著者らは、agroinfiltrationの開発およびin vitroアセンブリアッセイにおけるそれらの貴重な提案のための研究室のいくつかのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、カリフォルニア大学からの助成金によって賄われていた。本研究では、国立科学財団（CBET-1144237）からの助成金によって部分でサポートされていました。

1。植物性の素材<ol><li>キャプシドアッセイで使用されるタバコベンサミ植物は、4葉期（約3-4週齢の植物）であるべきである。 </li></ol> 2。 agroinfiltrationによる植物細胞への機能的なウイルスゲノムのコンポーネントの配信と表現<ol><li> 1日目：アグロバクテリウム株（例えば、EH 105またはGV 3101）pCass-BMV RNA 1、BMV RNA 2とBMV RNA 3 1,2を保有する 50のカナマイシンmg / mlのを補ったLB寒天プレート上で増殖されている（ために選択します。 pCASSベクトル）とリファンピシンの100mg/ml（）は、アグロバクテリウムのために選択します。インキュベーションは、二日間28℃で実施されています。 </li><li> 3日目：カナマイシン50 mg / mlおよび28℃で1日リファンピシン100 mg / mlの250℃RPMに設定オービタルシェーカーでCを含有するLB培地2 mlのLB寒天プレートから単一コロニーを接種。 </li><li> 4日目：LBブロスサプリメントの50ミリリットルを接種カナマイシン50 mg / mlおよびリファンピシン、10mMのMES pHは5.6と28で16時間の三角フラスコ250mlの文化の1ミリリットル〜250 RPMでオービタルシェーカー上でCと100mMのアセトシリンゴンの100 mg / mlのとED 。 </li><li> 5日目：4℃で5000rpmで10分間オークリッジ管または滅菌ファルコンチューブと遠心分離機に（OD 600が 1.0に達したとき）文化を転送</li><li>このステップの抗生物質の完全な除去を確実にする1つのより多くの時間を繰り返して、4℃で5000rpmで10分間、10mMのMgCl 2、遠心10mlにペレットを溶解する。 </li><li> 10mMのMgCl 2および10mM MES（pHは5.6）を含む10 mlのバッファーでペレットを一時停止します。 </li><li> BMV RNA 1、2、RNA RNA 3の各カルチャのOD 600を測定し、10mMのMgCl 2と10mMのMESを液（pH 5.6）を使用して、0.1 OD 600に調整します。 </li><li>各3つのすべての0.1 OD 600の培養懸濁液1ミリリットルを混ぜる。 </li><li>アセトシリンゴン、ミックスゲント100mMのを追加します。LY、3時間室温で混合物が邪魔されずに保持します。 </li><li> 1mlに培養懸濁液を描画します。針なしの注射器。 </li><li> N. 2-3よく展開葉の背軸側に上記培養懸濁液を浸透させるそっと葉の背軸面の半分に注射器を押すことによって、 ベンサミ （5葉期、3から4週齢の植物）。 </li><li>他の葉に浸潤この手順を繰り返します。 </li><li> 24℃で緑色の家に浸透植物を保つ</li><li>浸透の収穫は3から4日後の浸潤を（dpi）のままになります。 </li></ol> 3。 BMVビリオンの精製<ol><li> Nを収集するベンサミはすべての 3つの野生型BMVのagrotransformantsを含む混合物でagroinfiltrated残します。 </li><li> 0.08 M MgAc、使用直前に追加されるβ-メルカプトエタノールのpHは4.5と1/100量、BMV抽出バッファー（0.5 M NAAC等量の（w / v）の滅菌乳鉢と乳棒の葉を挽く3）。ウイルス収量を最大にするために、それは研削容易かつ効率的に細胞破壊を促進する酸洗浄した砂（〜0.5〜1グラム）を追加することをお勧めします。 </li><li>モスリン布の2-3層を介して葉エキスをフィルタリングし、突風を収集します。 </li><li>再び葉材の初期重量にBMV抽出緩衝液と等量のモスリン布上に保持された部分を挽く。 </li><li>モスリン布を使用してろ過手順を繰り返します。