המחברים מבקשים להודות כמה מחברי המעבדה לקבלת הצעות ערך שלהם בפיתוח agroinfiltration וב מבחני חוץ גופית הרכבה. עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם אוניברסיטת קליפורניה. מחקר זה נתמך חלקי על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע (CBET-1144237).

1. הצמח החומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוטיאנה צמחים benthamiana כדי לשמש assay encapsidation צריך להיות בשלב עלים 4 (צמחים בשבוע 3-4 כ ישנים). </li></ol> 2. משלוח וביטוי של רכיבים פונקציונליים הגנום הנגיפי לשתול תאים על ידי agroinfiltration <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: זן Agrobacterium (למשל EH 105 או GV 3101) מחסה pCass-BMV RNA 1, 2 ו BMV RNA RNA BMV 3 1,2 גדלים על אגר צלחות ליברות השלימו עם 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל של kanamycin (בוחר עבור וקטור pCASS) ו 100mg/ml של ריפאמפיצין (בוחר עבור Agrobacterium). הדגירה מתבצעת על 28 מעלות צלזיוס במשך יומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3: מושבה אחת מהצלחת ולחסן LB אגר לתוך 2 מ&quot;ל של מרק LB המכיל 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ו kanamycin 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל של ריפאמפיצין ליום 1 ב 28 מעלות צלזיוס מסלולית שאכר נקבע על 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4: מחסן 50 מ&quot;ל תוספת מרק LBאד עם 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו kanamycin 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של ריפאמפיצין, 10 mM MES-pH 5.6 ו 100 מ&quot;מ עם acetosyringone מ&quot;ל 1 של התרבות ב 250 מ&quot;ל של הבקבוק Erlenmeyer במשך 16 שעות ב 28 מעלות צלזיוס על מסלולית שאכר בסל&quot;ד 250 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5: מעבירים את התרבות (כאשר OD 600 הגיעו 1.0) על צינור רכס אלון או צינור סטרילי פלקון ו צנטריפוגות במשך 10 דקות בסל&quot;ד 5000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את גלולה ב 10 מ&quot;ל של 10 מ&quot;מ MgCl 2 ו צנטריפוגות במשך 10 דקות בסל&quot;ד 5000 ב 4 ° C, חזור על פעולה זו פעם נוספת על מנת להבטיח הסרה מלאה של אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות גלולה במאגר המכיל 10 מ&quot;ל 10 mM MgCl 2 ו 10 mM MES (pH 5.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את OD 600 עבור כל תרבות של BMV RNA 1, 2 ו-RNA-RNA 3 ולהתאים 0.1 OD 600 באמצעות 10 mM MgCl 2 ו 10mm MES (pH 5.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1 מ&quot;ל כל אחד בכל שלושת 0.1 OD 600 השעיות תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 מ&quot;מ של acetosyringone, לערבב GentLY ולשמור על תערובת באין מפריע בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את ההשעיה התרבות לתוך מ&quot;ל 1. מזרק ללא מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור ההשעיה התרבות מעל לצד abaxial של 2-3 היטב מורחבת עלי נ benthamiana (5 עלים, צמחים בשלב בשבוע 3-4 ישנים) על ידי לחיצה בעדינות את המזרק עד מחצית משטח abaxial של עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך זה כדי חדירת עלים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על צמחים ההסתננות בבית ירוק עם 24 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר הסתננו עלים 3 עד 4 ימים חדירת הפוסט (dpi). </li></ol> 3. טיהור virions BMV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נ benthamiana משאיר agroinfiltrated בתערובת המכילה את כל שלושת סוגי בר agrotransformants BMV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים עלים העלי מרגמה סטרילית עם נפח שווה (W / V) של BMV מיצוי המאגר (0.5 מ &#39;NaAc, 0.08 מ&#39; MgAc, pH 4.5 ונפח 1/100 של mercaptoethanol-β אשר יתווספו רק לפני השימוש) 3. על מנת למקסם את התשואה וירוס, מומלץ להוסיף חול מולבן (~ 0.5-1 גרם) המאפשרת הפרעה תא שחיקה קלה ויעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את תמצית עלי דרך 2-3 שכבות של בד מוסלין ולאסוף פרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב לטחון את החלק שמרו על בד מוסלין עם נפח זהה של מיצוי