وقدمت التمويل اللازم لتطوير ماصة في استخراج جزء من قبل البحوث الداخلية ومنح التنمية التي منحت لDRP.

1. عينة تحلل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تكون العينات في شكل سائل. إذا العينة الصلبة، على سبيل المثال الطعام أو البراز، ينبغي تعليق عينة في وسائل الإعلام السائلة مثل المياه أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 500 ميكروليتر من العينة مع 500 ميكرولتر من ملح حامض الثيونيك جوانيداين 6M (درجة الحموضة 6.5) في أنبوب 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض لمبة لماصة الاستخراج، وطرد الهواء المحيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب كامل عينة 1 مل في ماصة الاستخراج، وأكثر من المواد الماصة، من خلال السماح لمبة لتوسيع ببطء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس أداة استخراج مثل تلك المواد الماصة الخرز واستنزاف العينة إلى لمبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن حبات المواد الماصة مع العينة في البصلة والحرص على عدم طرد عينة من ماصة الاستخراج. </li></ol> 2. النووي استخراج حمض (الشكل 1، لوحة أ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس ماصة استخراج (فتح الهابط) وطرد العينة في أنبوب الأصلي 1.5 مل. </li> &lt;لى&gt; سحب كامل عينة 1 مل في ماصة الاستخراج، ويمر عبر المواد الماصة، بمعدل معتدل، والحرص للحفاظ على المواد الماصة في عنق ماصة الاستخراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد العينة بأكملها في أنبوب 1.5 مل بالضغط على لمبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.2 و 2.3، ويمر العينة على مدى أربع مرات أكثر المواد الماصة للما مجموعه 5 تمريرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور 5 على المواد الماصة، وطرد كامل عينة 1 مل إلى 4mL من البروتين العازلة الاستخراج (في أنبوب 15 مليلتر مخروطي الشكل)، أغلق أنبوب، ويوضع جانبا لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأحماض النووية المعزولة عن طريق تمرير 1 مل من الايثانول 95٪ على مدى ثلاث مرات المواد الماصة، وإعادة الايثانول إلى أنبوب الأصلي عند مرور نهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.6 باستخدام 2 1 مل، 95٪ غسيل الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضغط والافراج عن لمبة لمدة 5 دقائق، ويمر الهواء المحيط في جميع أنحاء ماصة استخراج لتجفيف الأحماض النووية / سرير المواد الماصة. مسح الايثانول المتبقية من غيض من يو ماصة استخلاصغناء Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة الأحماض النووية عن طريق تمرير 250 ميكرولتر من تريس 10 ملم (6.8 درجة الحموضة) على مدى خمس مرات المواد الماصة. ويمكن الاستعاضة عن تريس العازلة من قبل أي حل آخر مائي مناسب مثل برنامج تلفزيوني. الحل الناتج يحتوي على الأحماض المستخرجة النووية. </li></ol> 3. استخراج البروتين (الشكل 1، لوحة ب) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط العينة وأنبوب بروتين العازلة الاستخراج من الخطوة 2.5 بواسطة انقلاب وتمرير ما يقرب من 2-3 ملليلتر من هذه العينة 5 مل عبر المواد الماصة للماصة استخراج جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد العينة بأكملها في أنبوب مخروطي الشكل نفسه 15mL الحرص للحفاظ على المواد الماصة في عنق ماصة الاستخراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3.1 و 3.2، ويمر على عينة على مدى 15 مرة سبخة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المواد الماصة وبروتين محدد عن طريق تمرير 1 مل من الايثانول 95٪ فوق السرير المواد الماصة ثلاث مرات، وطرد من الايثانول إلى أنبوب انها الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 3.4 باستخدام 2 1 مل، 95٪ غسيل الايثانول. </li><html><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضغط والافراج عن لمبة لمدة 5 دقائق، ويمر الهواء المحيط في جميع أنحاء ماصة استخراج لتجفيف بروتين / سرير المواد الماصة. مسح الايثانول المتبقية من غيض من ماصة استخراج باستخدام kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة بروتين عن طريق تمرير 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على مدى خمس مرات المواد الماصة. ويمكن استبدال العازلة في برنامج تلفزيوني من قبل أي حل آخر مائي مناسب مثل تريس 10 ملم (6.8 درجة الحموضة). الحل الناتج يحتوي على البروتين من العينة. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="رقم 1A" /> الشكل 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="الشكل (3)" /> الشكل 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. محتوى &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5.

