המחברים מבקשים להודות כמה מחברי המעבדה לקבלת הצעות ערך שלהם בפיתוח agroinfiltration וב מבחני חוץ גופית הרכבה. עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם אוניברסיטת קליפורניה. מחקר זה נתמך חלקי על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע (CBET-1144237).

1. הצמח החומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוטיאנה צמחים benthamiana כדי לשמש assay encapsidation צריך להיות בשלב עלים 4 (צמחים בשבוע 3-4 כ ישנים). </li></ol> 2. משלוח וביטוי של רכיבים פונקציונליים הגנום הנגיפי לשתול תאים על ידי agroinfiltration <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: זן Agrobacterium (למשל EH 105 או GV 3101) מחסה pCass-BMV RNA 1, 2 ו BMV RNA RNA BMV 3 1,2 גדלים על אגר צלחות ליברות השלימו עם 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל של kanamycin (בוחר עבור וקטור pCASS) ו 100mg/ml של ריפאמפיצין (בוחר עבור Agrobacterium). הדגירה מתבצעת על 28 מעלות צלזיוס במשך יומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3: מושבה אחת מהצלחת ולחסן LB אגר לתוך 2 מ&quot;ל של מרק LB המכיל 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ו kanamycin 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל של ריפאמפיצין ליום 1 ב 28 מעלות צלזיוס מסלולית שאכר נקבע על 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4: מחסן 50 מ&quot;ל תוספת מרק LBאד עם 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו kanamycin 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של ריפאמפיצין, 10 mM MES-pH 5.6 ו 100 מ&quot;מ עם acetosyringone מ&quot;ל 1 של התרבות ב 250 מ&quot;ל של הבקבוק Erlenmeyer במשך 16 שעות ב 28 מעלות צלזיוס על מסלולית שאכר בסל&quot;ד 250 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5: מעבירים את התרבות (כאשר OD 600 הגיעו 1.0) על צינור רכס אלון או צינור סטרילי פלקון ו צנטריפוגות במשך 10 דקות בסל&quot;ד 5000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את גלולה ב 10 מ&quot;ל של 10 מ&quot;מ MgCl 2 ו צנטריפוגות במשך 10 דקות בסל&quot;ד 5000 ב 4 ° C, חזור על פעולה זו פעם נוספת על מנת להבטיח הסרה מלאה של אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות גלולה במאגר המכיל 10 מ&quot;ל 10 mM MgCl 2 ו 10 mM MES (pH 5.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את OD 600 עבור כל תרבות של BMV RNA 1, 2 ו-RNA-RNA 3 ולהתאים 0.1 OD 600 באמצעות 10 mM MgCl 2 ו 10mm MES (pH 5.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1 מ&quot;ל כל אחד בכל שלושת 0.1 OD 600 השעיות תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 מ&quot;מ של acetosyringone, לערבב GentLY ולשמור על תערובת באין מפריע בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את ההשעיה התרבות לתוך מ&quot;ל 1. מזרק ללא מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור ההשעיה התרבות מעל לצד abaxial של 2-3 היטב מורחבת עלי נ benthamiana (5 עלים, צמחים בשלב בשבוע 3-4 ישנים) על ידי לחיצה בעדינות את המזרק עד מחצית משטח abaxial של עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך זה כדי חדירת עלים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על צמחים ההסתננות בבית ירוק עם 24 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר הסתננו עלים 3 עד 4 ימים חדירת הפוסט (dpi). </li></ol> 3. טיהור virions BMV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נ benthamiana משאיר agroinfiltrated בתערובת המכילה את כל שלושת סוגי בר agrotransformants BMV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים עלים העלי מרגמה סטרילית עם נפח שווה (W / V) של BMV מיצוי המאגר (0.5 מ &#39;NaAc, 0.08 מ&#39; MgAc, pH 4.5 ונפח 1/100 של mercaptoethanol-β אשר יתווספו רק לפני השימוש) 3. על מנת למקסם את התשואה וירוס, מומלץ להוסיף חול מולבן (~ 0.5-1 גרם) המאפשרת הפרעה תא שחיקה קלה ויעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את תמצית עלי דרך 2-3 שכבות של בד מוסלין ולאסוף פרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב לטחון את החלק שמרו על בד מוסלין עם נפח זהה של מיצוי