Agradecemos la financiación de DARPA patrocinado por Micro Focus / nano fluidos Fundamentos (MF3) Centro bajo el contrato número N66001-10-1-4003, y la concesión de DARPA N660001-09-C-2082.

1. Física de la PTI ITP constituye un límite claro entre el movimiento de iones de carga similar. La técnica se puede realizar con las muestras aniónicos o catiónicos, pero nosotros adaptamos esta introducción a ITP aniónico y tenga en cuenta los mismos principios se aplican a ITP catiónico. Elegimos tampones LE y TE de tal manera que los iones LE tienen magnitud mayor movilidad electroforética efectiva. La movilidad electroforética μ eficaz, = U / E, es la constante de proporcionalidad entre campo eléctrico aplicado, E, y velocidad de desplazamiento de iones, U. 13 Establecemos una interfaz difusa entre el LE y TE y aplicar un campo eléctrico dirigido desde el alta la conductividad LE zona en la zona de baja conductividad TE. El sistema establece rápidamente un fuerte gradiente en el campo eléctrico en la interfase PTI, debido al perfil de conductividad no uniforme. De acuerdo con su nombre (del griego &quot;isos&quot; significa &quot;igual&quot;, &quot;takhos&quot; significa &quot;velocidad&quot;), TE LE iones y los viajes en la misma ve, uniformelocity, como resultado del campo eléctrico no uniforme y la conservación de la corriente (esto es la denominada &quot;condición PTI&quot;, ver Figura 1). La interfaz de ITP se auto-afilado: LE iones que difunden en la experiencia TE zona de un fuerte flujo restaurar y volver a la zona principal (y viceversa para los iones de TE en la zona de LE). Los iones de ejemplo enfocar a esta interfaz si su movilidad eficaz en la zona de TE es mayor que las de los co-TE iones, y si su movilidad eficaz en la zona LE es menor que la de los LE co-iones (ver Figura 1). La auto-afilado y centrándose propiedades de ITP contribuir a la solidez de esta técnica y que ITP relativamente insensible a las perturbaciones de la interfaz (por ejemplo, debido a la presión impulsada por el flujo o cambios en la geometría, como contracciones, expansiones, y vueltas). En el modo de pico de ITP (ver Figura 2a y Videos 1-2), las concentraciones de iones de la muestra sonen todo momento, significativamente menor que las concentraciones de TE LE y de iones y por lo tanto contribuye de manera insignificante a la conductividad local. La distribución de los iones de la muestra se determina por el interfaz de autoafilado entre las zonas de vecinos (aquí el TE y LE) y el valor de la movilidad muestra efectiva en relación con estas zonas. 14 iones de la muestra Múltiples centrarse dentro de la misma zona estrecha interfaz ITP como en gran parte superposición de picos. Las anchuras de interfaz y pico, así como el factor de preconcentración asociado, escala inversamente con la corriente aplicada (ver experimentos en la Figura 2b). 14 Para concentraciones de la muestra lo suficientemente altas iniciales y el tiempo de la acumulación de suficientes iones de la muestra alcanza un valor umbral de concentración. Por totalmente ionizados especies, este valor está determinado por la función reguladora Kohlrausch (KRF). 15 Para electrolitos débiles, se determina por las funciones Alberty y Jovin 16,17. En mesetamodo, como se ilustra en la Figura 3 y Video 3, iones de la muestra separar y purificar en zonas de concentración localmente uniforme y constante en un orden determinado por su movilidad efectiva. Iones muy diluidas todavía puede centrarse en el modo de pico entre las zonas de la meseta. En ITP, iones de la muestra puede ser introducido en una inyección finito entre el TE y LE (ver Figura 3) o alternativamente mezclados con el TE y / o LE (ver Figura 2). Nos referimos a la mezcla en la zona de TE como &quot;semi-infinita&quot; inyección, que puede ser utilizado para acumular iones analito continuamente. Acumulación continua de la muestra aumenta la sensibilidad en ambos picos y los ensayos de la meseta de modo. Sin embargo, las inyecciones finitos son más comunes en el modo de meseta. Esto es probablemente debido a altas concentraciones de analito iniciales en semi-infinita de la inyección puede aumentar sustancialmente la conductividad TE y tasas más bajas de enfoque. Además, la purificación completa no es posible en semi-infinita inyección (ya que no remains de una concentración finita en TE). 