وأيده هذه الدراسة الوطنية للبحوث والتنمية والابتكار مكتب لهنغاريا (منحة 116912 ÁH)، مكتب التكلفة (الأغذية والزراعة تكلفة العمل FA1205: أكواجاميتي)، هونجاريكوم ستيبينديوم وبرنامج المنح الدراسية (المنح إلى ZM) والجديد المجرية الوطنية التميز بريدوكتورال زمالة (منحة كرونة إستونية).

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها "قانون رعاية الحيوان الهنغارية".
1-كاشف إعداد
<ol><li>حلول الأسهم<ol>
<li>إعداد تريهالوسي م 1 بإضافة 0.378 ز من ثنائي هيدرات تريهالوسي إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.</li>
		<li>إعداد السكروز 1 م بإضافة ز 0.342 السكروز إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.</li>
		<li>تحضير 1 م حبيس بإضافة 0.238 ز حبيس إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.</li>
		<li>إعداد 20 ملغ/مل كولاجيناز (290 ش/mg) بإضافة 100 مغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد التربسين 15 ملغ/مل (~ 10000 U/mg) بإضافة 75 ملغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد 1 ملغ/مل الدناز أنا (~ 3000 يو/mg) بإضافة 5 ملغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد 0.4% تريبان الأزرق بإضافة 40 مغ تريبان الأزرق إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. 1 مل الكوة في أنابيب 1.5 مل.</li>
		<li>إعداد 200 مغ/لتر MS-222 (تريكيني الميثان المشبعة بالفلور أوكتين) بإضافة 200 مغ من مرض التصلب العصبي المتعدد-222 إلى 1 لتر من dH2ميكس O. جيدا حتى أنه يذوب تماما. بالإضافة إلى ذلك، المخزن المؤقت حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 مع بيكربونات الصوديوم للرقم الهيدروجيني محايدة من 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حلول التزجيج<ol>
<li>إعداد الموازنة الحل (ES): إعداد 2 مل وفاق بخلط 121.5 ميليلتر من الميثانول (ميوه؛ 1.5 متر)، 220 ميليلتر من البروبيلين غليكول (PG؛ 1.5 متر)، 200 ميليلتر من FBS (10%)، 200 ميليلتر حل الأسهم تريهالوسي (0.1 M)، 50 ميليلتر حبيس حل الأسهم (25 مم) و 1208.5 ميليلتر من L-15 إلى 2 أنبوب مل.</li>
		<li>إعداد الحل التزجيج (مقابل): إعداد 2 مل مقابل بخلط 439 ميليلتر من PG (3 م)، 426 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (لي2حتى؛ م 3)، 200 ميليلتر FBS (10%)، 200 ميليلتر من حل تريهالوسي الأسهم (0.1 M)، 50 ميليلتر من هيبيس الأسهم والحل (25 مم) 685 ميليلتر من L-15 إلى أنبوب 2 مل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حلول للاحترار<ol>
<li>إعداد الحل الاحترار 1 (WS1): تعد 1.5 مل WS1 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر من FBS (10%)، 450 ميليلتر من محلول السكروز الأسهم (م 3) و 900 ميليلتر من L-15.</li>
		<li>إعداد الحل الاحترار 2 (WS2): تعد 1.5 مل WS2 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر من FBS (10%)، 150 ميليلتر من محلول السكروز الأسهم (1 م) و 1200 ميليلتر من L-15.</li>
		<li>إعداد الحل الاحترار 3 (WS3): تعد 1.5 مل WS2 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر FBS (10 في المائة) و 1350 ميليلتر من L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الحل الهضم: لكل عينة إعداد 500 ميليلتر من الحل الهضم بخلط 50 ميليلتر من حل الأسهم كولاجيناز (2 مغ/مل)، 50 ميليلتر من حل الأسهم التربسين (1.5 ملغ/مل)، 10 ميليلتر من الدناز أنا (20 ميكروغرام/مل) و 390 ميليلتر من L-15 في 2 مل أنبوب.</li>
	<li>الحصول على أدوات تشريح: مقص، ميكروسسيسورس، ملاقط، ملاقط المنحنى، والعلاج بوخز الإبر.</li>
</ol>2-الخصيتين جمع