מאגר BMV למשקל ההתחלתי של החומר עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך סינון באמצעות בד מוסלין. פעולות אלה צריכות להתבצע ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון תסנין לצינור צנטריפוגות ומוסיפים נפח שווה של כלורופורם מראש ומצוננים, מערבולת (או שייק) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עד צבע ההשעיה הופך ירוק בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה פתרון תחליב במשך 15 דקות בסל&quot;ד 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השלב מימית ומערבבים במשך 30 דקות על stirrer מגנטי כדי להסיר כל כלורופורם שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לצינור ultracentrifuge סטרילית. </li><li&gt; ביסוד 1 מ&quot;ל. סוכרוז 10% (מוכן במאגר החילוץ וירוס) 3 כמו כרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת בסל&quot;ד 30,000 למשך 3 שעות ultracentrifuge Beckman ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant ו להשעות גלולה בהיקף הרצוי מאגר ההשעיה BMV (להכין מאגר ההשעיה לדלל חיץ BMV החילוץ כדי 1/10 עם מים מזוקקים סטריליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה virion מטוהרים חלקית משלב מעל נתונה 10-40% צנטריפוגה צפיפות סוכרוז שיפוע דקות 150 סל&quot;ד 28000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הלהקה וירוס באופן ידני או על ידי fractionator. הלהקה תופיע וירוס כחול תחת תאורה של אור לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון סוכרוז המכיל מדגם וירוס לפחות 50% עם חיץ ההשעיה וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת וירוס בדילול מלא המכיל פתרון סוכרוז במשך 3 שעות ב -30,000 סל&quot;ד ב ultracentrifuge Beckman ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של דבר להשעות את מטוהרים מאוד וירוס גלולה בהיקף הרצוי virלנו ההשעיה המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז virion (מ&quot;ג / מ&quot;ל) באמצעות ספקטרופוטומטר ב OD 260. </li></ol><img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" /> הערה: מבוסס על תוכן RNA, מקדם הכחדה של BMV הוא 5 4. <ol start="19" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת טוהר virions ידי הצגת תחת TEM (איור) </li></ol> 4. הכנת יחידות משנה חלבון קפסיד עבור במבחנה הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר 1x וירוס דיסוציאציה חיץ (0.5 מ &#39;CaCl 2, 50 מ&quot;מ טריס HCl, pH 7.5, 1.0 מ&quot;מ EDTA, 1.0 מ&quot;מ ו 0.5 מ&quot;מ DTT PMSF) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את קרום דיאליזה פי Sambrook ואח&#39; 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על הריכוז הנדרש מטוהרים וירוס לתוך שקית דיאליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים וירוס המכיל שקית דיאליזה לתוך מבחנה המכילה מאגר וירוס 1x דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס whilדואר ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף פתרון משקית הדיאליזה לאחר 24 שעות ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. זה יהיה להפריד RNA BMV מן virions הסתייגותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ו צנטריפוגות בסל&quot;ד 35,000 בצנטריפוגה Beckman במשך 3 שעות 4 ° C עד גלולה כל חלקיק בלתי ניתק את הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה הוא הכרחי כדי להסיר כל RNA virion מזהמים מן הסתייגותם יחידות משנה חלבון קפסיד. לשם כך, supernatant משלב 8 יש נתון לסיבוב נוסף של הלילה על והרכבה מחדש של יחידות משנה חלבון קפסיד מבלי להוסיף כל רנ&quot;א (RNA במאגר הרכבה 1x, ראה להלן) ואחריו צנטריפוגה במהירות גבוהה (30,000 סל&quot;ד למשך 3 שעות בבית 4 ° C) גלולה כל virions שנאספו. לאחר שלב זה והרכבה מחדש, את supernatant המכילים חלבון יחידות משנה המעיל יהיה ללא כל RNA מזהמים שיורית. עם זאת, כדי להבטיח זאת, מומלץ לבצע נוסף Vitro והרכבה מחדש רק עם חלבון יחידות משנה המעיל באמצעות RNA חיץ 1x הרכבה. אחרי לילה על והרכבה מחדש, הכנה חייבת להיות ללא virions התאספו (לוודא באמצעות TEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של חלבון קפסיד יחידות משנה על ידי מדידת OD ב 254 ו 