Biz minnetle DARPA sponsorluğunda Mikro / Nano Fluidics Temelleri Focus (MF3) sözleşme numarası N66001-10-1-4003, altında Merkezi&#39;nden ve DARPA hibe N660001-09-C-2082 fon kabul ediyorsunuz.

1. ITP Fizik ITP gibi ücretten iyonlar arasında keskin bir hareketli sınır oluşturur. Teknik anyonik veya katyonik örnekleri ile yapılan, ama biz terzi bu anyonik ITP giriş ve not aynı ilkeler katyonik ITP için geçerli olabilir. Biz LE iyonları yüksek büyüklüğü etkili elektroforetik hareketlilik var böyle LE ve TE tampon seçin. Etkili elektroforetik mobilite, μ = U / E, uygulamalı elektrik alanı, E ve iyon sürüklenme hızı, U arasında sürekli orantı. 13. Biz LE ve TE arasında yaygın arabirim kurmak ve gelen yüksek yönettiği bir elektrik alanı uygulamak Düşük iletkenlik TE dilimine iletkenlik LE bölgesi. Sistem hızlı bir şekilde düzgün olmayan iletkenliği tercihe bağlı ITP arayüzeyde elektrik alanı kuvvetli bir gradyan, kurar. Adından başı olarak aynı, tek tip ve at, TE ve LE iyonları seyahat (Yunancadan, &quot;isos&quot; &quot;takhos&quot; &quot;hızlı&quot; anlamına gelen, &quot;eşit&quot; anlamına gelir)locity, düzgün olmayan elektrik alanı ve akım korunması bir sonucu olarak (bu sözde &quot;ITP durumu&quot; dir, bakınız Şekil 1). ITP arayüzü kendini bilemektedir: TE bölgesi deneyimi içine güçlü bir geri akı, yaygınlaştırılması ve önde gelen bölge (ve LE bölgesinde TE iyonları için tam tersi) dönmelerini LE iyonları. Örnek iyonlar TE bölgesinde, kendi etkin hareketlilik TE co-iyonları daha büyükse bu arayüzden odaklanmak ve LE bölgesinde, kendi etkin hareketlilik LE co-iyonları (bkz. Şekil 1) daha az ise. Bu tekniğin sağlamlık katkıda bulunmak ve arayüz (örneğin bu kasılmalar, açılımlar ve dönüşler gibi basınç tahrikli akış veya geometri değişimleri nedeniyle) bozulmasi ITP nispeten duyarsız hale kendiliğinden bilenen ve ITP özellikleri duruluyor. Pik modu ITP (Şekil 2a ve Videolar 1-2 bakın), örnek iyon konsantrasyonlarıher zaman LE ve TE iyon yoğunluğunun anlamlı olarak daha düşük ve bu nedenle yerel iletkenlik denecek katkıda bulunur. Örnek iyonların dağılımı komşu bölgeleri arasındaki kendiliğinden bilenen arayüzü (burada TE ve LE) ve bu bölgelerin göreli örnek etkili hareketlilik değeri tarafından belirlenir. Büyük ölçüde olarak 14 Çoklu numune iyonları aynı dar ITP arayüzü bölge içinde ele zirveleri örtüşen. Arabirim ve zirve genişlikleri gibi ilişkili deriştirme faktörü, uygulanan akım ile ters skala (Şekil 2b&#39;de deneyler bakınız). 14 Yeterince yüksek ilk numune konsantrasyonu ve yeterli birikimi bir süre için, örnek iyonları bir eşik konsantrasyon değerine ulaşır. Tam-iyonize türler için, bu değer Kohlrausch regüle fonksiyonu (KRF) ile tespit edilir. Zayıf bir elektrolit için 15, bu Alberty ve Jovin fonksiyonlar ile belirlenir. Platoda 16,17modu, Şekil 3 ve örnek ionlar etkili hareketliliği tarafından belirlenen bir düzen içinde yerel olarak tekdüze ve sürekli konsantrasyon bölgeleri ayırmak ve saflaştırmak Video 3, tasvir. Çok seyreltik iyonları hala yayla bölgeleri arasında pik modunda odak noktası olabilir. İTP, örnek iyonlar TE ve LE (bkz. Şekil 3) arasında sonlu bir enjeksiyon getirilemeyecektir veya dönüşümlü TE ve / veya LE (bkz. Şekil 2) ile birlikte karıştırılır. Biz sürekli analit iyonları birikir için kullanılabilir &quot;yarı-sonsuz&quot; enjeksiyonu gibi TE bölgesinde karıştırma bakın. Sürekli örnek birikimi pik ve plato modunda deneyleri hem hassasiyetini artırır. Ancak, sonlu enjeksiyonları plato modunda daha sık görülür. Yarı-sonsuz enjeksiyon yüksek başlangıç ​​analit konsantrasyonlarının önemli ölçüde TE iletkenliği ve düşük odaklanarak oranlarını artırabilir, çünkü bu muhtemeldir. Ayrıca, tam arınma (orada Rema beri yarı-sonsuz enjeksiyonu mümkün değildirTE ins sonlu bir konsantrasyon). 