فإن الكتاب أود أن أشكر العديد من أعضاء مختبر لإبداء اقتراحاتهم القيمة في تطوير agroinfiltration والمقايسات في الجمعية المختبر. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منحة من جامعة كاليفورنيا. وأيد هذه الدراسة في أجزاء من منحة مقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET-1144237).

1. المواد النباتية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن نيكوتيانا benthamiana النباتات لاستخدامها في فحص encapsidation تكون في مرحلة أوراق 4 (3-4 أسبوع تقريبا النباتات القديمة). </li></ol> 2. تسليم والتعبير عن وظيفية مكونات الجينوم الفيروسي لزرع الخلايا agroinfiltration <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 1: وتزرع سلالة الأجرعية (مثل EH 105 أو GV 3101) إيواء RNA pCass BMV-1، 2 BMV RNA والحمض النووي الريبي BMV 3 1،2 على لوحات أجار LB تستكمل مع 50 ملغ / مل من الكانامايسين (تحديد لل الموجه pCASS) و100mg/ml من ريفامبيسين (يختار لالأجرعية). ويجري تنفيذ حضانة بها في 28 درجة مئوية لمدة يومين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 3: مستعمرة واحدة تطعيم من لوحة LB أجار إلى 2 مل من مرق LB يحتوي على 50 ملغ / مل من الكانامايسين و 100 ملغ / مل من الريفامبيسين لمدة 1 يوم عند 28 درجة مئوية في مجموعة شاكر المداري في 250 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 4: تطعيم 50 مل من LB الملحق مرقإد مع 50 ملغ / مل من الكانامايسين و 100 ملغم / لتر من مادة ريفامبيسين، 10 ملي زارة التربية والعلم درجة الحموضة 5.6 و 100 ملم acetosyringone مع واحد مل من ثقافة في 250 مل من دورق مخروطي لمدة 16 ساعة على 28 درجة مئوية على مدار شاكر في 250 دورة في الدقيقة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 5: نقل الثقافة (OD 600 عندما وصلت 1.0) لأنبوب أوك ريدج أو معقم الصقر الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 5000 دورة في الدقيقة في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل بيليه في 10 مل من 10 ملي MgCl (2) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 5000 دورة في الدقيقة في درجة مئوية 4، كرر هذه الخطوة مرة أخرى لضمان الاستئصال الكامل للمضادات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق بيليه في المخزن 10 مل تحتوي على 10 MgCl 2 مم و 10 مللى زارة التربية والعلم (درجة الحموضة 5.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 لكل ثقافة من الحمض النووي الريبي BMV 1، 2 RNA والحمض النووي الريبي (3) وضبط إلى 0.1 OD 600 باستخدام 10 ملي MgCl (2) وزارة التربية والعلم 10MM (درجة الحموضة 5.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 1 مل كل كل ثلاثة 0،1 تعليق OD ثقافة 600. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ملم من acetosyringone، مزيج جنتلاي والحفاظ على مزيج دون عائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم تعليق الثقافة في 1 مل. حقنة من دون إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسلل الى تعليق ثقافة أعلاه إلى جانب مجافي المحور الأوراق جيدا الموسع 2-3 ن. benthamiana (5 أوراق المرحلة، والنباتات الاسبوع 3-4 سنة) عن طريق الضغط بلطف على حقنة واحدة من نصف سطح مجافي المحور من ورقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا الإجراء تسلل إلى أوراق أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على النباتات تسلل في البيت الأخضر مع 24 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسللت حصاد أوراق 3-4 تسلل آخر أيام (نقطة في البوصة). </li></ol> 3. تنقية virions BMV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ن. benthamiana يترك agroinfiltrated مع خليط يحتوي كل ثلاثة البرية نوع agrotransformants BMV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطحن الأوراق في مدقة وهاون عقيم مع حجم مساو (ث / ت) من BMV استخراج العازلة (0.5 م NAAC؛ 0.08 متر MgAc، ودرجة الحموضة 4.5 و حجم 1/100 المؤرخ المركابتويثانول-β التي هي التي يمكن ان تضاف فقط قبل الاستخدام) 3. لتعظيم العائد فيروس، فمن المستحسن لإضافة الرمل المغسول حامض (~ 0،5-1 ز) التي تسهل سهل طحن وكفاءة تمزيق الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية المستخلص من خلال 2-3 طبقات من القماش الشاش وجمع فورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن مرة أخرى في جزء الإبقاء على قماش الشاش مع حجم مساو من عازلة استخراج BMV لوزن المواد الأولية من ورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء الترشيح باستخدام قطعة قماش الشاش. وينبغي القيام بها في هذه الخطوات 