מאגר BMV למשקל ההתחלתי של החומר עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך סינון באמצעות בד מוסלין. פעולות אלה צריכות להתבצע ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון תסנין לצינור צנטריפוגות ומוסיפים נפח שווה של כלורופורם מראש ומצוננים, מערבולת (או שייק) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עד צבע ההשעיה הופך ירוק בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה פתרון תחליב במשך 15 דקות בסל&quot;ד 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השלב מימית ומערבבים במשך 30 דקות על stirrer מגנטי כדי להסיר כל כלורופורם שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לצינור ultracentrifuge סטרילית. </li><li&gt; ביסוד 1 מ&quot;ל. סוכרוז 10% (מוכן במאגר החילוץ וירוס) 3 כמו כרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת בסל&quot;ד 30,000 למשך 3 שעות ultracentrifuge Beckman ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant ו להשעות גלולה בהיקף הרצוי מאגר ההשעיה BMV (להכין מאגר ההשעיה לדלל חיץ BMV החילוץ כדי 1/10 עם מים מזוקקים סטריליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה virion מטוהרים חלקית משלב מעל נתונה 10-40% צנטריפוגה צפיפות סוכרוז שיפוע דקות 150 סל&quot;ד 28000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הלהקה וירוס באופן ידני או על ידי fractionator. הלהקה תופיע וירוס כחול תחת תאורה של אור לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון סוכרוז המכיל מדגם וירוס לפחות 50% עם חיץ ההשעיה וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת וירוס בדילול מלא המכיל פתרון סוכרוז במשך 3 שעות ב -30,000 סל&quot;ד ב ultracentrifuge Beckman ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של דבר להשעות את מטוהרים מאוד וירוס גלולה בהיקף הרצוי virלנו ההשעיה המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז virion (מ&quot;ג / מ&quot;ל) באמצעות ספקטרופוטומטר ב OD 260. </li></ol><img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" /> הערה: מבוסס על תוכן RNA, מקדם הכחדה של BMV הוא 5 4. <ol start="19" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת טוהר virions ידי הצגת תחת TEM (איור) </li></ol> 4. הכנת יחידות משנה חלבון קפסיד עבור במבחנה הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר 1x וירוס דיסוציאציה חיץ (0.5 מ &#39;CaCl 2, 50 מ&quot;מ טריס HCl, pH 7.5, 1.0 מ&quot;מ EDTA, 1.0 מ&quot;מ ו 0.5 מ&quot;מ DTT PMSF) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את קרום דיאליזה פי Sambrook ואח&#39; 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על הריכוז הנדרש מטוהרים וירוס לתוך שקית דיאליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים וירוס המכיל שקית דיאליזה לתוך מבחנה המכילה מאגר וירוס 1x דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס whilדואר ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף פתרון משקית הדיאליזה לאחר 24 שעות ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. זה יהיה להפריד RNA BMV מן virions הסתייגותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ו צנטריפוגות בסל&quot;ד 35,000 בצנטריפוגה Beckman במשך 3 שעות 4 ° C עד גלולה כל חלקיק בלתי ניתק את הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה הוא הכרחי כדי להסיר כל RNA virion מזהמים מן הסתייגותם יחידות משנה חלבון קפסיד. לשם כך, supernatant משלב 8 יש נתון לסיבוב נוסף של הלילה על והרכבה מחדש של יחידות משנה חלבון קפסיד מבלי להוסיף כל רנ&quot;א (RNA במאגר הרכבה 1x, ראה להלן) ואחריו צנטריפוגה במהירות גבוהה (30,000 סל&quot;ד למשך 3 שעות בבית 4 ° C) גלולה כל virions שנאספו. לאחר שלב זה והרכבה מחדש, את supernatant המכילים חלבון יחידות משנה המעיל יהיה ללא כל RNA מזהמים שיורית. עם זאת, כדי להבטיח זאת, מומלץ לבצע נוסף Vitro והרכבה מחדש רק עם חלבון יחידות משנה המעיל באמצעות RNA חיץ 1x הרכבה. אחרי לילה על והרכבה מחדש, הכנה חייבת להיות ללא virions התאספו (לוודא באמצעות TEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של חלבון קפסיד יחידות משנה על ידי מדידת OD ב 254 ו 