2. Cihaz temizleme ve hazırlama Bu protokol sunulan testlerde bir çapraz-kanal tasarımı (bkz. Şekil 1) ile izotropik (kabaca D-şekilli bir kesite) ıslak-kazınmış cam mikroakışkan çipleri kullanır. Aşağıdaki temizleme ve hazırlama protokolü borosilikat ve erimiş silis kanallar için optimize edilir, fakat, aynı zamanda cam / PDMS yongaları ile birlikte kullanılabilir. Run-to-çalıştırmak tekrarlanabilirlik ve elektroozmotik akış (EOF) bastırmak için gerekli dinamik kaplama başarılı bir uygulama sağlamak için önce deneyler için bu temizleme işlemi gerçekleştirin. Bu protokolün ihmal ITP arayüz kuvvetli dispersiyon ile sonuçlanabilir. 14 <ol><li> Kanal dekontamine için,% 10 çamaşır suyu 10-20 uL ile Kuzey, Doğu, ve Güney rezervuarları doldurun ve 2 dakika süreyle Batı rezervuar, vakum uygulanır. Standart bir kaliper çip caddy kullanıyorsanız, vakum etkili basitçe attachin ile uygulanabilirg Geniş 200 ul sonu (filtresiz) çip rezervuara pipet ve 2 mm iç çapı tüpe vakum hattına bağlanıyor. </li><li> Rezervuar boşaltır ve 2 dakika süre ile 1 M sodyum hidroksit ile kanalın (olarak adım 1) durulanır. Bu nazikçe üniform yüzey özellikleri kurulmasına yardımcı olmak, temiz bir borosilikat yüzey veren, kanal duvarları etches. </li><li> Rezervuar boş ve de-iyonize su (DI) ile temiz, daha sonra ~ 2 dk LE ile kanal durulayın. Bu dönemde yüzey özellikleri ve dinamik kaplamalar kanal içindeki denge. </li></ol> 3. Fluorofor pik modunda ITP odaklanarak <ol><li> 100 mM HCI, 200 mM tris, ve% 1 PVP oluşan 1 mL LE hazırlayın. </li><li> 100 mM HEPES oluşan 1 ml TE ve 200 mM tris hazırlayın. 1 uM Alexa Fluor 488 (AF488) 10 ul ile TE 90 ul birleştirin. </li><li> LE ile iyice durulandıktan sonra boş olarak, Bölüm 2 Batı rezervuar açıklanan ve veya DI ile birkaç kez temizleyinder rezervuar içinde kalan LE sulandırmak için. 20 uL TE AF488 içeren bu doldurun. </li><li> Doğu rezervuar pozitif elektrot ve Batı rezervuar yere (negatif) elektrot yerleştirin ve 2 uA (sabit akım) uygulanır. Örnek tepe Batı rezervuardan Doğu rezervuar (bkz. Şekil 1) ve düşük iletkenlik TE kanal dolguları bu rezervuarlar arasındaki gerilimi artıracak bir sabit hızda göç olacaktır. </li></ol> 4. Kültürlü E. gelen Ekstraksiyon ve nükleik asitlerin saflaştırılması coli Seçici iyonik türler odaklanma yeteneği biyolojik numune hazırlama için ideal bir tekniktir ITP yapar. Etkili bir hareket büyüklüğü, hedef nükleik asit daha düşük fakat co-iyonik PCR inhibitörleri (örn. anyonik deterjan, proteinler ve organik çözücüler, olsa bile, yüksek mevcut daha yüksek olan bir eğik anyon seçerek arıtılmamış hücre lizatı gelen nükleik asit saflaştırılmasıGH konsantrasyon). Katyonik PCR inhibitörleri (örn. alkali metaller ve katyonik deterjanlar ve proteinler) ters yönde geçirmek ve bu nedenle de geride edilir. Yavaş PCR-inhibe türler arkasında (bkz. Şekil 4) bırakırken ITP, örnek rezervuardan hedef nükleik asitler ayıklar ve odaklanır. <ol><li> Bir örnek veya kültür E. edinin bir yoğunlukta 10 den daha büyük 8 CFU / ml &#39;ye coli hücreleri. </li><li> 6 dakika 4000g santrifüj ile güvenli bir kilit mikrosantrifüj tüpü ve pelet içine 1 ml hücre kültürü aktarın. </li><li> 80 uL RNase içermeyen su içinde tekrar askıya pelet, 10 mM trişin, 10 mM tris-bis, 2 mM EDTA,% 0.1 Triton X-ve 5 mg / mL lizozim parçalama ajanı içeren 10 ul ilave edin. İyice karıştırın ve 5 dakika inkübe edin. oda sıcaklığında (Bercovici ark uyarlanmıştır parçalama protokolü. 