<ol>
	<li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries,+1984-2005.">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li><li>Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+Pipette.">Extraction Pipette.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample.">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli.">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li><li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea.">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li><li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain.">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li><li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages.">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes.">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الأداة، كيمياء وبروتوكول المبينة في هذا التقرير تمثل أول مثال معروف من الكهرباء خالية، نظام استخراج متعددة جزيء التي يمكن استخدامها في مجال التطبيقات المستندة إلى نقطة من الرعاية، و. ويمكن تطبيق هذين النوعين جزيء إلى عدد من المتلقين للأجهزة التشخيص أو التحليلية. على سبيل المثال، الأحماض النووية المعزولة هي من نوعية PCR (الشكل 2 و 3) في حين أن البروتين مكون من العينة هو متفاعل مناعيا (الشكل 4). ويمكن الاستفادة من هذا النظام استخراج في مناطق محدودة التقشف أو مورد في العالم خفض كبير في عبء المرض على السكان الذين يعيشون هناك. ويمكن هذا النظام استخلاص تساعد أيضا في برامج مراقبة الأمراض في جميع أنحاء العالم من خلال توفير وسيلة قوية وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لتجهيز العينات في مواقع التقشف أو بعيد. أحد الجوانب الهامة لطريقة استخراج المبينة أعلاه هو أنيمكن تعديله من قبل المستخدم. على سبيل المثال، في الحالات التي يكون فيها حجم العينة أكبر أو أقل من 500 μLs الأولية (الخطوة 1.2)، يمكن للمستخدم ضبط كميات من المواد الكاشفة وفقا لذلك. وهذا هو، على نسبة حجمية من الكواشف لحجم العينة يجب أن تبقى ثابتة بينما يمكن تغيير وحدات التخزين مطلقة. أيضا، ويمكن أيضا إدخال تعديلات على عدد من الممرات خلال ماصة يتم وفقا لتقدير المستخدم. وعلى سبيل المثال، إذا تم استخدام حجم أكبر عينة، ويمر على عينة أكثر من مرة في أكثر من المواد الماصة المذكورة (الخطوات 2،4 و 3.3) تزيد من احتمال نوع جزيء (الحامض النووي أو البروتين) الاتصال المواد الماصة. وينبغي أن الزيادة في الممرات زيادة كفاءة التقاط حتى يتم التوصل إلى تشبع المواد الماصة. لقد وجدنا أن أداة استخراج وكيمياء يرتبط بها من بعض القيود، وأهمها هو أن كيمياء استخراج بروتين غير فعالة لاسترداد الغليكوزيلاتي جداالبروتينات. في حال التشخيص المصب يستهدف بروتين الغليكوزيلاتي، وهذا قد لا يكون مثاليا نظام لتحديد الهوية. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال في الحدود العليا والدنيا من الكفاءة سواء لاستخلاص الأحماض النووية أو البروتينات التي يجري تحديدها، والتحسين جار لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الانتعاش. ومزيد من تطوير أداة تغلب على هذه الفجوات في المعرفة الحالية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> جوانيداين ملح حامض الثيونيك </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-بروبانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 109827-1L </td></tr><tr><td> جيش صرب البوسنة </td><td> سيغما </td><td> A-4503 </td></tr></tbody></table>

electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation

مسببات الأمراض التقليدية والناشئة، مثل كولاي Enterohemorrhagic (EHEC)، طاعون يرسينيا، أو الأمراض البريونية المستندة إلى مصدر قلق كبير بالنسبة للحكومات والصناعات والمهن الطبية في جميع أنحاء العالم. على سبيل المثال، EHECs، جنبا إلى جنب مع الشغيلة، هي المسؤولة عن وفاة ما يقرب من 325000 طفل كل عام، وتنتشر بشكل خاص في العالم النامي حيث المختبرات لتحديد الهوية، وشائع في الولايات المتحدة، غير متوفرة 1. تطوير وتوزيع منخفضة التكلفة، ويمكن على الصعيد الميداني، نقطة من الرعاية أدوات للمساعدة في التعرف السريع و / أو تشخيص مسببات الأمراض أو علامات المرض تغير بشكل كبير تطور المرض والتشخيص للمرضى. قمنا بتطوير أداة لعزل الأحماض النووية والبروتينات من عينة بواسطة الصلبة مرحلة الاستخراج (SPE) من دون كهرباء أو يرتبط بها من معدات المختبرات 2. يمكن استخدام الجزيئات معزولة عن diagnoالهيئة العامة للاستعلامات سواء في المختبر أو إلى الأمام باستخدام الميدانية نقطة من الرعاية المنصات. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يوفر للمقارنة المباشر للحامض النووي وبيانات بروتين من عينة من الامم المتحدة والانقسام، وتقدم الثقة من خلال التثبت من التحليل الجيني والبروتين. أداة لدينا العزلة يستخدم معيار الصناعة لالصلبة مرحلة العزلة الحمض النووي، والتكنولوجيا الازدهار، الذي يعزل الأحماض النووية من محلول ملحي chaotropic، وعادة ما جوانيداين الفصيلة، من خلال الربط إلى السيليكا المستندة إلى جزيئات أو 3 مرشحات. ويستخدم CUBRC في الملكية كيمياء استخراج الصلبة مرحلة لتنقية البروتين من الحلول ملح chaotropic، في هذه الحالة، من النفايات أو من خلال تدفق، بعد عزل الحمض النووي 4. من قبل التعبئة والتغليف جيدا تتميز كيمياء في منصة صغيرة وغير مكلفة وبسيطة، لقد ولدت لدينا نظام محمول للحامض النووي واستخراج البروتين التي يمكن القيام بها في ظل فارiety من الشروط. الأحماض النووية المعزولة في حالة مستقرة ويمكن أن ينتقل إلى وضع يمكنها من حيث القوة هو متاح لتضخيم PCR بينما يمكن على الفور محتوى البروتين يمكن تحليلها بواسطة باليد أو غيرها من المقايسات المناعية مقرها. ويمكن التعرف السريع على علامات مرض في مجال تغير بشكل ملحوظ نتيجة للمريض من خلال توجيه مسار السليم للعلاج في مرحلة مبكرة من تطور المرض. الأداة والطريقة الموصوفة هي مناسبة للاستخدام مع وكيل أي عمليا المعدية وتوفر للمستخدم التكرار نوع من التحليلات المتعددة جزيء في الوقت ذاته من عبء لوجستية.