<ol><li>Euthanize السمك بوضعه في طبق يحتوي على 200 مغ/لتر MS-222 (pH = 7). قبل المتابعة مع التشريح، تأكد من أن الخياشيم توقفت عن التحرك، وأن مالا يقل عن 10 دقيقة مرت منذ تلك اللحظة لضمان الموت بنقص.</li>
	<li>الجاف للأسماك طريق الربت عليه على منشفة ورقية ووضعها على جانبها الظهرية على حصيرة تشريح.<ol>
<li>أولاً قطع زعانف الحوض وصدري لتشريح أسهل.</li>
		<li>أفقياً قص الجلد على بطن السمك بين الزعانف الصدرية وقطع الجلد والعضلات الأساسية على طول البطن حتى الزعنفة الشرجية.</li>
		<li>فتح تجويف الجسم من الأسماك ودبوس الجدار الجسم الأيمن والأيسر إلى حصيرة تشريح مع الإبر. ملاحظة: توجد الخصيتين أعلاه الأجهزة الجهاز الهضمي على كلا جانبي المثانة السباحة (الشكل 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>لمنع التلوث، لا تأخذ بها أجهزة الجهاز الهضمي، ولكن بلطف دفعهم إلى جانب واحد وإزالة الخصية من الجانب الآخر. الخصيتين متصلاً بجدار الجسم حتى إزالتها بعناية وقطع الصفاق يربط طريق ميكروسسيسورس.</li>
	<li>بالإضافة إلى ذلك، من أجل منع التلوث، أولاً تعقيم الخصيتين قبل وضعها في الإيثانول 70% 2 ثانية، والمكان ثم لهم في L-15 على لوحة 96-جيدا على الجليد. ملاحظة: إذا لزم الأمر، الخصيتين نظيفة من الأنسجة الدهنية وكبير الأوعية الدموية تحت ستيريوميكروسكوبي الضبط</li>
</ol>3. فائقة السرعة تبريد أنسجة الخصية
<ol><li>اكتب الإبر مارك مع التسميات المناسبة تبعاً للنموذج وإعداد الموازنة (ES) وحلول التزجيج (مقابل).</li>
	<li>نقل الخصيتين صفيحة جيدا أكبر أو طبق ودبوس ثلاثة الخصيتين (أو أكثر تبعاً لحجم الإبرة) بإبرة الوخز بالإبر معقمة.<ol>
<li>أولاً ضع في الخصية على رأس الملاقط منحنية. ضع نقطة الإبرة في وسط الخصية وسحب بعناية في الخصية نحو الأعلى مع الملاقط.</li>
		<li>بعد ثقب في الخصية، اسحبه برفق صعودا نحو الأعلى من الإبرة. تأكد من الخصيتين مفصولة عن بعضها البعض، وأنها لم تسقط أو الانزلاق إلى أسفل.</li>
		<li>مكان شغل الإبر مع الخصيتين المثبتة في أنبوب 2 مل مع L-15 حتى التزجيج (في ˚C 25؛ التخزين ينبغي أن لا يتجاوز الوقت ح 1). ملاحظة: تعلق الخصيتين في الإبرة ينبغي أن يتم سريعاً إلى منع الخصيتين من الجفاف.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل الإبرة مع الخصيتين إلى الحل الموازنة واحتضان لمدة 5 دقائق في 25˚C.</li>
	<li>تحويل الإبرة إلى الحل التزجيج واحتضان لمدة 30 ثانية في 25˚C.</li>
	<li>إزالة الإبرة من حل التزجيج، وتستوعب بسرعة ولطف الحل المتبقي من الأنسجة بمنشفة ورقية معقمة. توخي الحذر لتجنب الخصيتين التمسك بمنشفة ورقية أو السقوط.</li>
	<li>بسرعة ضع الإبرة في نيتروجين سائل يوضع في مربع الستايروفوم. ملاحظة: قم بهذه الخطوة بسرعة لتفادي التعرض للأنسجة لبخار النتروجين السائل. استخدام وحدات التخزين المنخفضة من النيتروجين السائل لمنع التلوث عبر العينات.</li>
	<li>الاحتفاظ الإبرة في النتروجين السائل في مربع الستايروفوم مغلقة لمدة 5-10 دقائق.</li>
	<li>بريكول كريوتوبي مل 4.5 فتح وبرنامجه في نفس مربع.</li>
	<li>بعد 5-10 دقيقة، نقل كل إبرة في كريوتوبي منفصلة تحت سطح النتروجين السائل وأغلق كريوتوبي. تنبيه: دائماً استخدام الملابس الواقية (مثل القفازات المعزولة) عند العمل مع النيتروجين السائل كما يمكن أن يؤدي التعرض لقضمة الصقيع الشديد.</li>
	<li>ضع كريوتوبي على عصا معدنية ثم ضعه في علبة cryobank في أسرع وقت ممكن. تخزين العينات في تخزين اسطوانة ديوار حتى استخدامها مرة أخرى.</li>
</ol>4-الاحترار الداخلي
<ol><li>الحارة إبرة كل على حدة. ينبغي أن تكون جميع الحلول الاحترار عند 25 درجة مئوية.</li>
