Los autores desean agradecer a varios miembros del laboratorio por sus valiosas sugerencias en el desarrollo de agroinfiltración y en ensayos in vitro de montaje. Este trabajo fue financiado por una beca de la Universidad de California. Este estudio fue apoyado en parte por una beca de la National Science Foundation (CBET-1144237).

1. Material vegetal <ol><li> Plantas de Nicotiana benthamiana para ser utilizados en el ensayo de encapsidación debe estar en fase 4 hojas (plantas semana aproximadamente 3-4 de edad). </li></ol> 2. Entrega y expresión de los componentes funcionales del genoma viral para sembrar las células por agroinfiltración <ol><li> Día 1: La cepa de Agrobacterium (por ejemplo, EH 105 o GV 3101) que alberga el ARN pCass-BMV 1, 2 y ARN BMV BMV ARN 3 1,2 se cultivan en placas de agar LB suplementadas con 50 mg / ml de kanamicina (selecciona para el vector pCASS) y 100mg/ml de rifampicina (selecciona para el Agrobacterium). La incubación se lleva a cabo a 28 ° C durante dos días. </li><li> Día 3: Se inoculan colonia única de la placa de agar LB en 2 ml de caldo LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina y 100 mg / ml de rifampicina durante 1 día a 28 ° C en un agitador orbital fijado en 250 RPM. </li><li> Día 4: Se inoculan 50 ml de caldo LB el suplementoed con 50 mg / ml de kanamicina y 100 mg / ml de rifampicina, MES 10 mM pH 5,6 y 100 mM acetosiringona con un ml de cultivo en 250 ml de un matraz Erlenmeyer de 16 horas a 28 ° C en un agitador orbital a 250 rpm . </li><li> Día 5: Traslado de la cultura (OD 600, cuando llegó a 1,0) a un tubo de Oak Ridge o estéril tubo Falcon y se centrifuga durante 10 minutos a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Disolver el precipitado en 10 ml de MgCl2 10 mM y se centrifuga durante 10 minutos a 5000 rpm a 4 ° C, Repita este paso una vez más para asegurar la eliminación completa del antibiótico. </li><li> Suspender el precipitado en 10 ml de tampón conteniendo 10 mM de MgCl 2 y 10 mM MES (pH 5,6). </li><li> Mida el diámetro exterior 600 por cada cultura de la BMV ARN 1, 2 ARN y ARN 3 y ajustar a 0,1 OD 600 con 10 mM de MgCl 2 y 10 mM MES (pH 5,6). </li><li> Mezclar 1 ml de cada uno de los tres 0.1 OD 600 suspensiones de cultivo. </li><li> Añadir 100 mM de acetosiringona, mezcla de detergentely y mantener la mezcla en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. </li><li> Dibuje la suspensión de la cultura en 1 ml. una jeringa sin aguja. </li><li> Infíltrate en la suspensión del cultivo anterior en el lado abaxial de 2-3 hojas expandidas bien de N. benthamiana (5 hojas etapa, las plantas 3-4 semanas de edad) presionando suavemente la jeringa a una mitad de la superficie abaxial de la hoja. </li><li> Repita este procedimiento con la infiltración a otras hojas. </li><li> Mantenga las plantas se infiltraron en la casa verde con 24 ° C. </li><li> Cosecha infiltrado en las hojas de 3 a 4 días después de la infiltración (ppp). </li></ol> 3. La purificación de los viriones BMV <ol><li> Recoger N. benthamiana deja agroinfiltradas con una mezcla que contiene los tres tipo salvaje agrotransformants BMV. </li><li> Moler las hojas en un almirez y mortero estéril con un volumen igual (w / v) de extracción BMV tampón (0,5 M NaAc; 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 y el volumen 1/100 de β-mercaptoetanol que ha de ser añadido justo antes de su uso) 3. Para maximizar el rendimiento del virus, se recomienda añadir arena lavada ácido (~ 0.5-1 g) que facilita la ruptura celular fácil de molienda y eficiente. </li><li> Filtrar el extracto de la hoja a través de 2-3 capas de tela de muselina y recoger la oleada. </li><li> Nuevamente moler la parte retenida en tela de muselina con un volumen igual de tampón de extracción BMV al peso inicial de material de hoja. </li><li> Repita el procedimiento de filtración con tela de muselina. Estos pasos deben llevarse a cabo a 4 ° C. </li><li> Transferir la solución de filtrado a un tubo de centrífuga y añadir volumen igual de pre-enfriada cloroformo y agitar (o batido) durante 5 minutos a la temperatura ambiente hasta que el color de la suspensión se vuelve de color verde claro. </li><li> Centrifugar la solución emulsionada durante 15 minutos a 12.