2. Dispositivo de limpieza y preparación Para los ensayos se presentan en este protocolo se utiliza isótropa húmedo grabado al agua fuerte (más o menos la sección transversal en forma de D) los chips de microfluidos de vidrio con un diseño a través del canal (ver Figura 1). La limpieza y el protocolo siguiente preparación está optimizado para los canales de sílice borosilicato y fundida, pero también se puede utilizar con vidrio / PDMS fichas. Lleve a cabo este procedimiento de limpieza antes de los experimentos para asegurarse de ejecutar para ejecutar la repetibilidad y la correcta aplicación de los recubrimientos de dinámicas necesarias para suprimir el flujo de electroosmótico (EOF). La omisión de este protocolo puede resultar en dispersión sólida de la interfaz de ITP. 14 <ol><li> Para descontaminar el canal, llenar el Norte, Este, Sur y embalses con 10-20 l de lejía al 10% y aplicar vacío en el depósito del oeste durante 2 min. Si se utiliza un estándar de Caliper chip de caddie, de vacío puede aplicarse de manera efectiva con sólo attaching el extremo ancho de una l 200 (sin filtrar) punta de la pipeta al depósito chip y conectar la línea de vacío a un tubo de 2 mm de diámetro interior. </li><li> Vaciar los depósitos y enjuagar el canal (como en el paso 1) con hidróxido de sodio 1 M durante 2 min. Esta suavidad graba las paredes del canal, dando una superficie de borosilicato limpio para ayudar a establecer las propiedades de superficie uniforme. </li><li> Vaciar los depósitos y limpia, con agua desionizada (DI), luego enjuague el canal con LE para ~ 2 min. Durante este período las propiedades superficiales y revestimientos dinámicos equilibre dentro del canal. </li></ol> 3. Fluoróforo centrándose en el modo de pico de ITP <ol><li> Preparar 1 ml LE consistente en 100 mM de HCl, 200 mM Tris, y 1% de PVP. </li><li> Preparar 1 ml de TE que consta de HEPES 100 mM y 200 mM Tris. Combine 90 l de TE con 10 l de 1 micra Alexa Fluor 488 (AF488). </li><li> Después de aclarar con LE, como se describe en la Parte 2, vacíe el depósito del oeste y limpiar un par de veces con DI en oder para diluir cualquier LE restante en el depósito. Rellene este depósito con 20 l de TE que contiene AF488. </li><li> Colocar el electrodo positivo en el depósito Este y el suelo (negativo) de electrodos en el depósito Oeste y aplicar 2 mA (corriente constante). El pico de la muestra migrará a una velocidad constante desde el depósito al depósito Oeste Medio (ver Figura 1) y la tensión entre estos depósitos aumentará a medida que la menor conductividad TE llena el canal. </li></ol> 4. Extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de cultivo de E. E. La capacidad de enfocar de forma selectiva las especies iónicas hace ITP una técnica ideal para la preparación de muestras biológicas. Nos purificar ácidos nucleicos a partir de lisado de células no tratadas mediante la selección de un anión final con una magnitud menor movilidad eficaz que el ácido nucleico diana, pero mayor que la co-iónicos inhibidores de la PCR (por ejemplo, detergentes aniónicos, proteínas, y disolventes orgánicos, aunque esté presente en hila concentración de GH). Catiónico inhibidores de la PCR (por ejemplo, metales alcalinos y proteínas catiónicas y detergentes) migran en la dirección opuesta y así también se dejó atrás. ITP extrae y se concentra ácidos nucleicos diana desde el depósito de la muestra, dejando al mismo tiempo más lentas PCR inhibidoras especies detrás (ver Figura 4). <ol><li> Obtener una muestra de la cultura o E. células de E. a una densidad superior a 10 8 UFC / ml. </li><li> Transferir 1 ml de cultivo celular en un tubo de microcentrífuga seguro de bloqueo y el precipitado por centrifugación a 4000 g durante 6 minutos. </li><li> Vuelva a suspender el precipitado en 80 l RNasa libre de agua y se añaden 10 l de agente de lisis que consta de tricina 10 mM, 10 mM de Bis-Tris, 2 mM EDTA, 0,1% de Triton-X, y 5 mg / ml de lisozima. Mezclar suavemente e incubar durante 5 minutos. a temperatura ambiente (protocolo de lisis adaptado de Bercovici et al. 11). </li><li> Añadir 10 l de hidróxido sódico 1 M para elevar el pH lisado a ~ 12,5. Suavemente activar la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta quela solución se aclare, en la que el punto de lisis se ha completado. </li><li> Combinar 10 l de lisado con 90 l de tricina 50 mM y 100 mM Bis-Tris. Esta solución puede utilizarse ahora como el TE. </li><li> Preparar 1 ml de LE que consta de 500 mM Bis-Tris, 250 