	<li>فصل كريوتوبي من قصب معدنية ويغرق هو في النتروجين السائل المخزنة في مربع الستايروفوم.</li>
	<li>فتح في كريوتوبي في بخار النتروجين السائل (باستخدام الملقط) والإفراج عن الإبرة في النيتروجين السائل.</li>
	<li>نقل الإبرة سريعاً جداً في أول حل الاحترار واحتضان لمدة 1 دقيقة (عند 25 درجة مئوية). تأكد من نقل الإبرة بسرعة لمنع الاحترار في الهواء أثناء النقل.</li>
	<li>تحويل الإبرة إلى الحل الثاني الاحترار واحتضان لمدة 3 دقائق (عند 25 درجة مئوية).</li>
	<li>تحويل الإبرة إلى الحل الثالث الاحترار واحتضان لمدة 5 دقائق (عند 25 درجة مئوية).</li>
	<li>الإفراج عن الخصيتين من الإبرة بانزلاق لهم تخفيضها مع ملاقط منحنية. مكان كل الخصية حرارة منفردة في بئر منفصلة (96-جيدا لوحة) مليئة 250 ميليلتر من L-15 وتستكمل مع 10% FBS. تأكد من أن تتم تسمية الآبار وفقا للعينة. تبقى لوحة جيدا على الجليد حتى تكون درجة حرارة جميع العينات وحتى المزيد من العمل.</li>
</ol>5-الأنسجة الهضم
<ol><li>إعداد 500 ميليلتر من الحل الانفصال لكل عينة في أنابيب منفصلة 2 مل. قم بتسمية هذه الأنابيب وفقا للتعليمات البرمجية العينة. احتضان الحل الانفصال من استعداد لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إضافة حرارة الأنسجة إلى الحل الهضم ومقطعة إلى قطع صغيرة بحركات مالا يقل عن 30 من مقص صغير.</li>
	<li>احتضان قطع الأنسجة على لوحة تهتز لمدة 90 دقيقة في 25 ˚C.</li>
	<li>إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة 400 ميليلتر من L-15 و 100 ميليلتر من FBS (10% FBS v/v). باختصار يهز الحل واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تصفية الحل التي تم الحصول عليها من خلال 50 ميكرون المرشحات في أنبوب 1.5 مل. قم بتسمية الأنابيب تبعاً لذلك.</li>
	<li>الطرد المركزي الحل التي تمت تصفيتها في ز × 200 لمدة 10 دقائق في 25 ˚C.</li>
	<li>بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 20 ميليلتر من L15 تكملة مع 10% FBS. يدوياً يهز الأنبوب حتى يذوب بيليه تماما. ستبقى على تعليق خلية على الجليد أو في 4 ˚C حتى استخدامها مرة أخرى.</li>
</ol>6-استمرارية التقييم وخلية العد
<ol><li>مزيج 5 ميليلتر من تعليق خلية وميليلتر 5 0.4% تريبان الأزرق الحل في أنبوب PCR مسماة مناسب 0.2 مل. في حالة استخدام أحجام مختلفة، تأكد من أن نسبة التخفيف من بقايا 1:1.</li>
	<li>احتضان هذا الوقف لمدة 1 إلى 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).</li>
	<li>التحقق من صلاحية كل عينة في هيموسيتوميتير تحت المجهر.</li>
	<li>حساب عدد الخلايا الحية (أونستينيد قبل blue تريبان) في حقول 15. حساب إجمالي عدد الخلايا في 20 ميكرون من تعليق خلية. التعليق جاهز الآن لأي تطبيق من المتلقين للمعلومات. ملاحظة: عند تحسين الإجراءات المتعلقة بالأنواع الأخرى مع حجم الجسم أكبر، استخدام أجزاء الخصية من نفس الوزن. استخدام الخصيتين من فرد واحد لجميع المجموعات التجريبية بغية تجنب تقلب الفردية في النتائج. في حالة الزرد، ونحن قد استفادت الحقيقة أن اليسار والخصية اليمنى ينبغي أن تحتوي على عدد متساو (أو مشابهة جداً) من الخلايا الجرثومية13 (انظر نتائج الممثل). أبقى في الخصية اليسرى كعنصر تحكم بينما الشركة إنتاج/ارتفعت درجة حرارة الخصية اليمنى. تم حساب النسبة المئوية لبقاء عدد الخلايا المعزولة من الخصية الشركة إنتاج/تحسنت مقارنة بعدد الخلايا المعزولة من الخصية الطازجة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي تبريد فائقة السرعة لأنواع الطيور والثدييات10،11،12 إلى تجميد الأسماك الخصية (الزرد كنموذج الكائن الحي). معظم الدراسات السابقة فيما يتعلق بتجميد الموارد الوراثية الزرد كانت ...