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Recoger la fase acuosa y se agita durante 30 minutos en un agitador magnético para eliminar cualquier cloroformo residual. </li><li> Transferir la suspensión a un tubo de ultracentrífuga estéril. </li><li&gt; Debajo De 1 ml. 10% de sacarosa (preparada en tampón de virus de la extracción) como un cojín 3. </li><li> Centrifugar a 30.000 rpm durante 3 horas en una ultracentrífuga Beckman a 4 ° C. </li><li> Se desecha el sobrenadante y suspender el pellet en volumen deseado de tampón de suspensión BMV (para preparar tampón de suspensión diluida BMV tampón de extracción a 1/10 con agua destilada estéril). </li><li> La preparación virión parcialmente purificada de la etapa anterior se somete a centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa 10-40% para 150 min a 28000 rpm a 4 ° C. </li><li> Recoger la banda de virus, ya sea manualmente o por un fraccionador. La banda de virus aparecen de color azul con iluminación de luz blanca. </li><li> Se diluye la solución de sacarosa que contiene muestras de virus por lo menos 50% con tampón de virus de la suspensión. </li><li> Centrifugar virus diluido que contenía solución de sacarosa durante 3 horas a 30.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman a 4 ° C. </li><li> Finalmente suspender el sedimento de virus altamente purificado en un volumen deseado de virnos suspensión de amortiguación. </li><li> Medir la concentración del virión (mg / ml) usando un espectrofotómetro a OD 260. </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" /> Nota: Basado en el contenido de ARN, el coeficiente de extinción para la BMV es 5 4. <ol start="19"><li> Verifique la pureza de los viriones por ver en TEM (Fig. A) </li></ol> 4. Preparación de las subunidades de proteína de la cápside para montaje in vitro <ol><li> Preparar 1 litro de tampón 1x virus de disociación (0,5 M CaCl 2; 50 mM Tris HCl, pH 7,5; 1,0 mM de EDTA; 1,0 mM de DTT y 0,5 mM PMSF) 5. </li><li> Preparar membrana de diálisis de acuerdo con Sambrook et al 6. </li><li> Dispensación concentración requerida de virus purificado en una bolsa de diálisis. </li><li> Coloque el virus que contiene la bolsa de diálisis en un vaso que contiene el virus 1x tampón de disociación. </li><li> Dializar 24 horas a 4 ° C whilagitación e. </li><li> Recoger la solución de la bolsa de diálisis después de 24 horas y centrifugar a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Esto separar el ARN BMV de los viriones disociados. </li><li> Recoger el sobrenadante y se centrifuga a 35.000 rpm en centrífuga Beckman durante 3 horas a 4 ° C para sedimentar la no-disociado partícula del virus. </li><li> Recoger el sobrenadante. </li><li> En esta etapa es imprescindible para eliminar los contaminantes del ARN del virión disociados subunidades de la proteína de cápside. Para hacer esto, el sobrenadante del paso 8 debe ser sometido a otra ronda de noche sobre el reensamblaje de las subunidades de proteína de la cápside sin añadir ningún ARN (ARN en 1x tampón de montaje, véase más adelante), seguido por una centrifugación a alta velocidad (30.000 rpm durante 3 horas a 4 ° C) para que sedimenten los viriones ensamblados. Después de este paso reensamblaje, el sobrenadante subunidades que contienen proteína de la cubierta estaría libre de cualquier ARN residuales contaminantes. Sin embargo, para asegurar esto, es conveniente realizar una adicional en vitro reensamblaje con sólo subunidades capa de proteínas utilizando ARN tampón ensamblado 1x. Después de un día para el montaje, la preparación debe estar libre de viriones ensamblados (verificar mediante TEM). </li><li> Determinar