mM de HCl, 1% de PVP, y 1X SYBR Green II. Llene el chip de microfluidos con LE, como se describe en la Parte 3. </li><li> Con el fin de extraer el ácido nucleico purificado por fuera del chip análisis después de ITP, reemplazar el contenido del depósito Este con un LE-PCR compatible que contiene 50 mM Tris-bis, 25 mM de HCl, y 0,1% de PVP. Aplicar 1000 V entre el Este y el Oeste de los pozos comenzar el experimento. La corriente entre estos depósitos se reducirá. </li><li> Al final del experimento la muestra se eluye en el depósito de OI. Coincidiendo con esta elución, el tiempo frente al actual de este sistema por lo general alcanza un valor de meseta (ya que la resistencia está ahora dominada por los iones TE distribuidas uniformemente dentro del canal). Mezclar con cuidado el depósitocontenidos por parte de pipeteo repetido y extraer un volumen de 5 l para el análisis por RT-PCR cuantitativa. </li></ol> 5. La separación de los aminoácidos catiónicos con el modo de meseta de ITP y el trazador no de enfoque (OFN) para la visualización ITP se puede utilizar para separar y concentrar los iones pequeños en mesetas adyacentes y detectable entre el TE y LE. Esto permite la detección e identificación basados ​​en las propiedades fisicoquímicas, tales como la conductividad local, absorbancia UV, detección de la temperatura, o el índice de refracción. Aquí nos demuestran un no-centrado trazador (NFT) de ensayo donde se agrega un fluorescente, co-iónico especie a la LE. Esta especie fluorescente no se centra, pero su concentración se adapta a un campo eléctrico local, y permite así la visualización de las zonas de meseta purificados (ver Figura 5). <ol><li> Preparar 1 ml LE consta de etanolamina 100 mM, 200 mM de tricina, y 1% de PVP, y 100 mM de la 6G fluoróforo rodamina catiónico. </li> &lt;li&gt; Preparación 1 ml de TE que consta de 20 mM Tris, 40 mM de tricina. Preparar la muestra mediante la mezcla de 90 l de TE con 10 l cada uno de arginina 50 mM y 50 mM de lisina. </li><li> Distribuir 20 l LE en el Oeste y los embalses del Norte y la muestra en el embalse de Oriente. Aplicar un vacío en el embalse del Sur durante 1 min. </li><li> Enjuague bien con el Oriente DI y reemplazar con TE (TE sin muestra). </li><li> Aplicar 500 V entre el este y el oeste de los embalses. </li></ol> 6. Los resultados representativos Se demuestra isotachopherograms de experimentos modo de pico en la Figura 2b y experimentos de extracción de ácidos nucleicos en la Figura 4. En los experimentos de modo pico con un reportero fluorescente (por ejemplo AF488, SYBR Green II), la intensidad de fluorescencia en general se pueden integrar y se compara con una curva de calibración para obtener información de la concentración cuantitativa. 12 Adicionalmente, en experimentos de ácidos nucleicos de extracción, la muestra se deja eluir en tél LE depósito y se extrae con una pipeta para el análisis cuantitativo por RT-PCR. 10,12 Mostramos isotachopherograms meseta modo para la separación de aminoácidos en la Figura 5. La intensidad de fluorescencia (en relación con la intensidad de TE LE o zona) se puede utilizar para la identificación de zona, mientras que las anchuras de zona permitir la cuantificación. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Figura 1. Isotachophoresis (PTI) es una técnica electrocinético utilizado en aplicaciones de microfluidos para la detección sensible y separación de iones. ITP ofrece la separación, enfoque selectivo, y la capacidad de preconcentración. Además, es extremadamente robusta e insensible a las perturbaciones físicas debido a su naturaleza auto-afilado. Iones de la muestra selectiva se centran entre un electrolito principal (LE) y final (TE) y viajan a través del microcanal a una velocidad constante determinada por la velocidad de los iones principales en la zona de LE. Iones de la muestraconcentrarse si su movilidad electroforética efectiva se encuentra entre corchetes por la movilidad efectiva de los iones de LE y TE. El esquema representa un experimento modelo de ITP en donde la muestra se centra de forma continua entre el LE y zonas de TE. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Figura 2. Diluir la muestra se centran iones en modo &quot;pico&quot; de la PTI. a) Dos distinta diluido (c muestra &lt;&lt; c LE) se centran en el modo de pico de las especies en la interfase formada entre el LE y zonas de TE. Únicamente la LE y TE determinar el campo eléctrico, como las especies de la muestra no contribuyen significativamente a la actual. Los iones de ejemplo son mezclados con TE (en una inyección semi-infinita) y centrarse juntos en un pico de aproximadamente gaussiana en la interfase de ITP. Centrándose criterio (que se muestra como desigualdades) se aplica a las especies fuertemente ionizados. b) Los experimentos muestran Alexa Fluor 488 (AF488) se centró en el modo de alta para una amplia gama de corrientes aplicadas (véase también Video 1). Ejemplo de ancho pico es inversamente proporcional a la corriente (por dispersión insignificante advectivo debido al flujo electroosmótico). 14 La interfaz de autoafilado es resistente a la dispersión debido a la presión impulsada por flujo (ver Video 2). <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Figura 3. Iones de la muestra en un foco de concentración lo suficientemente alta en el modo &quot;meseta&quot; y gobiernan la conductividad local. Por lo general introducen iones de la muestra en una inyección finita entre el TE y LE. En esta modalidad, los iones de la muestra por separado y el orden de acuerdo a su movilidad electroforética efectiva (ver video 3). Para las especies fuertemente ionizados, el TE y concentraciones de meseta de la zona están determinadas por la función reguladora de Kohlrausch (KRF, un conjunto invariante inicialmente por la zona LE). Diluir los iones de seguir centrándose en el modo de pico entre la meseta entre paréntesis de sus zonas de movilidad efectiva. Centrándose criterion (se muestra como la desigualdad) se aplica a las especies fuertemente ionizados. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Figura 4. Lisado preparación y extracción de ácidos nucleicos con PTI modo de pico. El ácido nucleico se extrae de E. E. cultivo celular utilizando lisozima asistido por lisis alcalina y se purificó mediante electroforesis selectivo centrado a través de ITP. TE mezclado con lisado (marrón) contiene ácido nucleico diana (verde), proteínas, y los potenciales químicos que inhiben la PCR. La selección apropiada de arrastre y que conduce iones permite selectiva de enfoque de ácido nucleico diana, dejando detrás de inhibidores de la PCR. Total de ácidos nucleicos pico de ITP a menudo adquiere una forma no ideal, como se muestra aquí en la imagen insertada. Como una demostración de este ensayo, se extrajeron ácido nucleico total de bacterias gram-negativas, Escherichia coli (lisadas con una solución de hidróxido de sodio solo), NA purificada de lisado con PTI, recogidosel. se extrae material genético, y se realizó QRT-PCR para verificar la purificación exitosa de ARNr 16S (rojo) y del ADNr (verde) 16S de cultivo bacteriano Ciclos negativos del umbral de control para ARNr 16S (azul) y 16S rDNA (amarillo) fueron cada uno por encima de 30 ciclos. Se realizó QRT-PCR utilizando SYBR Green Power ARN a C T 1-Step Kit de Applied Biosystems con 150 nM adelante (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) y atrás primers (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC), en los ciclos térmicos condiciones recomendadas. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Figura 5. No centrándose trazador (NFT) de ensayo para la separación y la detección de aminoácidos no marcados. a) Esquema del ensayo NFT. Una inyección finito de iones de la muestra se introduce en el canal de Oriente. Mezclamos la LE con un fluoróforo marcador catiónico con menor movilidad eficaz que los iones de TE (trazador μ &lt;μ TE). El fluoróforose dice que actúa como un &quot;marcador underspeeding&quot;. A medida que el fluoróforo electromigrates de la LE en zonas ahora ocupadas por mesetas muestra y TE, experimenta un campo eléctrico más elevado y, por tanto su concentración aumenta. Este cambio en la concentración crea pasos en el isotachopherogram. b) Separación de dos aminoácidos, arginina y lisina, utilizando el ensayo de NFT con Rodamina 6G como el trazador underspeeding fluorescente. El pico ligero entre el TE y arginina es común en ITP, no se entiende bien, y aquí no interfiere con la detección o cuantificación de las mesetas. Película de consulta 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película suplementario</a> . Película de consulta 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película suplementario</a> . Película de consulta 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película suplementario</a> .