280 ננומטר או בשיטות אחרות כגון assay ברדפורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע 12-15% SDS-PAGE ואחריו כתם המערבי על מנת לקבוע את שלמות יחידות משנה הסתייגותם חלבון קפסיד. </li></ol> 5. במבחנה הרכבה של RNA המכיל virions <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תעתיקי רנ&quot;א כדי להכין מחדש התאספו לתוך virions ולחשב את ריכוז 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים יחידות משנה חלבון קפסיד ו-RNA תעתיק ביחס של 1:05 (wt / wt) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את התערובת מעל ל שקית דיאליזה לאבטח כראוי כדי למנוע הדלפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 1,000 מ&quot;ל. של רנ&quot;א 1x הרכבה חיץ (50 mM NaCl, 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.2, 10 mM KCl: 5 מ&quot;מ MgCl 2, 1.0 מ&quot;מ DTT) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקית דיאליזה ובה תערובת תגובת נגד המאגר הרכבה 1x לתוך הכוס ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze התגובה הרכבה מחדש על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות על ידי ערבוב עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התערובת משקית הדיאליזה לאחר 24 שעות ומוסיפים 1.5 מ&quot;ל של חיץ הרכבה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התערובת דרך עמודה Centricon-100 על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה (2000 XG) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הטור פעם אחת עם 1.5 מ&quot;ל של חיץ הרכבה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב כביסה מעל פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, elute מחדש virions שנאספו על ידי צנטריפוגה ב g 10,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ריכוז virion ב OD 260 ננומטר. </li></ol> 6. ייצור של רוחות ויראלי אופטי (OVGs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Indocyanine ירוק (ICG) 8 לחלבון capsid מטוהרים ביחס לריכוז הרצוי (יחס משקל Indocyanine חלבון ירוק capsid בו גם בדו&quot;ח זה היה 01:10)<html> ד ומערבבים היטב על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze חלבון capsid פתרון ICG נגד המאגר הרכבה OVG (1 M NaCl, 50 מ&quot;מ NaAc: 1 mM EDTA, ו 1 mM DTT, pH4.8) בשעה 4 ° C למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לאסוף את הפתרון משקית הדיאליזה (12 גודל הנקבוביות kDa) ו צנטריפוגות בסל&quot;ד 90,000 במשך שעה 1 ב 4 ° C (איור ב &#39;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו להשעות גלולה במאגר ההשעיה BMV ידי vortexing או הפעלתו על ידי להשעות עצמו במאגר ההשעיה BMV לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המורפולוגיה של OVGs ידי TEM (איור ג&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ספיגת מ 240 ננומטר עד 950 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (קרי 50, וריאן Inc), נוכחות של ICG הוא אושר על ידי ספיגת פסגות חתימה סביב 700 ננומטר ו 790 ננומטר 8. (איור ד &#39;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פסגות לתקופה מוגבלת של הקרינה ICG ב ~~~HEAD=NNS 700 ננומטר ו -800 ננומטר ~~~HEAD=NNS ניתן לראות על עירור 620 ננומטר של פתרון OVG (איור ד &#39;) באמצעות spectrofluorometer (Fluorolog 3, Jobin-Yvon). </li></ol>_title &quot;&gt; 7. נציג תוצאות <img alt="תרשים" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> איור א TEM דמות צבעונית שלילי virions BMV מטוהרים מן נ צמחים benthamiana agroinfiltrated בתערובת של כל שלושת agroconstructs מסוג BMV בר (בר בקנה מידה = 100 ננומטר). <img alt="איור ב &#39;" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> איור ב &#39;גלולה של במבחנה התאספו ICG OVGs המכילים לאחר צנטריפוגה במהירות גבוהה. <img alt="תרשים ג" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> איור ג TEM דמות שלילי OVGs מוכתמים המכילים ICG (בר בקנה מידה = 100 ננומטר). <img alt="תרשים ד" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> איור ספיגת ד (למעלה) ואת הקרינה (התחתון) של ספקטרום OVGs. גל עירור המשמש OVG פליטת Wכ 620 ננומטר.