حمض النووي العزلة: الأحماض النووية المعزولة هي PCR amplifiable وخالية من التلوث من البروتين. مثال 1: الأحماض النووية المستردة هي مناسبة للاستخدام في التطبيقات المستندة إلى PCR. على سبيل المثال، ويبين الشكل 2 التضخيم من الجينات توكسين شيغا المرتبطة E. Enterohemorrhagic O157 كولاي: H7 سلالة مؤسسة كهرباء لبنان-933 (آي تي سي سي # 35150) من إجراء استخراج الحمض النووي / بروتين باستخدام ماصة الاستخراج. تم العثور على جينات توكسين شيغا STX 1 و 2 على STX عاثية امدا مثل المعتدلة وعاثية معيبة في E. Enterohemorrhagic هذه وغيرها من سلالات بكتيريا تحت سيطرة المروج R ف 5 6 7 8. تفعيل استجابة SOS في E. القولونية يؤدي إلى طليعة العاثية الاستقراء و / أو إنتاج السم 9. لقد استخدمت لدينا نسخة معدلة من فحص PCR المضاعفة بواسطة فنغ وآخرون. 1من 1 إلى التعرف على الجينات (1) وSTX STX 2 في كل من الثقافة وعينات من مياه الصرف الصحي ارتفعت. حارات A و B في الشكل 2 تظهر نتائج تضخيم PCR لعينة ثقافة غير المجهزة (حارة A) وعينة ثقافة المجهزة (الصف B). هذه النتائج هي معنى مطابقة تقريبا ليست هناك خسارة من الدقة في الأحماض النووية المجهزة أو معزولة. نحن تضخيم المقبل مياه الصرف الصحي الخام ارتفعت (حارة D) أو الأحماض النووية المعزولة من مياه الصرف الصحي ارتفعت (حارات E &amp; F). هذه المعطيات تشير إلى أن الأحماض النووية معزولة أدت إلى مزيد من التضخيم مقابل الأحماض النووية غير المعزولة من عينات مياه الصرف الصحي ارتفعت. نستنتج إذن أن أزيلت إما مثبطات PCR بطبيعة الحال وجدت في مياه الصرف الصحي على العزلة أو التي كانت تتركز الأحماض النووية على العزلة. مزيج من هذه الفرضيات اثنين هو ممكن أيضا. تم استخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية القادمة لإظهار أن الأحماض النووية المعزولة كانت حرة نسبيا سبروتين و تلوث. ويبين الشكل 3 أطياف الأشعة فوق البنفسجية من اثنين من E. القولونية O157: H7 حامض النووي الاستخراج، والعزلة وصفها بأنها وباء العزلة، بالمقارنة مع طيف تطبيع للثقافة البكتيرية، وصفت قبل العزلة. أطياف الأشعة فوق البنفسجية من الأحماض النووية المعزولة تمثل أطياف من الأحماض النووية محض، وجود نسبة محسوبة من الامتصاصية بين 260 نانومتر و 280 نانومتر تقترب من 1.8 10. هذه البيانات تظهر أن هناك القليل جدا من البروتين في تلويث جزء الحمض النووي استردادها باستخدام تقنية وصفها. عزل بروتين: بروتين تعافى من التجربة النووية العزلة حامض / بروتين غير متفاعل مناعيا ومتطابقة electrophoretically على بروتين نقي. مثال 2: تم تطبيق جزء من البروتين المعزولة إلى E. RapidChek القولونية O157 فحص تدفق الوحشي شرائط (SDIX، وشركة). ضوابط تظهر هوية إيجابية في جميع العينات التي تؤوي E. كولاي<html> O157، مع أو من دون STX الاستقراء (الشكل 4، والممرات وباء وجيم، على التوالي). البيانات في الشكل (4) كما تظهر نتائج إيجابية لتلك العينات ايواء E. القولونية O157 التي تم تجهيزها لالأحماض النووية والبروتين ثم باستخدام ماصة الاستخراج. هذه المعطيات تشير إلى أن بروتين معزولة عن بعضها العينة متفاعل مناعيا وبالتالي التسبب ردا ايجابيا. تم تنفيذ PCR التضخيم (كما هو موضح في مثال 1) في عينات من البروتين لإظهار أن جزء من البروتين المعزولة كان خاليا من تلويث الأحماض النووية. وكانت نتائج هذه التجارب جميعها سلبية من قبل الكهربائي للهلام. وبالتالي، فإننا نستنتج أن تم فصل محتوى البروتين من العينة من تلويث الأحماض النووية. هذه النتائج، التي اتخذت في كامل مع تلك التي وصفها لهذا المعرض الحمض النووي خطوة العزلة التي يتم عزل الأحماض النووية والبروتين في خطوات تجزئة منفصلة. تي &quot;&gt; مثال 3:. البروتين المعزول هو مناسبة لالكهربائي 10 الشكل 5 يصور coomassie ملطخة 8٪ هلام الأكريلاميد محملة جيش صرب البوسنة (الشكل 5، والممرات C &amp;) وجيش صرب البوسنة المعزولة من الفصيلة جوانيداين 6M باستخدام ماصة استخراج وما يرتبط بها من البروتوكول. والتنقل الكهربي للبروتين معزولة لانه مطابق للعينات مراقبة. نستنتج مما تقدم أن عملية الاستخراج لا يغير من هيكل التساهمية من البروتين المعزولة. <img alt="رقم 1A" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> الشكل 1، لوحة ج: تصوير نموذجي حامض النووي إجراءات استخراج يتم خلط العينة مع ثيوسيانات جوانيداين 6M في أنبوب عينة ومرت أكثر من خمس مرات المواد الماصة. بعد مرور آخر، يضاف إلى عينة من البروتين العازلة الاستخراج. تغسل الأحماض والمواد الماصة متجهة النووي مرتين مع الايثانول. العينة ثم الهواء درييد ومزال من المواد الماصة. <img alt="الشكل 1B" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> الشكل 1، لوحة (ب): تصوير لإجراء استخراج بروتين نموذجي عينة مختلطة مع عازلة عزل بروتين من الخطوة 1، الشكل 1، لوحة يتم تمرير عبر المواد الماصة للماصة استخراج 2 15 مرة. ما تبقى من إجراءات لانه مطابق للبروتوكول استخراج حمض النووي. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> الشكل 2: صورة سلبية لبروميد إيثيديوم هلام الاغاروز الملون أجري المضاعفة الجينات توكسين 1 و 2 شيغا تجربة التضخيم باستخدام عينات من ثقافة (الممرات A و B) أو عينات من مياه الصرف الصحي الخام ارتفعت مع إ. O157 كولاي: H7 (الممرات D، E و F). واما العينات وأضاف مباشرة إلى أنبوب رد فعل PCR (الممرات A و D)، أو عينات تم معالجتها باستخدام بروسس العزلةتم إضافة الصورة والأحماض النووية لاستخراج أنبوب رد فعل PCR (عينات B، E و F). بروتوكول PCR هو تعديل واحد التي وصفها فنغ وآخرون 11. تعديل لدينا استهدفت فقط تلك تضخيم من قبل STX 1 (الشريط السفلي) وSTX 2 (الشريط العلوي) أزواج التمهيدي، والتسرب جميع أزواج التمهيدي الأخرى. ممر C هو سلم 1KB من BioRad. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> الشكل 3: نتائج التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية من E. O157 كولاي: H7 الأحماض النووية معزولة باستخدام ماصة استخراج ذكرت وصفت والأحماض النووية معزولة عزلة أ و ب العزلة. تم اختباره أيضا الطيف للأشعة فوق البنفسجية من العينة قبل استخراج الحمض النووي ويسمى ما قبل العزلة. وقد تم الحصول على الأطياف باستخدام U3010 هيتاشي الطيف وما يرتبط بها من حزمة البرامج. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; الشكل 4: صور لون من شرائط الاختبار RapidChek تم عزل محتوى البروتين من العينات المستخدمة في الشكل 2 باستخدام ماصة استخراج واختبار التفاعلات المناعية بواسطة فحص تدفق الوحشي. حارات AC هي الضوابط غير المجهزة، وهذا هو، وأضيف ثقافة الخلية إلى شريط الاختبار دون استخلاص الحامض النووي أو البروتين. (أ) هو ممر E. كولاي BL21 DE3 pLysS كعنصر تحكم سلبي، والممرات وباء وجيم هاء المعرض O157 كولاي: H7 التي كانت غير المعالجة (B)، أو تعامل مع C mitomycin لمدة 4 ساعات (C). من خلال مد خطوط H تظهر نتائج مضيفا ان البروتين المستخرج من شرائط اختبار تدفق الوحشي. تم بحث الممرات D و E باستخدام بروتين مستخلص من E. كولاي BL21 DE3 pLysS إما دون (D) أو مع العلاج C mitomycin (E) كما الضوابط السلبية. حارات FH إظهار النتائج عند استخراج البروتين من E. O157 القولونية: تم استخدام H7. تم استخراج بروتين من دون علاج (F)، أو في الفترة من 2 ساعة (G) أو 4 ساعة (H) Mitomycin الثقافات C المعالجة.نتائج إيجابية إنتاج خط مزدوج أحمر. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> تم عزل صورة لالملون Coomassie SDS-PAGE جيش صرب البوسنة من حل باستخدام ماصة استخراج والبروتوكولات وصف: الرقم 5. حارات A و C هي الممرات السيطرة على 250 ميكروغرام / مل و 500 ميكروغرام / مل على التوالي. حارات B و D تصور BSA تعافى من الحلول التي تحتوي على تركيزات نفس الضوابط الخاصة بكل منها.