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No tenemos nada que revelar.

Los métodos que aquí se presenta PTI permitir la detección rápida, sensible y robusto y la manipulación de moléculas iónicas. El principal desafío en el uso de la PTI es la elección adecuada de los buffers LE y TE. En PTI aniónico, típicamente cloruro de elegir como el anión principal, ya que es un ácido fuerte con movilidad absoluta muy alta y por lo tanto tiene propiedades muy predecibles. Por lo tanto, la elección de buffer en aniónico PTI se reduce típicamente a la elección de un adecuado TE y contraión. Para los experimentos se centran selectiva, la elección de TE es fundamental para la exclusión de la contaminación de los iones. En aplicaciones en las que los contaminantes no están presentes, menor movilidad TE eficaz conduce a una mayor velocidad de enfoque. Se recomienda utilizar la siguiente, relativamente bien educados iones aniónicos TE: MES, MOPS, HEPES, tricine. Elección del contraión afecta tanto el pH del sistema y la movilidad TE eficaz. Contraiones comunes son tris (pKa 8,1) y bis-tris (pKa 6,4). Para los ensayos que requieren un pH menor o mayor, se recomienda piridina (pK 5,25) yetanolamina (pKa 9,5), respectivamente. En las Tablas 1 y 2, para la PTI aniónicos y catiónicos, respectivamente, se resumen algunos ejemplos de amortiguamiento útiles. Tomamos como el HCl aniónicos de iones de sodio LE y como el ión catiónico LE, y asumirá el 100 mM de la fuerza iónica del tampón LE. El lector observará que la fuerza iónica tampón en nuestros protocolos (y en las Tablas 1-2) es siempre mayor que o igual a 10 mM. Aunque en teoría la física de PTI se aplica a la fuerza iónica menor que 10 mM, contaminantes naturales (por ejemplo ácido carbónico de la reacción entre el agua y el dióxido de carbono atmosférico) cerca del nivel de 1 mM a menudo limitan el uso práctico de bajos tampones de fuerza iónica. Observamos que mecanismo de transducción de señales no se limita a los ensayos presentados en este protocolo. Como se mencionó brevemente en la parte 5, en el modo de meseta purificada zonas pueden ser detectados a través de cambios en la conductividad local, absorbencia UVBance, la temperatura, o el índice de refracción. En nuestro propio grupo, hemos desarrollado un método que utiliza anfolitos fluorescentes portadoras para la detección sensible e identificación de analitos desconocidos. 5 En los experimentos de modo de pico, sondas específicas se puede utilizar para etiquetar analitos centrados. En un ejemplo, podemos utilizar balizas moleculares-sondas de oligonucleótidos que presentan fluorescencia a la hibridación de la secuencia de destino - para detectar el ADN de destino o de moléculas de ARN con una alta especificidad 11,18. Mientras que ITP es relativamente robusto a la dispersión causada por la presión impulsada por el flujo y EOF, EOF excesiva puede conducir al estancamiento de la interfaz de ITP, donde la velocidad media EOF se hace igual a la velocidad de ITP. 14 EOF fuerte Tal ocurre especialmente en condiciones de pH alto y baja fuerza iónica. Por esta razón, se recomienda el uso de tampones con pH de 8 o inferior y con la fuerza iónica del orden de 100 mm en caso conveniente. En nuestra experiencia, es el PVPmás eficaz para la supresión de revestimiento EOF en chips de borosilicato. Sin embargo, debido a sus propiedades de tamizado, PVP puede no ser apropiado para algunas aplicaciones, tales como el enfoque de ADN genómico. En los experimentos, se observa que la adición de PVP puede reducir enormemente la movilidad del ADN genómico total (hasta el punto en que