نحن الامتنان على تمويل من ترعاه DARPA مايكرو / نانو التركيز أساسيات Fluidics (MF3) مركز تحت رقم العقد N66001-10-1-4003، ومنحة من داربا N660001-09-C-2082.

<ol>
	<li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis.">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li><li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis.">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li><li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotachophoresis:+Theory,+instrumentation,+and+applications.">Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications.</a> Elsevier Science &#38; Technology. , (1976).</li><li>Khurana, T. K., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration,+separation,+and+indirect+detection+of+nonfluorescent+analytes+using+fluorescent+mobility+markers.">Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers.</a> Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carrier+ampholytes+assay+for+portable,+label-free+detection+of+chemical+toxins+in+tap+water.">Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water.</a> Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+analyte+identification+using+isotachophoresis+and+a+fluorescent+carrier+ampholyte+assay.">Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay.</a> Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).</li><li>Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+system+for+isotachophoresis+assays.">Miniaturized system for isotachophoresis assays.</a> Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).</li><li>Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+quantification+of+isotachophoresis+zones+using+nonfocusing+fluorescent+tracers.">Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers.</a> Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).</li><li>Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+extraction,+isolation,+preconcentration,+and+quantitation+of+small+RNAs+from+cell+lysate+using+on-chip+isotachophoresis.">Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis.</a> Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).</li><li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis.">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li><li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons.">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li><li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis.">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li><li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I:+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers.">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li><li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+dispersion+in+isotachophoresis.">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li><li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l&#214;sungen+und+l&#214;sungsgemischen.">&#220;ber concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von l&#214;sungen und l&#214;sungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li><li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases.">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li><li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations.">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li><li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons.">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