これらのステップは4℃で行われるべきである</li><li>遠心管にろ液を移し、懸濁液の色はライトグリーンに変わりまで室温で5分間予備冷却し、クロロホルムと渦の等量（またはシェイク）を追加します。 </li><li> 4℃、12,000 rpmで15分間乳化した溶液を遠心分離℃に</li><li>水相を収集し、残留クロロホルムを除去するためにマグネチックスターラーで30分間攪拌する。 </li><li>滅菌遠心チューブに懸濁液を移す。 </li><li&gt;アンダー1ミリリットル。クッションの3として10％ショ糖（ウイルス抽出用緩衝液で調製）。 </li><li> 4でベックマン超遠心機で3時間、30,000 rpmで遠心分離℃、 </li><li>上清を捨て、（滅菌蒸留水で1/10に懸濁バッファー希釈BMV抽出緩衝液を調製するために）BMV懸濁バッファーの目的のボリュームでペレットを中断します。 </li><li>上記の手順から部分的に精製されたビリオンの準備は、4℃で28000 rpmで150分間百分の10から40のショ糖密度勾配遠心分離に供される</li><li>手動で、または分留によるウイルスバンドを収集します。ウイルスバンドは白色光照明の下で青で表示されます。 </li><li>ウイルス懸濁液バッファを持つウイルスのサンプルを少なくとも50％を含むショ糖溶液を希釈します。 </li><li> 4でベックマン超遠心で30,000 rpmで3時間のショ糖溶液を含む希釈ウイルス℃を遠心分離</li><li>最後に、VIRの所望の量で高度に精製されたウイルスペレットを一時停止する私達は、懸濁バッファーを。 </li><li> OD 260で分光光度計を用いてビリオン（mg / ml）の濃度を測定します。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" />注意：RNAの内容に基づいて、BMVの吸光係数は5 4です。 <ol start="19"><li> TEM下に表示することにより、ウイルス粒子の純度を確認します（図A） </li></ol> 4。 in vitroでアセンブリのためのキャプシドタンパク質サブユニットの準備<ol><li> 5 1Xウイルス解離バッファー（; 50mMトリスHCl、pH7.5で; 1.0mMのEDTA 1.0mMのDTTおよび0.5mM PMSF、0.5MのCaCl 2）の1リットルを準備します。 </li><li> Sambrook ら 6に記載の透析膜を準備します。 </li><li>透析バッグにウイルスの精製に必要な濃度を分注する。 </li><li> 1Xウイルス解離緩衝液を含むビーカーにウイルスを含む透析バッグを置きます。 </li><li> 4°C薬用で24時間透析eは、攪拌した。 </li><li> 4℃で15分間12,000 xgで24時間遠心した後、透析バッグから溶液を回収℃にこれは解離ビリオンからBMV RNAを分離します。 </li><li> 4ペレット°Cの任意の非解離ウイルス粒子で3時間ベックマン遠心機で35,000 rpmで遠心上清を収集します。 </li><li>上清を収集します。 </li><li>この段階では、解離したキャプシドタンパク質のサブユニットから任意の汚染ビリオンRNAを除去するために不可欠です。これを行うには、ステップ8から上清を高速遠心（3時間で30,000 rpmで、続いて任意のRNAを（RNA 1Xアセンブリバッファには、以下を参照してください）​​を加えることなく、キャプシドタンパク質サブユニットの再構築上の夜の別のラウンドを行うべきである4℃）、ペレット、任意の組み立てビリオンへ。この再構築ステップの後、上清を含有するコ​​ートタンパク質のサブユニットは、任意の残留汚染RNAの自由でしょう。しかし、これを確実にするためには、vで、追加を実行することをお勧めしますRNA 1Xアセンブリバッファを使用した場合にのみコートタンパク質サブユニットと再構築itro。再構築上の夜の後、準備が（TEMを使用して確認）組み立てられたビリオンの自由でなければなりません。 </li><li> OD 254および280 nmで測定することにより、またはそのようなブラッドフォードアッセイのような他の方法により、キャプシドタンパク質サブユニットの濃度を決定します。 </li><li> 12から15パーセント解離キャプシドタンパク質サブユニットの整合性を決定するためにウェスタンブロット、続いてSDS-PAGEを行います。 </li></ol> （5）RNA の in vitroアセンブリでビリオンを含む<ol><li>ビリオンに再組み立てするRNA転写物を調製し、濃度7を計算します。 </li><li>カプシドタンパク質のサブユニットを混在させると1:5（wt / wt）の5の比率で転写RNAの。 </li><li>透析バッグと、任意のリークを防ぐため、適切にセキュリティで保護された上記混合物を分注する。 </li><li>千ミリリットルを準備します。 5 RNA 1Xアセンブリバッファ（; 50mMトリス-HCl、pH7.2で; 10mMのKClを5mMのMgCl 2、1.0mMのDTT 50mMのNaCl）の。 </li><li>ビーカーに1Xアセンブリ緩衝液に対して反応混合物を含有する透析バッグを置いて、かき混ぜる。 </li><li>穏やかに撹拌により24時間4℃で再アセンブリ反応を透析。 </li><li> 24時間後に透析バッグから物を収集し、RNAアセンブリバッファの1.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 30分間低速（2,000×g）で遠心分離することによってセントリコン-100カラムを介して、この混合物を渡します。 </li><li> 30分間、4℃でアセンブリバッファの1.5ミリリットルで一回カラムを洗浄します。 </li><li>二回上記洗浄工程を繰り返します。 </li><li>最後に、4℃で10,000 gで遠心分離して再組み立てビリオンを溶出℃を5分間。 </li><li> OD 260 nmでビリオン濃度を推定する。 </li></ol> 6。光学ウイルスゴーストの作製（OVGs） <ol><li>所望の濃度比で精製されたキャプシドタンパク質（このレポートで使用されているインドシアニングリーンとキャプシドタンパク質の重量比が1:10であった）にグリーン（ICG）8インドシアニン追加<html> dは、ピペッティングにより混和します。 </li><li>キャプシドタンパク質を透析とOVGアセンブリバッファ（1 M NaCl及び1mMのDTT、pH4.8、50 mMのNAAC; 1mMのEDTA）に対してソリューションをICGの4℃で2​​4時間C。 </li><li> 24時間後、4℃で1時間90,000 rpmで透析バッグ（12 kDaの孔の大きさ）と、遠心機から溶液を回収°C（図B） </li><li> 4℃でボルテックスまたはそれが一晩BMVの懸濁緩衝液中でそれ自体で中断することにより、上清を除去し、BMV懸濁バッファーに懸濁し</li><li> TEMによるOVGs（図C）の形態を確認します。 </li><li> 240 nmから分光光度計（ローリー50、バリアン社製）を用いて950 nmの吸光度を測定し、ICGの存在は、700 nmと790 nmの約8署名の吸光度のピークが確認された。 （図D） </li><li> 〜700 nmと〜800 nmでの典型的なICG蛍光ピークは、分光光度計を使用してOVG液の620 nmの励起（図D）（Fluorolog 3、ジョバンイボン - ）に見ることができます。 </li></ol>_title &quot;&gt; 7。代表的な結果<img alt="図" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> N.から精製されたネガティブ染色BMVビリオンの図A. TEM像ベンサミ植物は、すべての3つの野生型BMVのagroconstructs（スケールバー= 100 nm）の混合物でagroinfiltrated。 <img alt="図B" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> in vitroでの図Bペレットは、高速遠心分離後に含むOVGs ICGの組み立て。 <img alt="図C" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> ネガティブ染色ICGの含むOVGsの図CのTEM像（スケールバー= 100 nm）を。 <img alt="図D" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> OVGs 図D.吸光度（上）および蛍光（下）スペクトル。 OVG放出wに対して使用される励起波長620 nmの。