no se centra). En estos casos un revestimiento de silanol tal como Sigmacote en conjunción con un agente tensioactivo (por ejemplo, Triton X-100) también pueden ser eficaces en la reducción de EOF. 10 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE anión (pKa -1) </td></tr><tr><td> Contraión de almacenamiento en búfer (pKa +1) </td><td> MES (6,10) </td><td> MOPS (7,20) </td><td> HEPES (7,50) </td><td> tricina (8.15) </td></tr><tr><td> etanolamina (9.50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6,40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> piridina (5,18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Magnitud de la movilidad efectiva (× 10 -9 m 2 / V / s) de la zona ajustada analito puro en ITP aniónico donde la LE es de 100 mM de HCl y 200 mM de tampón contraión. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE catión (pKa +1) </td></tr><tr><td> Contraión de almacenamiento en búfer (pKa -1) </td><td> etanolamina (9.50) </td><td> tris (8,08) </td><td> bis-tris (6,40) </td><td> piridina (5,18) </td></tr><tr><td> MES (6,10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7,20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7,50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricina (8.15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. La magnitud de movilidad efectiva (× 10 -9 m 2 / V / s) de la zona ajustada analito puro en ITP catiónico donde la LE es de 100 mM de sodio y 200 mM de tampón contraión.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REACTIVOS </td></tr><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Agua destilada </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNasa / DNasa libre </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> de hidróxido sódico (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> ácido clorhídrico (HCl) </td><td> Merck Chemicals </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma base (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polivinilpirrolidona (PVP) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 06067 </td><td> 1.000.000 MW </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 de ácido carboxílico </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lisozima </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> etanolamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Bélgica) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-aminoácidos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Power ARN a C T 1-Step Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; cebadores de PCR </td><td> Integrado de Tecnologías de ADN </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPO </td></tr><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Borosilicato chip de microfluidos </td><td> Caliper Life Sciences Inc. </td><td> NS12A </td><td> Se suministra con o sin plástico caddy </td></tr><tr><td> Bomba de vacío </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> SourceMeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Constantes los modos de intensidad y tensión constante de operación </td></tr><tr><td> Microscopio de epifluorescencia invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Utilice lámparas de mercurio (Olympus) o LED (Thorlabs) para la iluminación </td></tr><tr><td> Cubo de filtro </td><td> Omega </td><td> XF115-2 </td><td> La excitación / emisión: azul / verde </td></tr><tr><td> SeguroA bloquear los tubos de microcentrífuga </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1,5 ml de capacidad </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. Reactivos específicos y equipos.