280 ננומטר או בשיטות אחרות כגון assay ברדפורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע 12-15% SDS-PAGE ואחריו כתם המערבי על מנת לקבוע את שלמות יחידות משנה הסתייגותם חלבון קפסיד. </li></ol> 5. במבחנה הרכבה של RNA המכיל virions <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תעתיקי רנ&quot;א כדי להכין מחדש התאספו לתוך virions ולחשב את ריכוז 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים יחידות משנה חלבון קפסיד ו-RNA תעתיק ביחס של 1:05 (wt / wt) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את התערובת מעל ל שקית דיאליזה לאבטח כראוי כדי למנוע הדלפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 1,000 מ&quot;ל. של רנ&quot;א 1x הרכבה חיץ (50 mM NaCl, 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.2, 10 mM KCl: 5 מ&quot;מ MgCl 2, 1.0 מ&quot;מ DTT) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקית דיאליזה ובה תערובת תגובת נגד המאגר הרכבה 1x לתוך הכוס ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze התגובה הרכבה מחדש על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות על ידי ערבוב עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התערובת משקית הדיאליזה לאחר 24 שעות ומוסיפים 1.5 מ&quot;ל של חיץ הרכבה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התערובת דרך עמודה Centricon-100 על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה (2000 XG) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הטור פעם אחת עם 1.5 מ&quot;ל של חיץ הרכבה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב כביסה מעל פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, elute מחדש virions שנאספו על ידי צנטריפוגה ב g 10,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ריכוז virion ב OD 260 ננומטר. </li></ol> 6. ייצור של רוחות ויראלי אופטי (OVGs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Indocyanine ירוק (ICG) 8 לחלבון capsid מטוהרים ביחס לריכוז הרצוי (יחס משקל Indocyanine חלבון ירוק capsid בו גם בדו&quot;ח זה היה 01:10)<html> ד ומערבבים היטב על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze חלבון capsid פתרון ICG נגד המאגר הרכבה OVG (1 M NaCl, 50 מ&quot;מ NaAc: 1 mM EDTA, ו 1 mM DTT, pH4.8) בשעה 4 ° C למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לאסוף את הפתרון משקית הדיאליזה (12 גודל הנקבוביות kDa) ו צנטריפוגות בסל&quot;ד 90,000 במשך שעה 1 ב 4 ° C (איור ב &#39;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו להשעות גלולה במאגר ההשעיה BMV ידי vortexing או הפעלתו על ידי להשעות עצמו במאגר ההשעיה BMV לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המורפולוגיה של OVGs ידי TEM (איור ג&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ספיגת מ 240 ננומטר עד 950 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (קרי 50, וריאן Inc), נוכחות של ICG הוא אושר על ידי ספיגת פסגות חתימה סביב 700 ננומטר ו 790 ננומטר 8. (איור ד &#39;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פסגות לתקופה מוגבלת של הקרינה ICG ב ~~~HEAD=NNS 700 ננומטר ו -800 ננומטר ~~~HEAD=NNS ניתן לראות על עירור 620 ננומטר של פתרון OVG (איור ד &#39;) באמצעות spectrofluorometer (Fluorolog 3, Jobin-Yvon). </li></ol>_title &quot;&gt; 7. נציג תוצאות <img alt="תרשים" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> איור א TEM דמות צבעונית שלילי virions BMV מטוהרים מן נ צמחים benthamiana agroinfiltrated בתערובת של כל שלושת agroconstructs מסוג BMV בר (בר בקנה מידה = 100 ננומטר). <img alt="איור ב &#39;" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> איור ב &#39;גלולה של במבחנה התאספו ICG OVGs המכילים לאחר צנטריפוגה במהירות גבוהה. <img alt="תרשים ג" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> איור ג TEM דמות שלילי OVGs מוכתמים המכילים ICG (בר בקנה מידה = 100 ננומטר). <img alt="תרשים ד" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> איור ספיגת ד (למעלה) ואת הקרינה (התחתון) של ספקטרום OVGs. גל עירור המשמש OVG פליטת Wכ 620 ננומטר.