11). </li><li> ~ 12.5 lizat pH yükseltmek için 1 M sodyum hidroksit ile 10 uL ekleyin. Yavaşça pipet yukarı ve aşağı harekete kadarçözüm noktası parçalama tamamlandığında hangi, netleşiyor. </li><li> 50 mM trişin 90 uL ve 100 mM tris-bis ile lizatı 10 uL birleştirir. Bu çözüm, artık TE olarak kullanılabilir. </li><li> 500 mM tris-bis, 250 mM HCI,% 1 PVP ve 1X SYBR Green II oluşan LE 1 mL hazırlayın. Olarak 3. bölümünde tanımlanmıştır LE ile mikroakışkan çip doldurun. </li><li> ITP takiben off-çip analizi için saflaştırılmıştır nükleik asidi elde etmek için, 50 mM tris-bis, 25 mM HCI, ve% 0.1 PVP ihtiva eden bir PCR ile uyumlu LE East rezervuar içeriğinin yerini alır. Denemenize başlamaya Doğu ve Batı kuyular arasında 1000 V uygulayın. Bu rezervuarların arasındaki akım azalacaktır. </li><li> Deney sonunda örnek LE haznesine elutes. Bu elüsyon tesadüf, bu sistem için tercih edilen zaman genellikle bir plato değeri (direnç şimdi düzgün kanal içinde dağıtılan TE iyonlarının hakim olduğu bu yana) ulaşır. Yavaşça karıştırın rezervuariçindekiler pipetleme tekrarlanır ve nicel RT-PCR ile analiz için bir 5 uL hacmi özü. </li></ol> 5.. Görselleştirme için katyonik plato modu ITP ve non-odaklama tracer (NFT) ile amino asitlerin ayrılması ITP TE ve LE arasındaki bitişik ve saptanabilir yaylaları içine küçük iyonları ayırmak ve odaklanmak için kullanılabilir. Bu tür yerel iletkenlik, UV absorbans, sıcaklık algılama, ya da kırılma indeksi gibi fizikokimyasal özellikleri, dayalı algılama ve tanımlama sağlar. Burada bir floresan, co-iyonik türler LE eklenir olmayan bir odak izleyici (NFT) assay göstermektedir. Bu floresan türleri ele vermez, ama onun konsantrasyonu yerel bir elektrik alanı adapte olur ve böylece (bkz. Şekil 5) saflaştırılmış plato bölgeleri görselleştirme sağlar. <ol><li> 100 mM etanolamin oluşan 1 mL LE, 200 mM trişin, ve% 1 PVP ve katyonik fluorofor rodamin 6G 100 uM hazırlayın. </li> &lt;li&gt; Hazırlama 1 ml TE 20 mM tris, 40 mM trişin oluşan. 10 uL 50 mM arginin her biri ve lisin 50 mM TE 90 uL karıştırılarak numunesinin hazırlanması. </li><li> 20 uL Batı&#39;da LE ve Doğu rezervuar Kuzey rezervuar ve örnek dağıtın. 1 dakika Güney rezervuar az vakum uygulayın. </li><li> DI ile iyice durulayın Doğu ve TE (örnek olmadan TE) ile değiştirin. </li><li> Doğu ve Batı rezervuarlar arasında 500 V uygulayın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bu Şekil 4, Şekil 2b ve nükleik asit ekstraksiyon deneyler içinde tepe modu deneyler isotachopherograms göstermektedir. Bir flüoresan raportör (örneğin AF488, SYBR Green II) ile pik modunda deneylerde, genel floresan nicel konsantrasyonu bilgileri almak için bir kalibrasyon eğrisi karşı entegre ve mukayese edilebilir. Ayrıca 12, nükleik asit ekstraksiyon deneyleri, örnek Zehir izin verilir t içineO LE rezervuar ve nicel RT-PCR. 10,12 ile analiz için bir pipet ile ekstre We Şekil 5 amino asit ayrılması için plato modu isotachopherograms göstermektedir. Bölgesi genişlikleri kantitatif sağlarken floresans yoğunluğunu (LE ya TE bölgesi yoğunluğu oranla), bölgesi belirlenmesi için de kullanılabilir. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Şekil 1. Isotachophoresis (ITP) iyonları hassas algılama ve ayrılması için mikroakışkan uygulamalarda kullanılan bir elektrokinetik tekniktir. ITP ayırma, seçici odaklama ve önderiştirme yetenekleri sunuyor. Buna ek olarak, son derece sağlam ve nedeniyle kendiliğinden bilenen doğanın fiziksel bozuklukları duyarsız. Örnek iyonları seçici LE bölgesi öncü iyonlarının hızı ile belirlenir sabit bir hızda mikrokanal yoluyla bir öncü (LE) ve sürükleme elektrolit (TE) ve seyahat arasındaki odaklanacaktır. Örnek iyonlarıbunların etkin elektroforetik mobilite LE ve TE iyonların etkili hareketliliğin parantez ise odak. Şematik örnek LE ve TE bölgeler arasında sürekli odaklanan bir model ITP deneyi anlatıyor. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Şekil 2. &quot;Zirve modu&quot; ITP örnek iyonlar odak sulandırınız. a) İki ayrı seyreltilmiş (c örnek &lt;&lt; c LE) ve TE LE bölgeler arasında oluşan arayüz pik modunda tür odak. Örnek türlerin önemli güncel katkıda yok gibi sadece LE ve TE, elektrik alanı belirler. Örnek iyonlar TE (yarı-sonsuz enjeksiyon) ile karıştırılır ve ITP arayüzüne bir kabaca Gauss pik birlikte odaklanır. Odaklama kriter (eşitsizlikler olarak gösterilir) kuvvetli iyonize türler için de geçerlidir. b) Alexa Fluor 488 (AF488) gösteren deneyler (ayrıca bakınız V uygulamalı akımların bir dizi için pik modunda odaklıideo 1). Örnek tepe genişliği (elektroozmotik akışı nedeniyle ihmal moleküler hızın etkin dağılımı için) akımı ile ters orantılıdır. 14 kendiliğinden bilenen arayüz basınç tahrikli akış (Video 2) nedeniyle dağılım dayanıklıdır. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Şekil 3. Örnek &quot;plato&quot; modunda yeterince yüksek konsantrasyonda odağında iyonları ve yerel iletkenlik düzenler. Biz genellikle TE ve LE arasında sonlu bir enjeksiyon örnek iyonlar tanıtmak. Bu yöntem, bunların etkili elektroforetik mobilite (Video 3) göre numune iyonları ayrı ve sipariş. Kuvvetle iyonize türler için, TE ve yayla bölgesi konsantrasyonları Kohlrausch düzenleyici fonksiyonu (KRF, LE bölgesi tarafından başlangıçta değişmeyen set) tarafından belirlenir. Seyreltik iyonları plato bölgeleri braketi onların etkin hareketlilik arasında pik modunda odaklanmaya devam ediyoruz. C Odaklamariterion (eşitsizlikler olarak gösterilir) kuvvetli iyonize türler için de geçerlidir. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Şekil 4. Pik modu ITP ile hazırlanması ve nükleik asit ekstraksiyon Lizat. Nükleik asit E. çıkarılır lizozim destekli alkali parçalama kullanarak ve ITP ile odaklanarak seçici elektroforetik arıtıldı coli hücre kültürü. Lizat ile karışık TE (kahverengi) hedef nükleik asit (yeşil), proteinler, ve potansiyel PCR-inhibe kimyaları içerir. Iyonları takip ve önde gelen Uygun seçimi geride PCR inhibitörlerinin bırakarak hedef nükleik asit odaklanarak seçici sağlar. Ek modül, burada gösterildiği gibi toplam nükleik asit ITP pik genellikle, İdeal olmayan bir şekil alır. Bu deneyde bir göstergesi olarak, gram-negatif bakterilere toplam nükleik asit ayıklanır, ITP kullanılarak E. coli (tek başına sodyum hidroksit çözeltisi ile lizlendi), lizat arındırılan NA, toplanangenetik materyal, ayıklanır ve 16S rRNA (kırmızı) ve bakteriyel kültürden 16S rDNA (yeşil) saflandırılmasında doğrulamak için QRT-PCR analizleri uygulandı. 16S rRNA (mavi) ve 16S rDNA (sarı) Negatif kontrol eşiği döngüleri her Yukarıda 30 devir idi. Biz Güç SYBR Green RNA-C T tavsiye edilen ısıl şartlarda 150 ileri nM (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) ve ters (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primerleri ile Uygulamalı Biosystems&#39;ten 1-Adım Kit kullanarak QRT-PCR yapıldı. <img alt="Şekil 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Şekil 5. Sigara odaklanan etiketsiz amino asitlerin ayrılması ve algılama için izleyici (NFT) testi. NFT assay of a) şematik. Örnek iyonları bir sonlu enjeksiyonu Doğu kanal içine tanıtıldı. Biz TE iyonları (μ izleyici &lt;μ TE) daha etkili mobilite düşük bir izleyici katyonik fluorofor ile LE karıştırın. Fluoroforbir &quot;underspeeding izleyici&quot; olarak hareket söyleniyor. Fluorofor şimdi örnek yayla ve TE tarafından işgal bölgeleri içine LE gelen electromigrates olarak, daha