الاتجاهات الجديدة في مجال العلم والتكنولوجيا الحيوية أدت إلى خلق آلاف خطوط جديدة متحولة من الفئران و المورفولوجية، الزرد وغيرها من الأنواع التي تستخدم كنموذج الكائنات الحية في الطب الحيوي و العلوم الأخرى1. وعلاوة على ذلك، كما يتم تطوير التكنولوجيات الجديدة وتصبح متاحة، أرقام الأسطر متحولة اطراد زيادة2. وهذا يؤدي إلى ضرورة لتخزين آمنة للموارد الجينية خارج الممارسات المشتركة للحفاظ على تكاثر المستعمرات. للواسمات كأسلوب التي يمكن تخزينها في مكان أمن للموارد الجينية لفترة غير محددة من الوقت، يوفر مزايا عديدة مثل تمديد الموسم الإنجابية، تلتف الحاجة إلى صيانة مستمرة للأمهات، وهو أكثر تكلفة--و 2من كفاءة العمل.
بروتوكولات لتجميد الحيوانات المنوية خلال مدى عدة سنوات2،3،4 فرصة لنجاح تخزين المواد الوراثية الذكور الزرد. ومع ذلك، نعد من البيض أو الأجنة في الأسماك لم يتم ممكناً بفضل بنيتها المعقدة وكميات كبيرة من مادة الصفار. في الآونة الأخيرة، يقدم ممارسة زرع الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) أو الخلايا الجذعية سبيرماتوجونيال (SSCs) تجاوز لهذا الحاجز بتطوير وظيفي الحيوانات المنوية والبيض بعد زرع5. ولذلك، يقدم للواسمات SSCs أفقاً جديداً في حفظ الموارد الوراثية النادرة والقيمة.
على الرغم من أن نعد يوفر العديد من المزايا، بمعدل بطيء عملية تجميد يولد العديد من الشروط التي قد تؤدي إلى تلف الخلية2. وهذه تشمل تشكيل الجليد داخل الخلية وخارج الخلية، والجفاف، وسمية كريوبروتيكتانت وغيرها. أضرار الجليد داخل الخلية الخلايا، والجليد خارج الخلية قد يؤدي إلى سحق الميكانيكية للخلايا، في حين نشر المياه من الخلايا خلال معدل بطيء التجميد قد يؤدي إلى الجفاف6. في الآونة الأخيرة، تم تطبيق التزجيج كأسلوب الذي يمنع الآثار السلبية لتشكيل الجليد في تجميد الأسماك الأمشاج7،،من89. وهو يقدم أسلوب تبريد سريع جداً من خلالها تتحول وسائل الإعلام الداخلية والخارجية لدولة غير متبلور/زجاجي دون كريستاليزينج في الجليد7،10. وقد تجلى التزجيج ناجحة من أنسجة الخصية والمبيض في أنواع الطيور والثدييات10،11،12، مما فتح إمكانيات لتطبيقه في الأسماك، وكذلك.
في هذه الدراسة، نقدم الإجراء التزجيج (يقول:) إبرة مغمورة لنعد الخصيتين الزرد كله. علينا أن نظهر طريقة موثوقة لعزل الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة الزرد دون التلوث وعملية تجميد أن ينتج كميات عالية نسبيا من الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة مع وجود انخفاض للخلايا الأخرى، لا سيما من المني. على حد علمنا، هذا هو أول دراسة لإثبات بروتوكول تصور مفصل للتبريد السريع جداً للأسماك جوندال الأنسجة والخلايا germline الزرد. بالإضافة إلى ذلك، يظهر التكرار للأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد: AB البرية نوع، كاسبر (روي--/--؛ الصدف-/-،) ليوبارد (ليوt1/t1) وفأسا [تيراغرام (vas::eGFP)] و Wilms الورم [تيراغرام (wt1b::eGFP 1)] خط المحورة وراثيا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="948">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">Leibovitz media (L-15)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">L1518</td>
			<td style="width:296px;">Supplemented with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:232px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">F9665</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:232px;">HEPES</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">H3375</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Sucrose</td>
			<td style="width:220px;">Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trehalose</td>
			<td style="width:220px;">Acros Organics</td>
			<td>99-20-7</td>
			<td style="width:296px;">Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Methanol</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">20740-0-08-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Propylene glycol</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">08860-1-08-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">00190-1-01-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Collagenase</td>
			<td style="width:220px;">Gibco</td>
			<td style="width:200px;">9001-12-1</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trypsin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T8003</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">DNase I</td>
			<td style="width:220px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:200px;">A3778</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T6146</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