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

הגישה המוצגת כאן יכול Agroinfiltration נרחב לחול על מגוון רחב של וירוסים צמחיים. תכונה סימן ההיכר של גישה זו מסונכרן מסירת agroconstruct מרובות תאים באותו החיסרון העיקרי נפוץ הקשורים חיסון מכני בשימוש שגרתי של וירוסים צמחיים. In vivo ו במבחנה הרכבה באמצעות וירוס Brome פסיפס כמ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> MES מלחי נתרן </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Indocyanine ירוק </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Beckman ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> דגם: L8-70 </td></tr><tr><td> Centricon-100 עמודה </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> ספקטרופוטומטר </td><td> קארי 50, וריאן בע&quot;מ </td><td> פרק מספר 10068900 </td></tr><tr><td> Spectrofluorometer </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> חלק מספר FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

בשנת וירוסים עם פתוגניים חיובי במובן הגנום RNA לבני אדם, בעלי חיים וצמחים, encapsidation צאצאים לתוך virions בוגרת ויציבה היא השלב הקרדינל במהלך הקמת זיהום המארח נתון. כתוצאה מכך, המחקר של encapsidation מפענח מידע על הידע של מנגנון ויסות הרכבה וירוס כדי ליצור virions זיהומיות. מידע זה חיוני בגיבוש שיטות חדשניות של בלימת התפשטות וירוס לבקרת מחלות. Encapsidation וירוס ניתן ללמוד in vivo ו במבחנה. Encapsidation הגנום in vivo היא תהליך סלקטיבי פיקוח הדוק מעורבים באינטראקציות macromolecular ו המידור subcellular. לכן, ללמוד המוביל לנתח אירועים המקיף encapsidation וירוסים in vivo יספק ידע בסיסי כדי להבין כיצד וירוסים להתרבות ולהרכיב. לאחרונה encapsidation חוץ גופית נוצל למחקר בתחום של ביו IMAגינג ויישומים טיפוליים. שאינם עטופים וירוסים צמחיים לעמוד רחוק במיזם של ב encapsidation חוץ גופית של חומר זר טעון שלילית. וירוס Brome פסיפס (BMV), שאינם עטופים multicomponent פתוגניים RNA וירוס לצמחים, שימש כמערכת מודל לחקר הגנום אריזה in vivo ו במבחנה. מבחני encapsidation בצמחים ניקוטיאנה benthamiana, Agrobacterium בתיווך ביטוי חולף, מכנים agroinfiltration, היא טכניקה יעילה וחזקה למסירה מסונכרן וביטוי של רכיבים מרובים באותו התא. בגישה זו, ההשעיה של תאים Agrobacterium tumefaciens הנושאים פלסמיד וקטורים בינאריים הנושאים cDNAs של mRNAs desiredviral הוא שחדר עלה אינטר שטח withina באמצעות לא מתוחכמת יותר מזרק חד פעמי 1 מ&quot;ל (בלי מחט). תהליך זה גורם להעברת להוסיף לתוך ה-DNA בתאי צמח, T-DNAהכנס נותר זמני בגרעין והוא עיבד מכן על ידי פולימראז II המארח, מה שמוביל ביטוי חולף. תעתיק mRNA וכתוצאה מכך (כתרים ו polyadenylated) מיוצא ואז הציטופלסמה לתרגום. לאחר כ 24 עד 48 שעות של דגירה, קטעי עלים ההסתננות ניתן שנדגמו עבור ניתוחים ביוכימיים microscopyor. Agroinfiltration מאפשר מספר גדול (מאות עד אלפים) של תאים transfected להיות בעת ובעונה אחת. שכן encapsidation חוץ גופית, virions מטוהרים של BMV הם ניתק את החלבון capsid ידי dialyzing נגד ניתוק המכילה סידן כלוריד חיץ ואחריו הסרת RNA ובלתי הסתייגותם virions על ידי צנטריפוגה. הגנום יחידות משנה מרוקנים חלבון קפסיד הם מחדש אז עם הרכיבים הרצויים הגנום הנגיפי או שאינם נגיפיים רכיבים כגון indocyanine צבע.

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

דרך פשוטה, יעילה וחזקה כדי לסנכרן את המסירה של מרכיבים נגיפיים מרובים בתאי צמח באמצעות<em&gt; Agrobacterium</em&gt; בתיווך ביטוי חולף מתואר. גישה זו ניתנת ללימוד שכפול, encapsidation ואחריו<em&gt; במבחנה</em&gt; והרכבה מחדש של רכיבים שאינם נגיפיים לתוך הגנום מדולדל רוחות ויראלי אופטיים מתאימים עבור יישומים ביו.

פשוט וחזק In vivo ו במבחנה גישה ללימוד הרכבה וירוס

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

12.2K Views.  University of California, Riverside. דרך פשוטה, יעילה וחזקה כדי לסנכרן את המסירה של מרכיבים נגיפיים מרובים בתאי צמח באמצעות Agrobacterium בתיווך ביטוי חולף מתואר. גישה זו ניתנת ללימוד שכפול, encapsidation ואחריו במבחנה והרכבה מחדש של רכיבים שאינם נגיפיים לתוך הגנום מדולדל רוחות ויראלי אופטיים ?...