قدمت وسائل تمكين ITP هنا الكشف السريع وحساسة وقوية والتعامل مع الجزيئات الأيونية. التحدي الرئيسي في استخدام آي تي ​​بي هو الخيار السليم للمخازن جنيه والشركة المصرية للاتصالات. في آي تي ​​بي أنيوني، نختار عادة كلوريد كما أنيون الرائدة لأنه هو حمض قوي مع الحركة المطلقة عالية جدا، وبالتالي لها خصائص يمكن التنبؤ بها جدا. لذلك، ينخفض ​​عادة خيار عازلة في ITP أنيوني إلى اختيار الشركة المصرية للاتصالات المناسبة وcounterion. لانتقائية تركز التجارب، TE الاختيار أمر بالغ الأهمية لاستبعاد تلويث الأيونات. في التطبيقات حيث لا وجود الملوثات، وانخفاض TE التنقل فعال يؤدي إلى أسرع معدل من التركيز. نوصي باستخدام ما يلي، نسبيا حسن تصرف أنيوني أيونات الشركة المصرية للاتصالات: MES، المماسح، HEPES، tricine. اختيار counterion يؤثر على كل من درجة الحموضة النظام والشركة المصرية للاتصالات تنقل فعالة. counterions شيوعا هي تريس (الباكاف الحمضية 8.1) ومكرر تريس (الباكاف الحمضية 6.4). للفحوصات التي تتطلب درجة الحموضة أقل أو أعلى، فإننا نوصي بيريدين (الباكاف الحمضية 5.25) وإيثانولامين (الباكاف الحمضية 9.5)، على التوالي. في الجدولين 1 و 2، آي تي بي للأنيوني والموجبة، على التوالي، ونحن تلخيص عدة أمثلة العازلة مفيد. نحن نأخذ حمض الهيدروكلوريك كما أيون جنيه أنيوني والصوديوم وأيون جنيه الموجبة، ونحن نفترض 100 قوة الأيونية ملم من المنطقة العازلة جنيه. والقارئ لاحظ أن قوة أيونية عازلة في بروتوكولات لدينا (والجداول 1-2) هي دائما أكبر من أو يساوي 10 مم. بينما في نظرية فيزياء ITP ينطبق على القوة الأيونية أقل من 10 ملم، والملوثات الطبيعية (حامض الكربونيك على سبيل المثال من التفاعل بين الماء وغاز ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي) بالقرب من مستوى ملي 1 غالبا ما تحد من الاستخدام العملي للمنخفض مخازن القوة الأيونية. نلاحظ أن لا يقتصر إشارة آلية تنبيغ لفحوصات الواردة في هذا البروتوكول. كما يمكن مناقشتها بإيجاز في الجزء 5، في وضع هضبة تنقية مناطق يمكن اكتشافها من خلال التغييرات في الموصلية المحلية، والأشعة فوق البنفسجية absorبانس، ودرجة الحرارة، أو مؤشر الانكسار. في المجموعة الخاصة بنا، وقمنا بتطوير طريقة التي تستخدم ampholytes الناقل فلوري للكشف عن الحساسية، وتحديد من analytes غير معروف. (5) والتجارب وضع الذروة، ويمكن استخدام مجسات خاصة لتسمية التحاليل تركيزا. في مثال واحد، ونحن نستخدم منارات الجزيئية - تحقيقات قليل النوكليوتيد أن يتألق على تهجين تسلسل إلى هدفهم - للكشف عن الحمض النووي المستهدف أو جزيئات الحمض النووي الريبي مع خصوصية عالية 11،18. في حين ITP قوية نسبيا إلى التشتت الناجم عن الضغط يحركها تدفق وEOF، EOF المفرط يمكن أن يؤدي إلى ركود واجهة ITP، حيث سرعة EOF يعني يصبح مساويا لسرعة ITP. 14 EOF قوي مثل هذا يحدث خصوصا في ظل ظروف ارتفاع درجة الحموضة والقوة الأيونية منخفضة. لهذا السبب، من المستحسن استخدام العازل مع درجة الحموضة (8) أو أقل، ومع القوة الأيونية بناء على أمر من 100 مم إذا مريحة. في تجربتنا، هو PVPمعظم طلاء فعالة لقمع EOF في رقائق البورسليكات. ومع ذلك، لما له من خصائص النخل، قد PVP لا يكون مناسبا لبعض التطبيقات، مثل التركيز الحمض النووي الجيني. في التجارب، ونحن نلاحظ أن إضافة PVP يمكن أن يقلل كثيرا الجينومية التنقل الحمض النووي المطلق (لدرجة أنها لا تركز). في هذه الحالات يمكن للطلاء silanol مثل Sigmacote في الاقتران مع السطحي (مثل تريتون-X 100) أيضا أن تكون فعالة في الحد من EOF. 10 <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE أنيون (الباكاف الحمضية -1) </td></tr><tr><td> التخزين المؤقت counterion (الباكاف الحمضية +1) </td><td> MES (6.10) </td><td> اجتماعات الأطراف (7.20) </td><td> HEPES (7.50) </td><td> tricine (8.15) </td></tr><tr><td> إيثانولامين (9.50) </td><td> 21.41 </td><td> 20.40 </td><td> 17.38 </td><td> 22.85 </td></tr><tr><td> تريس (8.08) </td><td> 21.00 </td><td> 19.23 &lt;/ TD&gt; <td> 15.84 </td><td> 17.56 </td></tr><tr><td> مكرر تريس (6.40) </td><td> 18.22 </td><td> 10.41 </td><td> 7.30 </td><td> 5.23 </td></tr><tr><td> بيريدين (5.18) </td><td> 1.01 </td><td> 3.72 </td><td> 2.42 </td><td> 1.48 </td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1. فعال حجم التنقل (× 10 -9 م 2 / V / S) من المعدل منطقة الحليلة نقي في ITP أنيوني حيث هو 100 جنيه حمض الهيدروكلوريك ملم و 200 ملم counterion التخزين المؤقت. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE الكاتيون (الباكاف الحمضية +1) </td></tr><tr><td> التخزين المؤقت counterion (الباكاف الحمضية -1) </td><td> إيثانولامين (9.50) </td><td> تريس (8.08) </td><td> مكرر تريس (6.40) </td><td> بيريدين (5.18) </td></tr><tr><td> MES (6.10) </td><td> 35.57 </td><td> 21.96 </td><td> 16.39 </td><td> 10.45 </td></tr><tr><td> MOPS (7.20) </td><td> 35.47 </td><td> 20.92 </td><td> 9.76 </td><td> 3.93 </td></tr><tr><td> HEPES (7.50) </td><td> 35.35 </td><td> 19.97 </td><td> 7.77 </td><td> 2.88 </td></tr><tr><td> Tricine (8.15) </td><td> 34.77 </td><td> 16.72 </td><td> 4.50 </td><td> 1.44 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. الفعال حجم التنقل (× 10 -9 م 2 / V / S) من المعدل منطقة الحليلة نقي في ITP الموجبة حيث هو 100 جنيه الصوديوم ملم و 200 ملم counterion التخزين المؤقت.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> الكواشف </td></tr><tr><td> اسم </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الماء المقطر </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> ريبونوكلياز / حرة الدناز </td></tr><tr><td> كلوروكس الترا </td><td> كلوروكس </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) </td><td> مالينكرودت </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> حمض الهيدروكلوريك (HCL) </td><td> EMD كيماويات </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma قاعدة (تريس) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> بوفيدون (PVP) </td><td> Polysciences المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> 06067 </td><td> ميغاواط 1000000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيغما الدريخ </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> اليكسا فلور 488 حمض الكربوكسيلية </td><td> إينفيتروجن </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricine </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> مكرر تريس </td><td> سيغما الدريخ </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> تريتون-X 100 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> الليزوزيم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR الأخضر الثاني </td><td> إينفيتروجن </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> إيثانولامين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> رودامين 6G </td><td> العضوية Acros (جيل، وبلجيكا) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-الأحماض الأمينية </td><td> سيغما الدريخ </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> قوة SYBR الأخضر RNA إلى C 1-T الخطوة كيت </td><td> النظم البيولوجية التطبيقية </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;TD&gt; PCR الاشعال </td><td> المتكاملة للتكنولوجيا الحمض النووي </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> معدات </td></tr><tr><td> اسم </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> البورسليكات ميكروفلويديك رقاقة </td><td> الفرجار العلوم الحياتية شركة </td><td> NS12A </td><td> الموردة مع أو بدون علبة من البلاستيك </td></tr><tr><td> فراغ مضخة </td><td> غاست </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> Sourcemeter </td><td> شنيعة </td><td> 2410 </td><td> ثابت الجارية والثابتة وسائط تشغيل التيار الكهربائي </td></tr><tr><td> epifluorescent المجهر المقلوب </td><td> أوليمبوس </td><td> IX70 </td><td> استخدام الزئبق مصباح (أوليمبوس) أو الصمام (Thorlabs) للإضاءة </td></tr><tr><td> مرشح مكعب </td><td> أوميغا </td><td> XF115-2 </td><td> الإثارة / الانبعاثات: أزرق / أخضر </td></tr><tr><td> آمنقفل أنابيب microcentrifuge </td><td> إيبندورف </td><td> 022363204 </td><td> سعة 1.5 مل </td></tr><tr><td> نبذ </td><td> إيبندورف </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 3. الكواشف معينة والمعدات.