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل الترشيح لأنبوب الطرد المركزي وإضافة حجم مساو من قبل مبرد الكلوروفورم ودوامة (أو هزة) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة حتى لون تعليق يتحول الضوء الأخضر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة الحل المستحلب لمدة 15 دقيقة في 12000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المرحلة المائية ويحرك لمدة 30 دقيقة على محرك مغناطيسي لإزالة أي بقايا الكلوروفورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق على أنبوب منبذة فائقة العقيمة. </li><li&gt; البطانة 1 مل. 10٪ سكروز (المعد في عازلة استخلاص فيروس) بوصفها 3 وسادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 30000 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات في منبذة فائقة بيكمان في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ووقف بيليه في حجم المطلوب من عازلة تعليق BMV (لإعداد تعليق العازلة استخراج BMV المخففة العازلة إلى 10/1 مع الماء المقطر عقيم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتعرض إعداد الفيريون تنقية جزئيا من الخطوة أعلاه إلى 10-40٪ سكروز الطرد المركزي المتدرج الكثافة لمدة 150 دقيقة في 28000 دورة في الدقيقة في درجة مئوية 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الفرقة فيروس إما يدويا أو بواسطة fractionator. والفرقة فيروس تظهر زرقاء تحت إضاءة الضوء الأبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل السكروز التي تحتوي على عينة الفيروس ما لا يقل عن 50٪ مع عازلة تعليق فيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة المخفف حل فيروس السكروز التي تحتوي على لمدة 3 ساعات في 30000 دورة في الدقيقة في منبذة فائقة بيكمان في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق أخيرا عالي النقاء فيروس بيليه في حجم المطلوب من VIRلنا تعليق العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الفيريون (ملغم / لتر) باستخدام مقياس الطيف في التطوير التنظيمي 260. </li></ol><img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" /> ملاحظة: وبناء على محتوى الحمض النووي الريبي، ومعامل للانقراض BMV هو 5 4. <ol start="19" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من نقاء virions عن طريق عرض تحت TEM (الشكل أ) </li></ol> 4. إعداد مفارز البروتين قفيصة في المختبر عن الجمعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 1 لتر من 1X فيروس التفكك العازلة (0.5 م CaCl 2، 50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 1.0 ملم EDTA، 1.0 ملم و 0.5 DTT PMSF ملي) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد غشاء غسيل الكلى وفقا لسامبروك وآخرون 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن التركيز المطلوب لتنقية الفيروس في كيس غسيل الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع كيس يحتوي على فيروس غسيل الكلى في دورق يحتوي على 1X العازلة تفارق فيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze 24 ساعة في 4 whil درجة مئويةه التحريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحل من كيس غسيل الكلى بعد 24 ساعة، وأجهزة الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. وهذا فصل الحمض النووي الريبي BMV من virions فصلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وطاف والطرد المركزي في 35000 دورة في الدقيقة في أجهزة الطرد المركزي بيكمان لمدة 3 ساعات في 4 درجات مئوية لتكوير أي جسيمات الفيروس من الامم المتحدة وفصلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وطاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذه المرحلة لا بد من إزالة أي تلوث من الحمض النووي الريبي الفيريون فصل مفارز البروتين قفيصة. للقيام بذلك، ينبغي أن يتعرض لها طاف من الخطوة 8 لجولة أخرى من خلال إعادة التجميع ليلة من مفارز البروتين قفيصة دون إضافة أي الحمض النووي الريبي (RNA العازلة في الجمعية 1X، انظر أدناه) تليها الطرد المركزي عالية السرعة (30،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات في 4 درجة مئوية) لبيليه أي virions تجميعها. بعد هذه الخطوة إعادة التجميع، وطاف بروتين معطف تحتوي على وحدات فرعية تكون خالية من أي تلوث RNA المتبقية. ومع ذلك، للتأكد من هذا، فإنه من المستحسن إجراء إضافي في الخامسitro إعادة التجميع مع مفارز فقط بروتين معطف باستخدام الحمض النووي الريبي العازلة الجمعية 1X. بعد أكثر من ليلة إعادة التجميع، يجب أن تكون خالية من إعداد virions تجميعها (تحقق من استخدام تيم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز مفارز البروتين