yüksek bir elektrik alan ve böylece konsantrasyonu artar yaşar. Konsantrasyonda Bu değişiklik isotachopherogram basamakları oluşturur. b) iki amino asitleri, arginin ve lizin, ayrılması underspeeding floresan İzleyici olarak rodamin 6G ile NFT testi kullanılarak. TE ve arginin arasında hafif bir tepe, İTP yaygın olan iyi anlaşılmış değildir, ve burada yaylaları tespit veya miktarının engel değildir. Ek Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">tamamlayıcı filmi görmek için buraya tıklayın</a> . Ek Film 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">ek filmi görmek için buraya tıklayın</a> . Ek Movie 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">tamamlayıcı filmi görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis.">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li><li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis.">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li><li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotachophoresis:+Theory,+instrumentation,+and+applications.">Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications.</a> Elsevier Science &#38; Technology. , (1976).</li><li>Khurana, T. K., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration,+separation,+and+indirect+detection+of+nonfluorescent+analytes+using+fluorescent+mobility+markers.">Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers.</a> Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carrier+ampholytes+assay+for+portable,+label-free+detection+of+chemical+toxins+in+tap+water.">Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water.</a> Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+analyte+identification+using+isotachophoresis+and+a+fluorescent+carrier+ampholyte+assay.">Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay.</a> Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).</li><li>Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+system+for+isotachophoresis+assays.">Miniaturized system for isotachophoresis assays.</a> Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).</li><li>Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+quantification+of+isotachophoresis+zones+using+nonfocusing+fluorescent+tracers.">Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers.</a> Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).</li><li>Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+extraction,+isolation,+preconcentration,+and+quantitation+of+small+RNAs+from+cell+lysate+using+on-chip+isotachophoresis.">Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis.</a> Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).</li><li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis.">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li><li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons.">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li><li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis.">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li><li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I:+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers.">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li><li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+dispersion+in+isotachophoresis.">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li><li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l&#214;sungen+und+l&#214;sungsgemischen.">&#220;ber concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von l&#214;sungen und l&#214;sungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li><li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases.">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li><li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations.">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li><li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons.">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

