Nous tenons à remercier le financement de la DARPA parrainé Micro Focus / Nano Fluidics Fundamentals (MF3) Centre sous le numéro N66001-10-1-4003, et de la DARPA subvention N660001-09-C-2082.

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	<li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis.">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li><li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis.">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li><li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. 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Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li><li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons.">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li><li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis.">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li><li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I:+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers.">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li><li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+dispersion+in+isotachophoresis.">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li><li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l&#214;sungen+und+l&#214;sungsgemischen.">&#220;ber concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von l&#214;sungen und l&#214;sungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li><li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases.">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li><li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations.">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li><li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons.">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les méthodes présentées ici ITP permettre la détection rapide, sensible et robuste et la manipulation des molécules ioniques. Le principal défi dans l&#39;utilisation de PTI est un choix approprié de tampons LE et TE. Dans le PTI anionique, nous choisissons généralement que l&#39;anion chlorure de premier plan, car il est un acide fort avec une mobilité absolue très élevée et donc a des propriétés très prévisibles. Par conséquent, le choix de mémoire tampon dans anionique ITP est généralement réduit à choisir un bon TE et contre-ion. Pour sélectifs des expériences axées, le choix TE est essentiel à l&#39;exclusion de contamination des ions. Dans les applications où les contaminants ne sont pas présents, inférieure TE mobilité efficace accélère le taux de mise au point. Nous vous recommandons d&#39;utiliser ce qui suit, relativement bien comportés-anioniques ions TE: MES, MOPS, HEPES, tricine. Choix de contre-ion affecte à la fois le pH du système et TE de mobilité efficace. Contre-courants sont tris (pKa 8,1) et de bis-tris (pKa 6,4). Pour les essais nécessitant un pH inférieur ou supérieur, nous vous recommandons la pyridine (pKa 5,25) etéthanolamine (pKa 9,5), respectivement. Dans les tableaux 1 et 2, pour le PTI anioniques et cationiques, respectivement, nous résumons plusieurs exemples de tampons utiles. Nous prenons HCl comme l&#39;ion anionique LE et de sodium comme ions cationique LE, et nous n&#39;assumons 100 mm Résistance ionique du tampon LE. Le lecteur notera que la force ionique du tampon dans nos protocoles (et dans les tableaux 1-2) est toujours supérieure ou égale à 10 mM. Si, en théorie de la physique des ITP s&#39;applique à une force ionique inférieure à 10 mM, contaminants naturels (par exemple l&#39;acide carbonique provenant de la réaction entre l&#39;eau et du dioxyde de carbone atmosphérique) près du niveau 1 mM limitent souvent l&#39;utilisation pratique de faibles tampons de force ionique. Nous notons que le mécanisme de transduction du signal ne se limite pas aux essais présentés dans ce protocole. Comme nous l&#39;avons brièvement dans la partie 5, en mode plateau purifié zones peuvent être détectées par les changements de conductivité locale, ABSORPTION UVBance, la température, ou d&#39;un indice de réfraction. Dans notre propre groupe, nous avons développé une méthode qui utilise des ampholytes porteurs fluorescents pour la détection sensible et l&#39;identification des analytes inconnus. 5 Dans des expériences de mode de pointe, des sondes spécifiques peuvent être utilisés pour étiqueter les analytes ciblés. Dans un exemple, nous utilisons des balises moléculaires - des sondes oligonucléotidiques qui sont fluorescents lors de l&#39;hybridation à leur séquence cible - pour détecter l&#39;ADN cible ou des molécules d&#39;ARN avec une grande spécificité 11,18. Bien que le PTI est relativement robuste à la dispersion causée par la pression axée débit et EOF, EOF excessive peut conduire à la stagnation de l&#39;interface ITP, où la vitesse moyenne EOF devient égale à la vitesse ITP 14. EOF Cette forte se produit surtout dans des conditions de pH élevé et la force ionique faible. Pour cette raison, nous recommandons l&#39;utilisation de tampons avec un pH de 8 ou moins, et avec la force ionique de l&#39;ordre de 100 mm si commode. Dans notre expérience, PVP est leplus de revêtement efficace pour la suppression EOF en jetons de borosilicate. Toutefois, en raison de ses propriétés de tamisage, le PVP peut ne pas être approprié pour certaines applications, telles que se concentrer l&#39;ADN génomique. Dans les expériences, nous observons que l&#39;ajout de PVP peut réduire considérablement la mobilité ADN génomique absolue (au point où il ne se concentre pas). Dans ces cas, un revêtement silanol tels que Sigmacote en conjonction avec un agent tensio-actif (par exemple Triton X-100) peut également être efficace dans la réduction de EOF 10. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Anion TE (pKa -1) </td></tr><tr><td> Contre-ion tampon (pKa +1) </td><td> MES (6,10) </td><td> MOPS (7,20) </td><td> HEPES (7,50) </td><td> tricine (8.15) </td></tr><tr><td> éthanolamine (9.50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6,40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> pyridine (5.18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. L&#39;ampleur de mobilité effective (× 10 -9 m 2 / V / s) de la zone analyte pure corrigée dans ITP anionique où la LE est de 100 mm et 200 contre-HCl tampon mM. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Cation TE (pKa +1) </td></tr><tr><td> Contre-ion tampon (pKa -1) </td><td> éthanolamine (9.50) </td><td> tris (8,08) </td><td> bis-tris (6,40) </td><td> pyridine (5.18) </td></tr><tr><td> MES (6,10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7.20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7,50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricine (8.15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. L&#39;ampleur de mobilité effective (× 10 -9 m 2 / V / s) de la zone analyte pure corrigée dans ITP cationique où le LE est de 100 mM de sodium et 200 mM tampon contre-ion.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REACTIFS </td></tr><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> L&#39;eau distillée </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNase / DNase </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> l&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> de l&#39;acide chlorhydrique (HCl) </td><td> EMD Chemicals </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma de base (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polyvinylpyrrolidone (PVP) </td><td> Polysciences Inc </td><td> 06067 </td><td> MW 1000000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 d&#39;acide carboxylique </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lysozyme </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> éthanolamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Belgique) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-aminoacides </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> Puissance SYBR Green ARN-to-C T 1-Step Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; amorces de PCR </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> ÉQUIPEMENT </td></tr><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Borosilicate puce microfluidique </td><td> Caliper Life Sciences Inc </td><td> NS12A </td><td> Livré avec ou sans plastique caddy </td></tr><tr><td> Pompe à vide </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> SourceMeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Constant courants et constants modes de fonctionnement de tension </td></tr><tr><td> Microscope inversé à épifluorescence </td><td> Olympe </td><td> IX70 </td><td> Utilisez lampe au mercure (Olympus) ou LED (Thorlabs) pour l&#39;éclairage </td></tr><tr><td> Filtre cube </td><td> Oméga </td><td> XF115-2 </td><td> Excitation / émission: bleu / vert </td></tr><tr><td> Coffre-fort-Verrouiller microtubes </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> Une capacité de 1,5 mL </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Réactifs et équipements spécifiques.