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここに提示Agroinfiltrationのアプローチは、広く植物ウイルスの広い範囲に適用することができます。このアプローチの特徴機能は同じ細胞一般に植物ウイルスの日常的に使用される機械的な接種に関連付けられている主な欠点に複数のagroconstructの配信を同期化されています。in vivoおよび in vitroのアセンブリの研究ではモデルとしてブロムモザイクウイルスを用いて効率的?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> MESのナトリウム塩</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M2993 </td></tr><tr><td>インドシアニングリーン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> I2633 </td></tr><tr><td>ベックマン超遠心</td><td>ベックマン·コールター</td><td>モデル：L8-70M </td></tr><tr><td>セントリコン-100カラム</td><td>ミリポア</td><td> YM-100 </td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>キャリー50、バリアン社</td><td>部品番号 10068900 </td></tr><tr><td>蛍光光度計</td><td> Fluorolog 3、ジョバンイボン - 。 </td><td>部品番号FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

ヒト、動物や植物、子孫カプシド成熟し安定したウイルス粒子へのプラスセンスRNAゲノム病原性のウイルスで、特定のホストの感染の確立時に基本的な位相である。したがって、キャプシドの研究では、ノウハウ感染性ウイルス粒子を形成するためにウイルスのアセンブリを制御するメカニズムのに関する情報を解読する。このような情報はウイルスの拡散や病気のコントロールを抑制する新規の方法を定式化する際に不可欠である。ウイルスのキャプシドは 、in vivo および in vitro で研究することができる。 in vivoでのゲノムのカプシドは、巨大分子の相互作用と細胞内局在を含む高度に調節の選択のプロセスです。したがって、in vivoでのウイルスのキャプシドを包含するイベントを分析するために主要な研究は、ウイルスが増殖し、組み立てる方法を理解する基本的な知識を提供するであろう。最近のin vitroカプシドに医学IMAの分野で研究のために利用されていますパトンと治療への応用。非エンベロープ植物ウイルスは、負に帯電した異物の in vitro でのキャプシドでの合弁会社ではるかに先に立っている。ブロムモザイクウイルス（BMV）、植物への非エンベロープ多RNAウイルスの病原性は、in vivoおよび in vitro におけるゲノムパッケージングを研究するためのモデル系として使用されています。 ニコチアナベンサミプラントのカプシド形成アッセイのために、 アグロバクテリウム媒介一過性の発現は、agroinfiltrationなどを参照して同じセルに複数のコンポーネントの同期配信および発現のための効率的で堅牢な技術です。このアプローチでは、desiredviral mRNAのcDNAを運ぶバイナリープラスミドベクターを有するアグロバクテリウムツメファシエンスの細胞の懸濁液を1 mlの使い捨て注射器（針なし）よりも洗練されたものを使用していない間隙withina葉に浸透されています。植物細胞へのDNA挿入物の転送では、このプロセスの結果、T-DNAインサートは、核内に一時的に留まり、その後ホストポリメラーゼIIによって転写される、一過性の発現につながる。得られたmRNA転写物は（キャップ​​とポリアデニル化）し、翻訳の質に輸出されています。インキュベーションは、約24から48時間後、浸潤葉のセクションはmicroscopyor生化学分析のためにサンプリングすることができます。 Agroinfiltration同時にトランスフェクトされる細胞の大量（数百から数千個）を許可します。 in vitroでのキャプシドのために、BMVの精製ウイルス粒子を遠心分離によりRNAを除去すると非解離のビリオンに続く解離緩衝液を含む塩化カルシウムに対して透析によってキャプシドタンパク質に解離しています。ゲノム枯渇キャプシドタンパク質のサブユニットは、希望するウイルスゲノムのコンポーネントまたはそのような色素インドシアニンなどの非ウイルス性のコンポーネントで組み立てられます。

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Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

を経由して植物細胞に複数のウイルス成分の配信を同期化する、シンプルで効率的かつ強力な方法<em&gt;アグロバクテリウム</em&gt;媒介一過性の発現が記載されている。このアプローチは、レプリケーションを研究するための従順で、カプシドは続く<em&gt; in vitroで</em&gt;再構築の非ウイルス性成分のゲノムには、生物医学アプリケーションに適した光学ウイルスの幽霊を枯渇。

シンプルで堅牢な<emin vivoでの>と in vitroで</emウイルスの組み立てを学ぶための>アプローチ

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

12.2K ビュー.  University of California, Riverside. を経由して植物細胞に複数のウイルス成分の配信を同期化する、シンプルで効率的かつ強力な方法アグロバクテリウム媒介一過性の発現が記載されている。このアプローチは、レプリケーションを研究するための従順で、カプシドは続く in vitroで再構築の非ウイルス性成分のゲノムには、生物医学アプリケーションに適した光学ウ?...