ITP yöntemleri burada iyonik moleküllerin hızlı, hassas ve sağlam algılama ve işleme olanak sundu. İTP kullanarak temel zorluk LE ve TE tamponlar uygun seçimdir. Bu, çok yüksek mutlak hareket yeteneğine sahip güçlü bir asittir ve böylece çok öngörülebilir özelliklere sahip olduğundan anyonik ITP olarak, tipik olarak gelen anyon olarak klorid tercih. Bu nedenle, anyonik ITP&#39;de tampon seçimi, genellikle uygun bir TE ve kontriyon tercih indirgenir. Seçici odaklanma deneyler için, TE seçim iyonları kirletici dışlanması için çok önemlidir. Kirletici maddeler mevcut olmayan uygulamalar olarak, düşük bir TE etkili hareketliliği odaklama hızlı bir oranda yol açar. MES, MOPS, HEPES, trişin: Biz nispeten anyonik TE iyonları uslu, aşağıdaki kullanmanızı öneririz. Kontriyon Seçimi sistemi pH ve TE etkili bir hareketlilik hem de etkiler. Yaygın counterions tris (pKa 8.1) ve bis-tris (pKa 6.4) vardır. Düşük veya yüksek pH gerektiren testler için, piridin tavsiye (pKa 5.25) vesırasıyla, etanolamin (pKa 9.5),. Tablolar 1 ve 2&#39;de, anyonik, katyonik ITP için, sırası ile, bir çok faydalı tampon örnekleri özetler. Bu katyonik LE iyonu olarak anyonik LE iyonu ve sodyum gibi HCl alır, ve bu LE tamponun 100 mM iyonik kuvvet varsayılmaktadır. Okuyucunun protokolleri bu tampon iyonik gücün not edin (Tablolar 1-2 ve in) her zaman büyük veya 10 mM eşit olacaktır. Teoride ITP fizik 10 mM daha düşük iyonik gücü de geçerlidir, 1 mM düzeyine yakın doğal kirleticiler (su ve atmosferdeki karbondioksit arasındaki reaksiyonun örneğin karbonik asit) genellikle düşük iyonik güçlü tamponlar pratik kullanımını sınırlandırmaktadır. Bu sinyal iletimi mekanizmasının Bu protokolde sunulan deneyleri ile sınırlı değildir, dikkat ediniz. Bölgeleri saflaştırılmış plato modunda Bölüm 5, kısaca değinildiği gibi yerel iletkenliği değişiklikler, UV absor yoluyla tespit edilebilirkırılma ağır bozukluklar, sıcaklık veya dizin. Kendi grubunda, biz bilinmeyen analitlerin hassas algılama ve tanımlama için floresan taşıyıcı ampholytes kullanan bir yöntem geliştirdik. Pik modunda deneylerde 5, spesifik problar odaklı analitler etiketlemek için kullanılabilir. Yüksek özgüllük ile hedef DNA veya RNA molekülleri tespit 11,18 - kendi hedef diziyle hibridizasyon üzerine floresan oligonükleotid problar - Bir örnek olarak, moleküler işaretleri kullanabilir. ITP basınç tahrikli akışı ve EOF kaynaklanan dispersiyon için göreceli olarak sağlamdır iken, aşırı EOF ortalama EOF hızı ITP hızına eşit olur ITP arayüz, durgunluk yol açabilir. 14 gibi güçlü bir EOF özellikle yüksek pH şartlarında meydana ve düşük iyonik gücü. Bu nedenle, 100 mM amacıyla uygun olursa üzerindeki pH 8 veya daha düşük olan ve iyonik gücü olan tamponlar kullanılması tavsiye edilir. Deneyimlerimize göre, PVP olduğunuborosilikat fiş EOF bastırılması için en etkili kaplama. Ancak, bu eleme özellikleri, örneğin PVP genomik DNA odaklama gibi bazı uygulamalar için uygun olmayabilir. Deneylerde, PVP eklenmesinin büyük ölçüde (bunu ele vermez noktaya) genomik DNA mutlak hareketlilik azaltabilir dikkat. Bu durumda böyle bir yüzey (örneğin Triton-X 100) ile conjuction Sigmacote olarak silanolle kaplama da EOF azaltmada etkili olabilir. 