la concentración de las subunidades de proteína de la cápside midiendo a OD 254 nm y 280 o por otros métodos tales como ensayo de Bradford. </li><li> Realizar 12-15% de SDS-PAGE seguida por Western blot para determinar la integridad de las subunidades de la proteína de cápside disociados. </li></ol> 5. In vitro montaje de ARN que contiene viriones <ol><li> Preparar las transcripciones de ARN para ser re-ensamblados en viriones y calcular la concentración 7. </li><li> Mezclar subunidades cápside de proteínas y ARN transcrito en una proporción de 1:5 (peso / peso) 5. </li><li> Dispense la mezcla anterior a una bolsa de diálisis y asegurar apropiadamente para evitar cualquier fuga. </li><li> Preparar 1.000 ml. de ARN 1x tampón de montaje (50 mM de NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,2; 10 mM de KCl; 5 mM de MgCl 2, 1,0 mM de DTT) 5. </li><li> Coloque la bolsa de diálisis que contiene la mezcla de reacción frente a tampón de montaje 1x en el vaso y remover. </li><li> Dializar la reacción de re-ensamblaje a 4 ° C durante 24 horas por agitación suave. </li><li> Recoger la mezcla de la bolsa de diálisis después de 24 horas y añadir 1,5 ml de ARN tampón ensamblado. </li><li> Pase esta mezcla a través de un Centricon-100 en la columna por centrifugación a baja velocidad (2.000 xg) durante 30 minutos. </li><li> Lavar la columna una vez con 1,5 ml de tampón de montaje a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Repita el paso por encima de lavado dos veces. </li><li> Finalmente, eluir los viriones de re-ensambladas por centrifugación a 10.000 ga 4 ° C durante 5 min. </li><li> Estimación de la concentración en el virión de DO 260 nm. </li></ol> 6. La fabricación de ópticas fantasmas virales (OVGs) <ol><li> Añadir verde de indocianina (ICG) 8 a la proteína purificada cápside en el coeficiente de concentración deseada (la relación en peso de la proteína verde de indocianina y la cápside utilizada en este informe fue 1:10) una<html> d mezclar bien con la pipeta. </li><li> Dializar la proteína de la cápside y la solución ICG contra el tampón de montaje OVG (1 M de NaCl; 50 mM de NaAc, 1 mM EDTA y DTT 1 mM, pH4.8) a 4 ° C durante 24 horas. </li><li> Después de 24 horas, recoger la solución de la bolsa de diálisis (12 kDa de tamaño de poro) y se centrifuga a 90.000 rpm durante 1 hora a 4 ° C (Fig. B) </li><li> Eliminar el sobrenadante y suspender el sedimento en tampón de suspensión BMV por agitación o de lo que le permite suspender por sí misma en un tampón de suspensión de la BMV la noche a 4 ° C. </li><li> Verifique que la morfología de OVGs por TEM (Fig. C). </li><li> Medir la absorbancia de 240 nm a 950 nm utilizando un espectrofotómetro (Cary 50, Varian Inc.), la presencia de ICG es confirmado por los picos de absorción de la firma alrededor de 700 nm y 790 nm 8. (Fig. D) </li><li> Los típicos picos de fluorescencia ICG a ~ 700 nm y ~ 800 nm se puede ver a la excitación de 620 nm de la solución de OVG (Fig. D), utilizando espectrofluorómetro (Fluorolog 3, Jobin-Yvon). </li></ol>_title &quot;&gt; 7. Resultados representativos <img alt="La figura A" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> Figura A. TEM imagen de viriones BMV tinción negativa purificados de N. benthamiana plantas agroinfiltradas con una mezcla de las tres de tipo salvaje agroconstructs BMV (barra de escala = 100 nm). <img alt="Figura B" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> Figura B. Pellet in vitro montado ICG OVGs que contienen después de centrifugación a alta velocidad. <img alt="Figura C" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> Figura C. TEM imagen de tinción negativa del ICG OVGs que contienen (barra de escala = 100 nm). <img alt="Figura D" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> Figura D. Absorbancia (Arriba) y fluorescencia (abajo) los espectros de OVGs. La longitud de onda de excitación utilizados para OVG emisión wcomo 620 nm.