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

تقنيات حركي كهربي هي من دعائم من التطبيقات الميكروسكيل نظرا لقدرتها الفريدة على أداء مجموعة متنوعة من العمليات fluidic والكهربي في النظم، وبسيط التعاقد مع أي أجزاء متحركة. Isotachophoresis (آي تي بي) هي تقنية بسيطة وقوية جدا حركي كهربي التي يمكن أن تحقق الفصل مليون أضعاف 1،2 preconcentration والكفاءة والاستخراج على أساس الحركة الأيونية. 3 على سبيل المثال، أننا أظهرنا تطبيق آي تي بي للانفصال وكشف حساسة من غير المسماة الأيونية جزيئات (السموم على سبيل المثال، الحمض النووي، والريباسي، ميرنا) مع ضئيلة أو معدومة عينة إعداد 4-8، واستخراج وتنقية الأحماض النووية من المصفوفات المعقدة بما في ذلك ثقافة الخلية والبول، والدم. 9-12 ITP يحقق التركيز والفصل باستخدام مجال تطبيق الكهربائية ومخازن 2 ضمن نظام قناة fluidic. لالتحاليل أنيوني، يتم اختيار الشركة الرائدة في مجال المنحل بالكهرباء (LE) العازلة قاوك أن الأنيونات لها أن تكون أعلى التنقل الكهربي فعالية من الأنيونات من المنحل بالكهرباء زائدة (TE) العازلة (التنقل الفعالة ويصف سرعة الانجراف ملاحظتها لايون، ويأخذ في الاعتبار حالة التأين من الأيونات، كما هو موضح بالتفصيل من قبل Persat وآخرون 13). بعد تأسيس حلقة وصل بين الشركة المصرية للاتصالات وجنيه، يتم تطبيق حقل كهربائي بحيث أيونات جنيه الابتعاد عن المنطقة التي تحتلها أيونات الشركة المصرية للاتصالات. يمكن الأيونات عينة من وسيط سباق التنقل فعال قبل الأيونات الشركة المصرية للاتصالات ولكن لا تجاوز أيونات جنيه، وبالتالي فهي تركز على واجهة LE-TE (وتسمى فيما بعد &quot;واجهة آي تي ​​بي&quot;). علاوة على ذلك، الشركة المصرية للاتصالات والمناطق شكل جنيه من الموصلية المنخفضة على التوالي وارتفاع، والذي وضع حاد الانحدار الحقل الكهربائي في واجهة ITP. هذا التدرج حقل preconcentrates الأنواع عينة لأنها تركز. خيار مناسب لنتائج الشركة المصرية للاتصالات وجنيه في التركيز وتنقية من الأنواع المستهدفة من الأنواع غير المركزة الأخرى، وفي نهاية المطاف، والفصل 1د الفصل بين الأنواع عينة. نستعرض هنا ITP المبادئ الفيزيائية التي يقوم عليها، ومناقشة وضعي معيار من العملية: &quot;الذروة&quot; و &quot;الهضبة&quot; وسائط. في وضع الذروة، ويخفف نسبيا الأيونات عينة تركيز معا ضمن تداخل القمم ضيق في واجهة ITP. في وضع هضبة، الأيونات عينة أكثر وفرة التوصل الى تركيز ثابت للدولة وفصل إلى مناطق مثل هضبة مجاورة امر بها الحركة على نحو فعال. الذروة والهضبة وسائط تنشأ من الفيزياء الكامنة نفسه، ولكنها تمثل الأنظمة متميزة تختلف عن تركيز تحليلها الأولي و / أو كمية من الوقت المخصص للتراكم عينة. وصفنا 1 بالتفصيل وضع ذروة تجربة نموذجية وشرح بعد ذلك فحص وضع ذروة لاستخلاص الأحماض النووية من E. كولاي خلية ثقافة. نستنتج من خلال تقديم فحص وضع هضبة، حيث نستخدم عدم التركيز التتبع (NFT) الأنواع لتصور الانفصال ولكلتشكيل الكميات من الأحماض الأمينية.

Watch this Scientific Journal Video about On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids at JoVE.com

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Isotachophoresis (آي تي ​​بي) هو فصل قوي حركي كهربي وتقنية preconcentration مع التطبيقات التي تتراوح بين اكتشاف السم إلى إعداد عينة. نستعرض المبادئ الفيزيائية للITP والمنهجية لتطبيق هذه التقنية لاثنين من التطبيقات مثال محدد: الفصل والكشف عن جزيئات صغيرة وتنقيتها من الأحماض النووية من المحللة ثقافة الخلية.

على رقاقة Isotachophoresis للفصل بين الأيونات والتنقية من الأحماض النووية

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

on-chip-isotachophoresis-for-separation-ions-purification-nucleic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Current and Resistance

SCIENTISTS IN ACTION

24.3K Views.  Stanford University. Isotachophoresis (آي تي ​​بي) هو فصل قوي حركي كهربي وتقنية preconcentration مع التطبيقات التي تتراوح بين اكتشاف السم إلى إعداد عينة. نستعرض المبادئ الفيزيائية للITP والمنهجية لتطبيق هذه التقنية لاثنين من التطبيقات مثال محدد: الفصل والكشف عن جزيئات صغيرة وتنقيتها من الأحماض الن?...

Video: On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree الميكروسكوب تصوير الشعاعي الطبقي على رقاقة ويعمل لدى الشركة متعددة زاوية الإضاءة وبكسل سوبر قرار

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

على رقاقة Phenotyping التهاب غشائي

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

الفيلم الجافة على أساس مقاوم الضوء Biosensor موائع جزيئية الكهروكيميائية منصة: تصنيع الجهاز وإعداد مقايسة على شريحة، ونظام التشغيل

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

تلفيق والتحقق من صحة نظام الجهاز على رقاقة مع أقطاب متكاملة لقياس المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال مباشرة

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

الكشف عن الأحماض النووية متعددة في صفيف شعرية البصرية

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

إعداد وتنقية، واستخدام الدهنية المحتوية على الأحماض الدهنية

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

التجميع الذاتي للأحماض الببتيد النيوية المعدلة بأشعة غاما في الهياكل النانوية المعقدة في مخاليط المذيبات العضوية

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.