ビデオ: Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;シングルウイルスゲノミクス&#39;を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

免疫・感染学

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

その時 液体中の生物学的集合体のTEM

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

生物工学

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and assay development in virology. The RNA template of nonsegmented negative-sense (NNS) RNA viruses, such as the respiratory syncytial virus (RSV), is not an RNA molecule alone but rather a nucleoprotein (N) encapsidated ribonucleoprotein complex. Despite the importance of the authentic RNA template, the generation and assembly of such a ribonucleoprotein complex remain sophisticated and require in-depth elucidation. The main challenge is that the overexpressed RSV N binds non-specifically to cellular RNAs to form random nucleocapsid-like particles (NCLPs). Here, we established a protocol to obtain RNA-free N (N0) first by co-expressing N with a chaperone phosphoprotein (P), then assembling N0 with RNA oligos with the RSV-specific RNA sequence to obtain virus-specific nucleocapsids (NCs). This protocol shows how to overcome the difficulty in the preparation of this traditionally challenging viral ribonucleoprotein complex.

For in-depth mechanistic analysis of the respiratory syncytial virus (RSV) RNA synthesis, we report a protocol of utilizing the chaperone phosphoprotein (P) for coexpression of the RNA-free nucleoprotein (N0) for subsequent in vitro assembly of the virus-specific nucleocapsids (NCs).

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

生化学

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It is extremely desirable to pair high-resolution cryo-EM information with dynamic observations as many events occur at rapid timescales - in the millisecond range or faster. Improved knowledge of flexible structures can also assist in the design of novel reagents to combat emerging pathogens, such as SARS-CoV-2. More importantly, viewing biological materials in a fluid environment provides a unique glimpse of their performance in the human body. Presented here are newly developed methods to investigate the nanoscale properties of virus assemblies in liquid and vitreous ice. To accomplish this goal, well-defined samples were used as model systems. Side-by-side comparisons of sample preparation methods and representative structural information are presented. Sub-nanometer features are shown for structures resolved in the range of ~3.5-&#197;-10 &#197;. Other recent results that support this complementary framework include dynamic insights of vaccine candidates and antibody-based therapies imaged in liquid. Overall, these correlative applications advance our ability to visualize molecular dynamics, providing a unique context for their use in human health and disease.

Here protocols are described to prepare virus assemblies suitable for liquid-EM and cryo-EM analysis at the nanoscale using transmission electron microscopy.

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Construction of Adenoviral Vectors using DNA Assembly Technology

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an adenoviral vector by manipulating the genomic DNA of wild-type HAdV-7 by using a DNA assembly method. First, an infectious clone of HAdV-7, pKan-Ad7, was generated by fusing the viral genomic DNA with a PCR product from plasmid backbone, comprising of the kanamycin-resistant gene and the origin of replication (Kan-Ori), through DNA assembly. This was done by designing a pair of PCR primers, that contained ~25 nucleotides of the terminal sequence of HAdV-7 inverted terminal repeat (ITR) at the 5' end, a non-cutter restriction enzyme site for HAdV-7 genome in the middle, and a template-specific sequence for PCR priming at the 3' end. Second, an intermediate plasmid-based strategy was employed to replace the E3 region with transgene-expressing elements in the infectious clone to generate an adenoviral vector. Briefly, pKan-Ad7 was digested with dual-cutter restriction enzyme Hpa I, and the fragment containing the E3 region was ligated to another PCR product of plasmid backbone by Gibson assembly to construct an intermediate plasmid pKan-Ad7HpaI. For convenience, restriction-assembly was used to designate the plasmid cloning method of combined restriction digestion and assembly. Using restriction-assembly, the E3 genes in pKan-Ad7HpaI was replaced with a green fluorescent protein (GFP) expression cassette, and the modified E3 region was released from the intermediate plasmid and restored to the infectious clone to generate an adenoviral plasmid pKAd7-E3GFP. Finally, pKAd7-E3GFP was linearized by Pme I digestion and used to transfect HEK293 packaging cells to rescue recombinant HAdV-7 virus. To conclude, a DNA assembly-based strategy was introduced here for constructing adenoviral vectors in general laboratories of molecular biology without the need of specialized materials and instruments.

In this study, an infectious clone of human adenovirus type 7 (HAdV-7) was constructed, and an E3-deleted HAdV-7 vector system was established by modifying the infectious clone. This strategy used here can be generalized to make gene transfer vectors from other wild-type adenoviruses.

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ

要約

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この動画の章

'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

その時液体中の生物学的集合体のTEM

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

アセンブリおよびプロトタイプフォーミーウイルス Intasomes の精製

Construction of Adenoviral Vectors using DNA Assembly Technology

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ

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'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

その時 液体中の生物学的集合体のTEM

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

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単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

その時液体中の生物学的集合体のTEM

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