قفيصة عن طريق قياس في التطوير التنظيمي 254 و 280 نانومتر أو بواسطة وسائل أخرى مثل فحص برادفورد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اداء 12-15٪ SDS-PAGE تليها طخة غربية لتحديد سلامة مفارز البروتين قفيصة فصلها. </li></ol> 5. في الجمعية المختبر من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على virions <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد النصوص الحمض النووي الريبي ليعاد تجميعها في virions وحساب تركيز 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج مفارز البروتين قفيصة والجيش الملكي النيبالي نص في نسبة 01:05 (وزن / وزن) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن الخليط السابق للكيس غسيل الكلى وتأمين بشكل صحيح لتجنب أي تسرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1000 مل. من الحمض النووي الريبي العازلة الجمعية 1X (50 ملم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.2 و 10 بوكل مم؛ 5 مم MgCl 2، 1.0 ملم DTT) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كيس غسيل الكلى الذي يحتوي على خليط رد فعل ضد العازلة الجمعية 1X إلى الدورق ويحرك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze رد الفعل إعادة التجمع في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بواسطة التحريك لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع خليط من كيس غسيل الكلى بعد 24 ساعة، وإضافة 1.5 مل من الحمض النووي الريبي العازلة الجمعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير هذا الخليط من خلال عمود-100 Centricon بواسطة الطرد المركزي على سرعة منخفضة (2،000 x ج) لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العمود مرة واحدة مع 1.5 مل من عازلة الجمعية العامة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة الغسيل فوق مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، وأزل virions إعادة تجميعها بواسطة الطرد المركزي في 10000 ز ب 4 لمدة 5 دقائق درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويقدر تركيز الفيريون في 260 نانومتر OD. </li></ol> 6. تلفيق من أشباح الفيروسية البصرية (OVGs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خضرة الإندوسيانين (ICG) 8 إلى البروتين قفيصة تنقيته في نسبة تركيز المطلوب (نسبة الوزن من Indocyanine البروتين الأخضر وقفيصة المستخدمة في هذا التقرير هو 1:10) 1<html> د مزيج دقيق من قبل pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze البروتين قفيصة وحل جنة الدولية ضد المنطقة العازلة الجمعية OVG (1 M كلوريد الصوديوم، و 50 NAAC مم؛ 1 ملم EDTA، و 1 DTT مم، pH4.8) في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، وجمع من حل لحقيبة غسيل الكلى (12 كيلو دالتون حجم المسام)، وأجهزة الطرد المركزي في 90000 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية (الشكل B) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ووقف بيليه في تعليق العازلة BMV بواسطة vortexing أو تركها على تعليق نفسه في تعليق BMV العازلة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من مورفولوجية OVGs بواسطة TEM (الشكل ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية من 240 نانومتر إلى 950 نانومتر باستخدام مقياس الطيف (كاري 50، فاريان شركة)، ويتأكد من وجود مجموعة الازمات الدولية من قبل قمم الامتصاصية توقيع نحو 700 نانومتر و 790 نانومتر 8. (الشكل D) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن رؤية نموذجية قمم مضان ICG في نانومتر 700 ~ ~ ونانومتر 800 نانومتر على إثارة 620 من حل OVG (الشكل د) استخدام مقياس التألق الطيفي (Fluorolog 3، Jobin إيفون). </li></ol>_title &quot;&gt; النتائج الممثل 7. <img alt="الشكل ألف" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> صورة شخصية تيم ألف virions BMV الملون سلبا على تنقيته من ن. agroinfiltrated النباتات benthamiana مع مزيج من كل ثلاثة البرية نوع agroconstructs BMV (شريط مقياس = 100 نانومتر). <img alt="الشكل باء" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> تجميعها الرقم ب بيليه من في المختبر جنة الدولية OVGs المحتوية على بعد عالية السرعة الطرد المركزي. <img alt="الشكل جيم" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> صورة شخصية تيم جيم من OVGs سلبا جنة الدولية الملون التي تحتوي على (شريط مقياس = 100 نانومتر). <img alt="الشكل دال" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> الشكل دال الامتصاصية (الأعلى)، ومضان (القاع) أطياف OVGs. طول الموجة المستخدمة لإثارة OVG انبعاث ثكما 620 نانومتر.