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

Las técnicas electrocinéticas son un elemento básico de las aplicaciones a microescala, debido a su capacidad única para llevar a cabo una variedad de procesos de fluidos y la electroforesis en sistemas simples y compactas que no tienen partes móviles. Isotachophoresis (PTI) es una técnica simple y robusto electrocinético muy que puede alcanzar 1,2 millones de veces preconcentración y eficiente separación y extracción basado en la movilidad iónica. 3 Por ejemplo, hemos demostrado la aplicación de ITP a la separación y la detección sensible de etiqueta moléculas iónicas (por ejemplo, toxinas, ADN, rRNA, miRNA) con poca o ninguna muestra de la preparación y 4-8 a la extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de matrices complejas, incluyendo el cultivo de células, la orina y la sangre. 9-12 ITP logra centrado y separación utilizando un campo eléctrico aplicado y tampones dos dentro de un sistema de canales fluidos. Para los analitos aniónicos, el principal electrolito (LE) de amortiguación se elige sUCH que sus aniones tienen una mayor movilidad electroforética efectiva de los aniones del electrolito final (TE) tampón (movilidad efectiva describe la velocidad de desplazamiento observable de un ion y tiene en cuenta el estado de ionización del ion, tal como se describe en detalle por Persat et al . 13). Después de establecer una interfaz entre el TE y LE, un campo eléctrico se aplica de tal manera que los iones LE alejarse de la región ocupada por los iones de TE. Iones de la muestra de raza intermedia movilidad efectiva por delante de los iones de TE, pero no puede superar a los iones de LE, y por eso se concentran en la interfaz LE-TE (en adelante denominado el &quot;puerto ITP&quot;). Además, el TE y regiones LE forma de conductividad baja y alta, respectivamente, que establecen un fuerte gradiente de campo eléctrico en la interfaz de ITP. Este gradiente de campo preconcentrados especies de la muestra ya que se centran. La elección adecuada de TE y LE resultados en concentración y purificación de las especies objetivo de otras organizaciones no centradas en las especies y, eventualmente, la separación de und segregación de las especies de la muestra. Estamos aquí, revisar el ITP principios físicos subyacentes y discutir dos modos estándar de operación: &quot;pico&quot; y los modos de «meseta». En el modo de pico, relativamente diluida iones de la muestra se centran juntos dentro de superposición de picos estrechos en la interfaz de ITP. En el modo de meseta, iones de la muestra más abundantes alcanzar una concentración en estado estacionario y se segregan en adyacentes como zonas de meseta, ordenados por su movilidad efectiva. Modos de pico y la meseta se derivan de la física subyacente mismos, sino que representan diferentes regímenes diferenciados por la concentración del analito inicial y / o la cantidad de tiempo asignado para la acumulación de la muestra. En primer lugar, describir en detalle un pico modelo experimento modo y, a continuación demuestran un ensayo modo de pico para la extracción de ácidos nucleicos a partir de E. E. cultivo celular. Llegamos a la conclusión mediante la presentación de un ensayo de modo de meseta, donde se utiliza un trazador no se centran (OFN) las especies de visualizar la separación y porformar cuantificación de los aminoácidos.

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On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Isotachophoresis (ITP) es una separación sólida electrocinético y técnica de preconcentración con aplicaciones que van desde la detección de la toxina a la preparación de la muestra. Se revisan los principios físicos de la PTI y la metodología de aplicación de esta técnica a dos ejemplos de aplicaciones específicas: la separación y detección de moléculas pequeñas y purificación de ácidos nucleicos a partir de lisado de cultivo celular.

El chip Isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

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24.2K vistas.  Stanford University. Isotachophoresis (ITP) es una separación sólida electrocinético y técnica de preconcentración con aplicaciones que van desde la detección de la toxina a la preparación de la muestra. Se revisan los principios físicos de la PTI y la metodología de aplicación de esta técnica a dos ejemplos de aplicaciones específicas: la separación y detección de moléculas pequeñas y purificación de ácidos nucleicos a partir de lisado de cultivo celular.

Video: On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Investigación

Bioingeniería

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree en el chip tomográfica Microscopía empleo de multi-ángulo de iluminación y píxeles de super-resolución

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

On-Chip fenotipificación inflamatoria endotelial

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparación, purificación y uso de liposomas que contienen ácidos grasos

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Autoensamble de ácidos nucleicos de péptidos modificados con gamma en nanoestructuras complejas en mezclas de disolventes orgánicos

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.