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

Techniques électrocinétiques sont un aliment de base des applications à micro-en raison de leur capacité unique d&#39;effectuer une variété de processus fluidiques et électrophorétique dans des systèmes simples et compacts sans pièces mobiles. Isotachophorèse (PTI) est une technique simple et très robuste qui peut atteindre électrocinétique de séparation 1,2 million de fois préconcentration et efficace et d&#39;extraction basée sur la mobilité ionique. 3 Par exemple, nous avons démontré l&#39;application du PTI à la séparation et la détection sensible de non marqué molécules ioniques (par exemple les toxines, de l&#39;ADN, d&#39;ARNr, miRNA) avec peu ou pas de préparation de l&#39;échantillon 4-8 et à l&#39;extraction et la purification des acides nucléiques à partir des matrices complexes, y compris la culture cellulaire, de l&#39;urine et le sang. 9-12 PTI réalise focalisation et de séparation utilisant un champ électrique appliqué et deux tampons de canal dans un système fluidique. Pour les analytes anioniques, le premier électrolyte (LE) tampon est choisi sette que ses anions ont une plus grande mobilité électrophorétique effective que les anions de l&#39;électrolyte de fuite (TE) du tampon (mobilité efficace décrit la vitesse de dérive observable d&#39;un ion et prend en compte l&#39;état d&#39;ionisation de l&#39;ion, tel que décrit en détail par Persat et al . 13). Après l&#39;établissement d&#39;une interface entre les électrodes en tungstène et LE, un champ électrique est appliqué de telle sorte que les ions LE s&#39;éloigner de la région occupée par des ions TE. Ions de l&#39;échantillon de la race la mobilité efficace intermédiaire avant d&#39;ions TE, mais ne peut pas dépasser ions LE, et aussi ils se concentrent à l&#39;interface LE-TE (ci-après dénommé l &#39;«interface ITP&quot;). En outre, le TE et les zones de formulaire de la conductivité LE respectivement basse et haute, qui établissent un gradient de champ raide électrique à l&#39;interface ITP. Ce gradient de champ des pré-espèces des échantillons car ils se concentrent. Le bon choix des résultats TE et LE dans la focalisation et la purification des espèces cibles à partir d&#39;autres non-ciblées espèces et, finalement, la séparation uneségrégation des espèces d-échantillon. Nous revoyons ici le PTI physique principes qui sous-tend et de discuter de deux modes de fonctionnement: standard &quot;de pointe&quot; et &quot;plateau&quot; modes. En mode de pointe, relativement diluée ions de l&#39;échantillon se concentrer ensemble au sein de chevauchement des pics étroits à l&#39;interface ITP. En mode plateau, ions de l&#39;échantillon plus abondantes atteindre une concentration en régime permanent et séparer en adjacentes plateau-comme zones ordonnées par leur mobilité efficace. Modes de pointe et le plateau se posent sur les mêmes sous-jacents de physique, mais représentent des régimes distincts différenciés par la concentration de l&#39;analyte initiale et / ou la quantité de temps alloué pour l&#39;accumulation de l&#39;échantillon. Nous avons d&#39;abord décrire en détail une expérience en mode modèle de pointe et alors démontrer un essai en mode de pointe pour l&#39;extraction des acides nucléiques à partir de E. la culture de cellules Escherichia. Nous concluons en présentant une analyse en mode plateau, où nous utilisons un non-focalisation traceur (NFT) espèces de visualiser la séparation et parformer quantification d&#39;acides aminés.

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On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Isotachophorèse (PTI) est une séparation solide électrocinétique et de la technique de préconcentration avec des applications allant de la détection de la toxine à la préparation des échantillons. Nous passons en revue les principes physiques de l&#39;ITP et la méthodologie de l&#39;application de cette technique à deux exemples d&#39;applications spécifiques: la séparation et la détection de petites molécules et de purification des acides nucléiques à partir de lysat de culture cellulaire.

Sur la puce isotachophorèse pour la séparation des ions et purification des acides nucléiques

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

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