Watch this Scientific Journal Video about Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation at JoVE.com

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

ويرد وصف أداة وكيمياء لعزل بالتسلسل الأحماض النووية تليها البروتينات من عينة من دون الحاجة للحصول على الكهرباء. أداة تتكون من المواد الماصة التي عقدت ضمن ماصة نقل في حين تستند على مبادئ كيمياء العزلة استخراج الصلبة المرحلة. يمكن تحليل الجزيئات المعزولة بواسطة المقايسات المناعية القاعدة والقائم على PCR.

كهرباء خالية من الحمض النووي متسلسل وعزل بروتين

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  CUBRC, Inc.. ويرد وصف أداة وكيمياء لعزل بالتسلسل الأحماض النووية تليها البروتينات من عينة من دون الحاجة للحصول على الكهرباء. أداة تتكون من المواد الماصة التي عقدت ضمن ماصة نقل في حين تستند على مبادئ كيمياء العزلة استخراج الصلبة المرحلة. يمكن تحليل الجزيئات المعزولة بواسطة ?...

Video: Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

تحليل وبناء هياكل الحمض النووي مع 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

وصفها تسلسل معين من الأحماض النووية والبروتينات مع ميثيل والعامل المساعد النظائر

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

كفاءة نوكليك حمض استخراج و16S الريباسي جين تسلسل للبكتيريا الجماعة توصيف

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...