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

يمكن مقاربة Agroinfiltration المقدمة هنا يكون على نطاق واسع ينطبق على مجموعة واسعة من الفيروسات النباتية. وتزامن وثمة سمة مميزة لهذا النهج تسليم agroconstruct متعددة إلى خلية واحد في نفس العيب الرئيسي المرتبطة عادة مع التلقيح الميكانيكي تستخدم بشكل روتيني من الفيروسات النباتية. ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> أملاح الصوديوم زارة التربية والعلم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> خضرة الإندوسيانين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> بيكمان منبذة فائقة </td><td> بيكمان كولتر </td><td> نموذج: L8-70M </td></tr><tr><td> Centricon-100 عمود </td><td> ميليبور </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> طيفي </td><td> كاري 50، فاريان المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> جزء رقم 10068900 </td></tr><tr><td> مقياس التألق الطيفي </td><td> Fluorolog 3، Jobin إيفون. </td><td> رقم الجزء FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

في الفيروسات مع إيجابي، بمعنى الممرضة الجينوم الحمض النووي الريبي على البشر والحيوانات والنباتات، وencapsidation ذرية في virions ناضجة ومستقرة هي مرحلة الكاردينال خلال إنشاء عدوى في مجموعة معينة. وبناء على ذلك، ودراسة encapsidation يحل المعلومات المتعلقة الدراية لآلية تنظم الجمعية فيروس لتشكيل virions المعدية. مثل هذه المعلومات أمر حيوي في صياغة أساليب جديدة لكبح انتشار الفيروس والسيطرة على الأمراض. يمكن دراستها encapsidation الفيروس في والمجراة في المختبر. encapsidation الجينوم في الجسم الحي هو عملية منظمة للغاية الانتقائية التي تنطوي على تفاعلات الجزيئات التحت خلوية والتقسيم. لذلك، مما يؤدي إلى دراسة تشريح أحداث تشمل encapsidation الفيروس في الجسم الحي من شأنه أن يوفر المعارف الأساسية لفهم كيفية الفيروسات تتكاثر والتجمع. في الآونة الأخيرة في encapsidation المختبر تم استغلال للبحوث في مجال الطب الحيوي IMAجينج والتطبيقات العلاجية. الفيروسات النباتية غير يلفها يقف متقدما بفارق كبير في هذا المشروع من encapsidation في المختبر من المواد الخارجية السالبة. وقد استخدمت Brome فيروس فسيفساء (BMV)، وهو غير يلفها فيروس RNA متعدد المكونات المسببة للنباتات، ونظام نموذجي لدراسة الجينوم في التعبئة والتغليف والمجراة في المختبر. لفحوصات encapsidation في محطات benthamiana نيكوتيانا، الأجرعية بوساطة التعبير عابرة، تشير إلى مثل agroinfiltration، وهي تقنية فعالة وقوية لتسليم متزامنة والتعبير عن مكونات متعددة إلى نفس الخلية. في هذا النهج، هو تسلل تعليق من الخلايا الأجرعية المورمة الناقلة البلازميد ثنائي تحمل cDNAs من mRNAs desiredviral إلى ورقة الفضاء withina بين الخلايا باستخدام أي شيء أكثر تعقيدا من حقنة القابل للتصرف 1 مل (بدون إبرة). هذه نتائج عملية في نقل إدراج الحمض النووي في الخلايا النباتية، وT-DNAإدراج يبقى عابر في النواة وكتب بعد ذلك من قبل المضيف الثاني بوليميريز، مما يؤدي إلى التعبير عابر. ويتم تصدير ثم نص مرنا الناتج (المغطاة ومذيل بعديد الأدينيلات) إلى السيتوبلازم للترجمة. بعد ما يقرب من 24 إلى 48 ساعة من الحضانة، ويمكن أخذ عينات من أجزاء الأوراق مخترقة للتحاليل الكيميائية الحيوية microscopyor. Agroinfiltration يسمح بأعداد كبيرة (مئات الآلاف) من الخلايا لtransfected في وقت واحد. لفي المختبر encapsidation، virions تنقيته من BMV هي نأت إلى البروتين قفيصة بواسطة dialyzing ضد كلوريد الكالسيوم تفارق العازلة التي تحتوي على تليها إزالة الحمض النووي الريبي وvirions برنامج الأمم المتحدة للفصل عن طريق الطرد المركزي. يتم تجميعها ثم الجينوم مفارز المنضب قفيصة البروتين المطلوب مع مكونات الجينوم الفيروسي أو غير الفيروسية مكونات مثل indocyanine صبغ.