الاتجاهات الحالية في مجال العلم والتكنولوجيا الحيوية يؤدي إلى خلق الآلاف من خطوط جديدة في نموذج الكائنات الحية مما يؤدي إلى ضرورة اتباع أساليب جديدة للتخزين الأمن للموارد الجينية خارج الممارسات المشتركة للحفاظ على تكاثر المستعمرات. وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. تجميد الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة من الخصيتين كله يقول: يوفر إمكانيات لتخزين الزرد الموارد الجينية، وخصوصا بعد زرع الأعضاء أنهم يمكن أن تنضج في الأمشاج الذكور والإناث على حد سواء. وقد اقتطعت الخصيتين، معلقة على إبرة الوخز بالإبر، اكويليبراتيد في اثنين من وسائط الإعلام كريوبروتيكتيفي (الحل الموازنة التي تحتوي على الميثانول 1.5 متر و 1.5 متر البروبيلين غليكول؛ والحل التزجيج المحتوية على م 3 ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 3 م البروبيلين غليكول) وانخفضت إلى النيتروجين السائل. وقد استعد عينات في سلسلة من ثلاثة حلول الاحترار ما يترتب عليها. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي (1) عدم وجود المني بعد الهضم من حرارة الخصيتين مما يسهل التلاعب المتلقين للمعلومات؛ (2) فائقة السرعة التبريد تمكين الأمثل تعرض الأنسجة للنتروجين السائل ولتعظيم التبريد وخفض تركيز المطلوبة المنتجة، مما يقلل من سميتها؛ (3) متزامن تعرض الخصيتين عدة للمنتجة والنتروجين السائل؛ والتكرار (4) يتبين من الحصول على صلاحية فوق 50 في المائة في خمس سلالات مختلفة الزرد.

في المتوسط، وعدد الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة معزولة عن الخصية الزرد طازجة واحدة تراوحت بين الخلايا 40,000 و 200 ألف حسب حجم الأسماك. عند هضم الخصيتين الزرد الطازجة في جميع سلالات 5، الخلايا الجرثومية المبكر لم تكن الخلايا فقط موجودة في تعليق خلية (الشكل 2)...

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling at JoVE.com

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

للواسمات Spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة

وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار التكرار الأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Views.  Szent István University. وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار التكرار الأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد.

Video: Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

جعل Gynogenetic اسماك الزرد ضعفاني بواسطة الضغط المبكر

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران التي التزجيج جلايكول الإثيلين ، واستنادا

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrosomes التصوير في يطير الخصية

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...