10 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE anyon (pKa -1) </td></tr><tr><td> Tamponlama karşı iyon (pKa 1) </td><td> MES (6.10) </td><td> MOPS (7.20) </td><td> HEPES (7.50) </td><td> trişin (8.15) </td></tr><tr><td> etanolamin (9.50) </td><td> 21.41 </td><td> 20.40 </td><td> 17.38 </td><td> 22.85 </td></tr><tr><td> tris (8.08) </td><td> 21.00 </td><td> 19.23 &lt;/ Td&gt; <td> 15.84 </td><td> 17.56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6,40) </td><td> 18.22 </td><td> 10.41 </td><td> 7.30 </td><td> 5.23 </td></tr><tr><td> piridin (5.18) </td><td> 1.01 </td><td> 3.72 </td><td> 2.42 </td><td> 1.48 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. LE 100 mM HCl ve 200 mM tamponlama karşı iyon anyonik İTP arındırılmış saf analit bölgesi Etkin hareketlilik büyüklüğü (× 10 -9 m 2 / V / s). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE katyonu (pKa 1) </td></tr><tr><td> Tamponlama karşı iyon (pKa -1) </td><td> etanolamin (9.50) </td><td> tris (8.08) </td><td> bis-tris (6,40) </td><td> piridin (5.18) </td></tr><tr><td> MES (6.10) </td><td> 35.57 </td><td> 21.96 </td><td> 16.39 </td><td> 10.45 </td></tr><tr><td> MOPS (7.20) </td><td> 35.47 </td><td> 20.92 </td><td> 9.76 </td><td> 3.93 </td></tr><tr><td> HEPES (7.50) </td><td> 35.35 </td><td> 19.97 </td><td> 7.77 </td><td> 2.88 </td></tr><tr><td> Trişin (8.15) </td><td> 34.77 </td><td> 16.72 </td><td> 4.50 </td><td> 1.44 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Katyonik İTP düzeltilmiş saf analit bölgenin Etkili hareketlilik büyüklüğü (× 10 -9 m 2 / V / s) LE 100 mM sodyum ve 200 mM tampon karşı iyon.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REAKTİFLER </td></tr><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Damıtılmış su </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNaz / DNaz ücretsiz </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> sodyum hidroksit (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> hidroklorik asit (HCI) </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma tabanı (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polivinilpirolidon (PVP) </td><td> Polysciences A.Ş. </td><td> 06067 </td><td> MW 1.000.000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 karboksilik asit </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> trişin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lizozim </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> etanolamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamin 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Belçika) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-Amino Asitleri </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> Güç SYBR Green RNA-C T 1-Adım Seti </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; PCR primerleri </td><td> Entegre DNA Teknolojileri </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> EKİPMAN </td></tr><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Borosilikat mikroakışkan çip </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri A.Ş. </td><td> NS12A </td><td> Plastik caddy ile veya olmadan teslim </td></tr><tr><td> Vakum pompası </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> Sourcemeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Sabit akım ve sabit voltaj çalışma modları </td></tr><tr><td> Ters epifluorescent mikroskop </td><td> Olympus </td><td> IX70 </td><td> Aydınlatma için civa lambası (Olympus) veya LED (Thorlabs) kullanın </td></tr><tr><td> Filtre küp </td><td> Omega </td><td> XF115-2 </td><td> Tahrik / emisyonu: yeşil / mavi </td></tr><tr><td> GüvenliMikrosantrifüj tüpleri-kilitlemek </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1.5 ml kapasiteli </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3. Özel reaktifleri ve ekipmanları.