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

הגישה המוצגת כאן יכול Agroinfiltration נרחב לחול על מגוון רחב של וירוסים צמחיים. תכונה סימן ההיכר של גישה זו מסונכרן מסירת agroconstruct מרובות תאים באותו החיסרון העיקרי נפוץ הקשורים חיסון מכני בשימוש שגרתי של וירוסים צמחיים. In vivo ו במבחנה הרכבה באמצעות וירוס Brome פסיפס כמ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> MES מלחי נתרן </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Indocyanine ירוק </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Beckman ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> דגם: L8-70 </td></tr><tr><td> Centricon-100 עמודה </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> ספקטרופוטומטר </td><td> קארי 50, וריאן בע&quot;מ </td><td> פרק מספר 10068900 </td></tr><tr><td> Spectrofluorometer </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> חלק מספר FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

בשנת וירוסים עם פתוגניים חיובי במובן הגנום RNA לבני אדם, בעלי חיים וצמחים, encapsidation צאצאים לתוך virions בוגרת ויציבה היא השלב הקרדינל במהלך הקמת זיהום המארח נתון. כתוצאה מכך, המחקר של encapsidation מפענח מידע על הידע של מנגנון ויסות הרכבה וירוס כדי ליצור virions זיהומיות. מידע זה חיוני בגיבוש שיטות חדשניות של בלימת התפשטות וירוס לבקרת מחלות. Encapsidation וירוס ניתן ללמוד in vivo ו במבחנה. Encapsidation הגנום in vivo היא תהליך סלקטיבי פיקוח הדוק מעורבים באינטראקציות macromolecular ו המידור subcellular. לכן, ללמוד המוביל לנתח אירועים המקיף encapsidation וירוסים in vivo יספק ידע בסיסי כדי להבין כיצד וירוסים להתרבות ולהרכיב. לאחרונה encapsidation חוץ גופית נוצל למחקר בתחום של ביו IMAגינג ויישומים טיפוליים. שאינם עטופים וירוסים צמחיים לעמוד רחוק במיזם של ב encapsidation חוץ גופית של חומר זר טעון שלילית. וירוס Brome פסיפס (BMV), שאינם עטופים multicomponent פתוגניים RNA וירוס לצמחים, שימש כמערכת מודל לחקר הגנום אריזה in vivo ו במבחנה. מבחני encapsidation בצמחים ניקוטיאנה benthamiana, Agrobacterium בתיווך ביטוי חולף, מכנים agroinfiltration, היא טכניקה יעילה וחזקה למסירה מסונכרן וביטוי של רכיבים מרובים באותו התא. בגישה זו, ההשעיה של תאים Agrobacterium tumefaciens הנושאים פלסמיד וקטורים בינאריים הנושאים cDNAs של mRNAs desiredviral הוא שחדר עלה אינטר שטח withina באמצעות לא מתוחכמת יותר מזרק חד פעמי 1 מ&quot;ל (בלי מחט). תהליך זה גורם להעברת להוסיף לתוך ה-DNA בתאי צמח, T-DNAהכנס נותר זמני בגרעין והוא עיבד מכן על ידי פולימראז II המארח, מה שמוביל ביטוי חולף. תעתיק mRNA וכתוצאה מכך (כתרים ו polyadenylated) מיוצא ואז הציטופלסמה לתרגום. לאחר כ 24 עד 48 שעות של דגירה, קטעי עלים ההסתננות ניתן שנדגמו עבור ניתוחים ביוכימיים microscopyor. Agroinfiltration מאפשר מספר גדול (מאות עד אלפים) של תאים transfected להיות בעת ובעונה אחת. שכן encapsidation חוץ גופית, virions מטוהרים של BMV הם ניתק את החלבון capsid ידי dialyzing נגד ניתוק המכילה סידן כלוריד חיץ ואחריו הסרת RNA ובלתי הסתייגותם virions על ידי צנטריפוגה. הגנום יחידות משנה מרוקנים חלבון קפסיד הם מחדש אז עם הרכיבים הרצויים הגנום הנגיפי או שאינם נגיפיים רכיבים כגון indocyanine צבע.

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

דרך פשוטה, יעילה וחזקה כדי לסנכרן את המסירה של מרכיבים נגיפיים מרובים בתאי צמח באמצעות<em&gt; Agrobacterium</em&gt; בתיווך ביטוי חולף מתואר. גישה זו ניתנת ללימוד שכפול, encapsidation ואחריו<em&gt; במבחנה</em&gt; והרכבה מחדש של רכיבים שאינם נגיפיים לתוך הגנום מדולדל רוחות ויראלי אופטיים מתאימים עבור יישומים ביו.

פשוט וחזק In vivo ו במבחנה גישה ללימוד הרכבה וירוס

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

12.1K Views.  University of California, Riverside. דרך פשוטה, יעילה וחזקה כדי לסנכרן את המסירה של מרכיבים נגיפיים מרובים בתאי צמח באמצעות Agrobacterium בתיווך ביטוי חולף מתואר. גישה זו ניתנת ללימוד שכפול, encapsidation ואחריו במבחנה והרכבה מחדש של רכיבים שאינם נגיפיים לתוך הגנום מדולדל רוחות ויראלי אופטיים ?...

Video: Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways activated during cardiovascular pathologies are, however, limited by the lack of robust and physiologically relevant methods. In order to model pathological vascular events we have developed an in vitro assay for studying the interaction between endothelium and whole blood. The assay consists of primary human endothelial cells, which are placed in contact with human whole blood. The method utilizes native blood with no or very little anticoagulant, enabling study of delicate interactions between molecular and cellular components present in a blood vessel.
We investigated functionality of the assay by comparing activation of coagulation by different blood volumes incubated with or without human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Whereas a larger blood volume contributed to an increase in the formation of thrombin antithrombin (TAT) complexes, presence of HUVEC resulted in reduced activation of coagulation. Furthermore, we applied image analysis of leukocyte attachment to HUVEC stimulated with tumor necrosis factor (TNF&#945;) and found the presence of CD16+ cells to be significantly higher on TNF&#945; stimulated cells as compared to unstimulated cells after blood contact. In conclusion, the assay may be applied to study vascular pathologies, where interactions between the endothelium and the blood compartment are perturbed.

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

רומן<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...