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Enfoque agroinfiltration que aquí se presenta ampliamente puede ser aplicable a una amplia gama de virus de plantas. Una característica distintiva de este enfoque se sincroniza la entrega de múltiples agroconstruct a la celda-un mismo inconveniente importante comúnmente asociada con la inoculación utiliza rutinariamente mecánica de virus de plantas. In vivo e in vitro en los estudios de montaje utilizando virus del mosaico del bromo como un modelo puede llevar a cabo eficientemente por siguientes...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> MES sales de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Verde de indocianina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Beckman ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modelo: L8-70M </td></tr><tr><td> Centricon-100 columna </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> Espectrofotómetro </td><td> Cary 50, Varian Inc. </td><td> Número de referencia 10068900 </td></tr><tr><td> Espectrofluorómetro </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> Pieza número FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

En los virus con ARN de sentido positivo genomas patógenos para los seres humanos, animales y plantas, la progenie de encapsidación en viriones maduros y estables es una fase de cardenal durante el establecimiento de la infección en un equipo dado. En consecuencia, el estudio de encapsidación descifra la información relativa a los conocimientos del mecanismo de regulación de ensamblaje del virus para formar viriones infecciosos. Dicha información es de vital importancia en la formulación de nuevos métodos de frenar la propagación del virus y control de la enfermedad. Encapsidación del virus puede ser estudiado in vivo e in vitro. Encapsidación del genoma en vivo es un proceso altamente regulado selectiva que implica interacciones macromoleculares y compartimentación subcelular. Por lo tanto, el estudio que lleva a diseccionar los acontecimientos que abarcan encapsidación del virus in vivo proporcionará los conocimientos básicos para comprender cómo los virus proliferan y se ensamblan. Recientemente, en la encapsidación in vitro ha sido explotada para la investigación en el área de la investigación biomédica imaging y aplicaciones terapéuticas. Virus no envueltos de plantas destacan muy por delante en la aventura de en la encapsidación in vitro de la materia con carga negativa externa. Virus de mosaico Brome (BMV), un no envueltos multicomponente patógeno virus ARN a las plantas, ha sido utilizado como un sistema modelo para estudiar embalaje genoma in vivo e in vitro. Para los ensayos de encapsidación en plantas de Nicotiana benthamiana, mediada por Agrobacterium expresión transitoria, se refieren como agroinfiltración, es una técnica eficaz y sólido para la entrega sincronizada y la expresión de varios componentes para la misma célula. En este enfoque, una suspensión de Agrobacterium tumefaciens que llevan las células binarias de vectores plásmidos portadores de ADNc de ARNm desiredviral se infiltra en el espacio intercelular de la hoja withina usando nada más sofisticado que el de una jeringa desechable de 1 ml (sin aguja). Este proceso resulta en la transferencia de inserción de DNA en células vegetales; el T-DNAinserto se mantiene transitoriamente en el núcleo y luego se transcribe por el huésped polimerasa II, que conduce a la expresión transitoria. La transcripción del ARNm resultante (nivelado y poliadenilado) luego se exporta al citoplasma para su traducción. Después de aproximadamente 24 a 48 horas de incubación, las secciones de hojas infiltradas pueden ser degustados por microscopyor análisis bioquímicos. Agroinfiltration permite una gran cantidad (cientos o miles) de las células para ser transfectadas de forma simultánea. Para en la encapsidación in vitro, los viriones purificados de BMV se disocian en proteína de la cápside por diálisis frente a tampón de cloruro de disociación que contiene calcio seguido de la eliminación de ARN y viriones no-disociados por centrifugación. Genoma subunidades de proteína de cápside empobrecido se vuelve a montar con los componentes deseados del genoma viral o no viral de componentes tales como indocianina.

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Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Una manera sencilla, eficiente y robusta para sincronizar la entrega de múltiples componentes virales a las células vegetales mediante<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada por la expresión transitoria se describe. Este enfoque es susceptible para el estudio de la replicación, encapsidación seguido por<em&gt; In vitro</em&gt; Montaje de los componentes no virales en el genoma agotado ópticas fantasmas virales adecuados para aplicaciones biomédicas.

Simple y robusto En vivo Y In vitro Enfoque para el estudio de ensamblaje del virus

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

12.2K vistas.  University of California, Riverside. Una manera sencilla, eficiente y robusta para sincronizar la entrega de múltiples componentes virales a las células vegetales mediante Agrobacterium Mediada por la expresión transitoria se describe. Este enfoque es susceptible para el estudio de la replicación, encapsidación seguido por In vitro Montaje de los componentes no virales en el genoma agotado ópticas fantasmas virales adecuados para aplicaciones biomédicas.