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

وهناك طريقة بسيطة وفعالة وقوية لتزامن وصول عناصر فيروسية متعددة لخلايا النبات عن طريق<em&gt; الأجرعية</emيوصف&gt; بوساطة التعبير عابر. يتبع encapsidation هذا النهج هو قابل للدراسة تكرارها، من قبل<em&gt; في المختبر</emالمنضب&gt; إعادة التجميع من غير الفيروسية المكونات إلى الجينوم الفيروسي أشباح الضوئية مناسبة للتطبيقات الطبية الحيوية.

بسيطة وقوية في الجسم الحي و في المختبر مدخل لدراسة الجمعية فيروس

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

12.1K Views.  University of California, Riverside. وهناك طريقة بسيطة وفعالة وقوية لتزامن وصول عناصر فيروسية متعددة لخلايا النبات عن طريق الأجرعية بوساطة التعبير عابر. يتبع encapsidation هذا النهج هو قابل للدراسة تكرارها، من قبل في المختبر إعادة التجميع من غير الفيروسية المكونات إلى الجينو?...

Video: Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

في الجسم الحي التصوير كشفها (IVIS) نظم لفيروس العصبية الغازية ملتهب الدماغ

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways activated during cardiovascular pathologies are, however, limited by the lack of robust and physiologically relevant methods. In order to model pathological vascular events we have developed an in vitro assay for studying the interaction between endothelium and whole blood. The assay consists of primary human endothelial cells, which are placed in contact with human whole blood. The method utilizes native blood with no or very little anticoagulant, enabling study of delicate interactions between molecular and cellular components present in a blood vessel.
We investigated functionality of the assay by comparing activation of coagulation by different blood volumes incubated with or without human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Whereas a larger blood volume contributed to an increase in the formation of thrombin antithrombin (TAT) complexes, presence of HUVEC resulted in reduced activation of coagulation. Furthermore, we applied image analysis of leukocyte attachment to HUVEC stimulated with tumor necrosis factor (TNF&#945;) and found the presence of CD16+ cells to be significantly higher on TNF&#945; stimulated cells as compared to unstimulated cells after blood contact. In conclusion, the assay may be applied to study vascular pathologies, where interactions between the endothelium and the blood compartment are perturbed.

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

رواية<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

في طرق المختبر لمقارنة الهدف وتجليد وCDC التعريفي بين الأجسام المضادة العلاجية: تطبيقات في تحليل Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

طريقة فعالة وبسيطة وضع ناغورني كاراباخ وخطوط الخلايا T من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة النشطة فيروس ابشتاين-بار

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

قياس تدفق بسيط على أساس التحليل تحديد في المختبر جسم تعزيز التابعة لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل فيروس Zika النقاهة

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...