Video: Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Bioengineering

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and assay development in virology. The RNA template of nonsegmented negative-sense (NNS) RNA viruses, such as the respiratory syncytial virus (RSV), is not an RNA molecule alone but rather a nucleoprotein (N) encapsidated ribonucleoprotein complex. Despite the importance of the authentic RNA template, the generation and assembly of such a ribonucleoprotein complex remain sophisticated and require in-depth elucidation. The main challenge is that the overexpressed RSV N binds non-specifically to cellular RNAs to form random nucleocapsid-like particles (NCLPs). Here, we established a protocol to obtain RNA-free N (N0) first by co-expressing N with a chaperone phosphoprotein (P), then assembling N0 with RNA oligos with the RSV-specific RNA sequence to obtain virus-specific nucleocapsids (NCs). This protocol shows how to overcome the difficulty in the preparation of this traditionally challenging viral ribonucleoprotein complex.

For in-depth mechanistic analysis of the respiratory syncytial virus (RSV) RNA synthesis, we report a protocol of utilizing the chaperone phosphoprotein (P) for coexpression of the RNA-free nucleoprotein (N0) for subsequent in vitro assembly of the virus-specific nucleocapsids (NCs).

יצירה והרכבה של נוקלאוקפסידים ספציפיים לווירוסים של הנגיף הסינכרוני הנשימתי

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Biochemistry

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It is extremely desirable to pair high-resolution cryo-EM information with dynamic observations as many events occur at rapid timescales - in the millisecond range or faster. Improved knowledge of flexible structures can also assist in the design of novel reagents to combat emerging pathogens, such as SARS-CoV-2. More importantly, viewing biological materials in a fluid environment provides a unique glimpse of their performance in the human body. Presented here are newly developed methods to investigate the nanoscale properties of virus assemblies in liquid and vitreous ice. To accomplish this goal, well-defined samples were used as model systems. Side-by-side comparisons of sample preparation methods and representative structural information are presented. Sub-nanometer features are shown for structures resolved in the range of ~3.5-&#197;-10 &#197;. Other recent results that support this complementary framework include dynamic insights of vaccine candidates and antibody-based therapies imaged in liquid. Overall, these correlative applications advance our ability to visualize molecular dynamics, providing a unique context for their use in human health and disease.

Here protocols are described to prepare virus assemblies suitable for liquid-EM and cryo-EM analysis at the nanoscale using transmission electron microscopy.

קידום הדמיה ברזולוציה גבוהה של מכלולי וירוסים בנוזלים ובקרח

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Construction of Adenoviral Vectors using DNA Assembly Technology

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an adenoviral vector by manipulating the genomic DNA of wild-type HAdV-7 by using a DNA assembly method. First, an infectious clone of HAdV-7, pKan-Ad7, was generated by fusing the viral genomic DNA with a PCR product from plasmid backbone, comprising of the kanamycin-resistant gene and the origin of replication (Kan-Ori), through DNA assembly. This was done by designing a pair of PCR primers, that contained ~25 nucleotides of the terminal sequence of HAdV-7 inverted terminal repeat (ITR) at the 5' end, a non-cutter restriction enzyme site for HAdV-7 genome in the middle, and a template-specific sequence for PCR priming at the 3' end. Second, an intermediate plasmid-based strategy was employed to replace the E3 region with transgene-expressing elements in the infectious clone to generate an adenoviral vector. Briefly, pKan-Ad7 was digested with dual-cutter restriction enzyme Hpa I, and the fragment containing the E3 region was ligated to another PCR product of plasmid backbone by Gibson assembly to construct an intermediate plasmid pKan-Ad7HpaI. For convenience, restriction-assembly was used to designate the plasmid cloning method of combined restriction digestion and assembly. Using restriction-assembly, the E3 genes in pKan-Ad7HpaI was replaced with a green fluorescent protein (GFP) expression cassette, and the modified E3 region was released from the intermediate plasmid and restored to the infectious clone to generate an adenoviral plasmid pKAd7-E3GFP. Finally, pKAd7-E3GFP was linearized by Pme I digestion and used to transfect HEK293 packaging cells to rescue recombinant HAdV-7 virus. To conclude, a DNA assembly-based strategy was introduced here for constructing adenoviral vectors in general laboratories of molecular biology without the need of specialized materials and instruments.

In this study, an infectious clone of human adenovirus type 7 (HAdV-7) was constructed, and an E3-deleted HAdV-7 vector system was established by modifying the infectious clone. This strategy used here can be generalized to make gene transfer vectors from other wild-type adenoviruses.

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...