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Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

Aislamiento y Análisis del Genoma de viriones individuales utilizando &quot;Genómica solo virus &#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Investigación

Inmunología e Infección

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM de Ensamblajes Biológicos en Líquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Bioingeniería

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Metodología Para La Generación Eficiente De Proteínas Del Virus Vaccinia Marcadas Fluorescentemente

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and assay development in virology. The RNA template of nonsegmented negative-sense (NNS) RNA viruses, such as the respiratory syncytial virus (RSV), is not an RNA molecule alone but rather a nucleoprotein (N) encapsidated ribonucleoprotein complex. Despite the importance of the authentic RNA template, the generation and assembly of such a ribonucleoprotein complex remain sophisticated and require in-depth elucidation. The main challenge is that the overexpressed RSV N binds non-specifically to cellular RNAs to form random nucleocapsid-like particles (NCLPs). Here, we established a protocol to obtain RNA-free N (N0) first by co-expressing N with a chaperone phosphoprotein (P), then assembling N0 with RNA oligos with the RSV-specific RNA sequence to obtain virus-specific nucleocapsids (NCs). This protocol shows how to overcome the difficulty in the preparation of this traditionally challenging viral ribonucleoprotein complex.

For in-depth mechanistic analysis of the respiratory syncytial virus (RSV) RNA synthesis, we report a protocol of utilizing the chaperone phosphoprotein (P) for coexpression of the RNA-free nucleoprotein (N0) for subsequent in vitro assembly of the virus-specific nucleocapsids (NCs).

Generación Y Ensamblaje De Nucleocápsides Específicas Del Virus Respiratorio Sincitial

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Bioquímica

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Ensayo muy sensible para la medición del Adjunto de células arenavirus

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It is extremely desirable to pair high-resolution cryo-EM information with dynamic observations as many events occur at rapid timescales - in the millisecond range or faster. Improved knowledge of flexible structures can also assist in the design of novel reagents to combat emerging pathogens, such as SARS-CoV-2. More importantly, viewing biological materials in a fluid environment provides a unique glimpse of their performance in the human body. Presented here are newly developed methods to investigate the nanoscale properties of virus assemblies in liquid and vitreous ice. To accomplish this goal, well-defined samples were used as model systems. Side-by-side comparisons of sample preparation methods and representative structural information are presented. Sub-nanometer features are shown for structures resolved in the range of ~3.5-&#197;-10 &#197;. Other recent results that support this complementary framework include dynamic insights of vaccine candidates and antibody-based therapies imaged in liquid. Overall, these correlative applications advance our ability to visualize molecular dynamics, providing a unique context for their use in human health and disease.

Here protocols are described to prepare virus assemblies suitable for liquid-EM and cryo-EM analysis at the nanoscale using transmission electron microscopy.

Avance de imágenes de alta resolución de ensamblajes de virus en líquido y hielo

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Construction of Adenoviral Vectors using DNA Assembly Technology

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an adenoviral vector by manipulating the genomic DNA of wild-type HAdV-7 by using a DNA assembly method. First, an infectious clone of HAdV-7, pKan-Ad7, was generated by fusing the viral genomic DNA with a PCR product from plasmid backbone, comprising of the kanamycin-resistant gene and the origin of replication (Kan-Ori), through DNA assembly. This was done by designing a pair of PCR primers, that contained ~25 nucleotides of the terminal sequence of HAdV-7 inverted terminal repeat (ITR) at the 5' end, a non-cutter restriction enzyme site for HAdV-7 genome in the middle, and a template-specific sequence for PCR priming at the 3' end. Second, an intermediate plasmid-based strategy was employed to replace the E3 region with transgene-expressing elements in the infectious clone to generate an adenoviral vector. Briefly, pKan-Ad7 was digested with dual-cutter restriction enzyme Hpa I, and the fragment containing the E3 region was ligated to another PCR product of plasmid backbone by Gibson assembly to construct an intermediate plasmid pKan-Ad7HpaI. For convenience, restriction-assembly was used to designate the plasmid cloning method of combined restriction digestion and assembly. Using restriction-assembly, the E3 genes in pKan-Ad7HpaI was replaced with a green fluorescent protein (GFP) expression cassette, and the modified E3 region was released from the intermediate plasmid and restored to the infectious clone to generate an adenoviral plasmid pKAd7-E3GFP. Finally, pKAd7-E3GFP was linearized by Pme I digestion and used to transfect HEK293 packaging cells to rescue recombinant HAdV-7 virus. To conclude, a DNA assembly-based strategy was introduced here for constructing adenoviral vectors in general laboratories of molecular biology without the need of specialized materials and instruments.

In this study, an infectious clone of human adenovirus type 7 (HAdV-7) was constructed, and an E3-deleted HAdV-7 vector system was established by modifying the infectious clone. This strategy used here can be generalized to make gene transfer vectors from other wild-type adenoviruses.

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...