Swann-Mortauf, England </td><td> Nr. 10: 0201 Nr. 22: 0208 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpel Messerhalter # 3 und # 4 </td><td> Hausmann, Deutschland </td><td> # 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> Lutz industriellen Klinge </td><td> Lutz, Deutschland </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Saline (PBS) </td><td> Invitrogen, Schweiz </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Gibco, Schweiz </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-Laktat-Lösung (ohne Glukose) </td><td> Bichsel, Schweiz </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well Multi-Well-Platte </td><td> TPP, Schweiz </td><td> 92006 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine Lösung </td><td> Mundipharma, Schweiz </td&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Hautmarker </td><td> Porex Surgical, Schweiz </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> Große Schneidebrett </td><td></td><td></td><td> Jede Marke ist möglich </td></tr></tbody></table>

preparation of intact bovine tail intervertebral discs for organ culture

Die Bandscheibe (IVD) ist das Gelenk der Wirbelsäule verbinden Wirbel zu Wirbel. Es funktioniert nach Belastung der Wirbelsäule übertragen und bieten die Flexibilität, um die Wirbelsäule. Es komponiert aus drei Abteilungen: der innerste Kern pulposus (NP) umfasst von der Faserring (AF), und zwei knorpeligen Endplatten Anschluss der NP und AF auf die Wirbelkörper auf beiden Seiten. Bandscheibenbedingte Schmerzen möglicherweise durch degenerative Bandscheibenleiden (DDD) und Bandscheibenvorfälle verursacht hat, als ein großes Problem in unserer modernen Gesellschaft identifiziert worden. Zur Untersuchung möglicher Mechanismen der IVD-Degeneration, sind in vitro Orgelkultur Systeme mit Live-CD-Zellen sehr ansprechend. Die in vitro-Kultur von intakten Rinder coccygeal IVD hat einen entsprechenden Modell, das die Untersuchung der mechanisch-biologischen Aspekten in einer gut kontrollierten physiologischen und mechanischen Umgebung ermöglicht fortgeschritten. Bovine Schwanz IVD erhalten relativ leicht in höhere Zahlen Seien Sie eind sind sehr ähnlich wie das menschliche Lendenwirbelsäule IVD in Bezug auf die Zelldichte, Zell-Population und Dimensionen. Allerdings gelang früheren Rinder caudal IVD Erntetechniken Beibehaltung knorpeligen und knöchernen Endplatten Endplatten nach 1-2 Tagen der Kultur, da die Ernährung Wege waren offensichtlich durch geronnenes Blut blockiert. IVD sind die größten avaskuläre Organe, so sind die Nährstoffe zu den Zellen in der NP allein abhängig von der Diffusion über die Kapillare Knospen aus der benachbarten Wirbelkörper. Präsenz von Knochen Schutt und geronnenes Blut auf der Endplatte Oberflächen können Nährstoffdiffusion in die Mitte der Scheibe und des Kompromisses die Lebensfähigkeit der Zellen zu verhindern. Unsere Gruppe wurde eine relativ schnelle Protokoll-out &quot;knacken&quot; des IVD vom Schwanz mit einem geringen Risiko für Verunreinigungen. Wir sind in der Lage, den frisch geschnittenen knöchernen Endplatte Oberflächen mit Hilfe eines chirurgischen Jet-Lavage System, das die Bildung von Blutgerinnseln und Schneidabfall entfernt und sehr effizient öffnet die Ernährung Diffusionsweg permeabilisierenum die Mitte des IVD. Die Anwesenheit des Wachstums Platten auf beiden Seiten der Wirbelknochen muss vermieden werden und vor der Kultur entfernt werden. In diesem Video stellen wir die entscheidenden Schritte bei der Vorbereitung und Demonstration der Schlüssel zu einer erfolgreichen Orgelkultur Beibehaltung der hohen Lebensfähigkeit der Zellen für 14 Tage unter freiem Schwellungen Kultur. Die Kultur der Zeit könnte erweitert werden, wenn geeignete mechanische Umwelt durch mechanische Belastung Bioreaktor aufrechterhalten werden kann. Das kann die Methode auf andere Tierarten wie Schweine, Schafe und leporine caudal-und Lendenwirbelsäule IVD Isolation erweitert werden.

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Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

Dieses Protokoll stellt eine Erntetechnik für coccygeal Rinder Bandscheiben für Orgel Kultur<em&gt; In-vitro-</em&gt; Orgel Kultur.

Vorbereitung von Intact Bovine Rute Bandscheiben für Orgel Kultur

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting  vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give  ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K Aufrufe.  University of Bern. Dieses Protokoll stellt eine Erntetechnik für coccygeal Rinder Bandscheiben für Orgel Kultur In-vitro- Orgel Kultur.

Serie: Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Forschung

Biotechnik

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Probenvorbereitung Strategien für Massenspektrometrie Imaging von 3D-Zellkulturmodelle

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Die Multi-Organ Chip - Ein Mikrofluidik-Plattform für langfristige Multi-Gewebe Cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Herstellung von extrazellulären Matrix Proteinfasern für Brillouin-Spektroskopie

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...