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

Elektrokinetik teknikleri, çünkü hiçbir hareketli parça ile basit, kompakt sistemlerde akışkan ve elektroforetik süreçlerinin çeşitli gerçekleştirmek için kendi benzersiz yeteneği mikro uygulamaların bir elyaf bulunmaktadır. Isotachophoresis (ITP) iyonik mobilite göre milyon kat önderiştirme 1,2 ve verimli ayırma ve çıkarma ulaşabiliriz basit ve çok sağlam elektrokinetik tekniktir. Örneğin, ayırma ve etiketsiz hassas tespiti için ITP uygulama göstermiştir 3 çok az veya hiç Numune hazırlama 4-8 ile ve hücre kültürü, idrar, kan gibi karmaşık bir matris gelen nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için iyonik molekülleri (örn. toksinler, DNA, rRNA, miRNA). 9-12 ITP odaklanma ve akıcı bir kanal sistemi içinde uygulanan bir elektrik alanı ve iki Tampon kullanan ayrılması başarır. Anyonik analitler için, önde gelen elektrolit (LE) tampon s seçilironun anyonlar sondaki elektrolit (TE) tamponu (Etkili hareketliliği bir iyon gözlemlenebilir sürüklenme hızı olarak açıklanmaktadır ve Persat ve arkadaşları tarafından detaylı olarak tarif dikkate iyon iyonizasyon durumuna alır ve anyon daha yüksek etkili elektroforetik hareketlilik olduğu uch . 13). TE ve LE arasında bir arayüz kurduktan sonra, bir elektrik alanı LE iyonlar TE iyonları tarafından işgal edilmiş bölgeden uzaklaşmaya böyle uygulanır. Öncesinde TE iyonlarının ama ara etkili hareketlilik yarış Örnek iyonları LE iyonları sollamak edemez ve böylece LE-TE arayüzü (bundan sonra &quot;ITP arayüzü&quot; olarak adlandırılır) de odaklanmak. Ayrıca, TE ve ITP arayüzüne dik bir elektrik alanı degrade kurmak sırasıyla düşük ve yüksek iletkenlik, LE form bölgeleri. Onlar odak olarak bu alanda degrade örnek türler preconcentrates. Uygun olmayan diğer odaklı türlerden odaklanan ve hedef türlerin arıtma TE ve LE sonuçları seçimi ve en sonunda bir ayrılıkörnek türlerin d ayrımı. Biz burada fiziksel ilkeleri esas ITP gözden geçirmek ve iki çalışma standart modlar tartışmak: &quot;zirve&quot; ve &quot;yayla&quot; modları. Pik modunda, nispeten örnek iyonlar ITP arayüzü dar doruklarına örtüşen içinde birlikte ele sulandırın. Plato modunda, daha bol örnek iyonları bir kararlı durum konsantrasyonuna ulaşmak ve onların etkin hareketlilik tarafından sipariş komşu plato gibi bölgeleri içine ayırınız. Tepe ve yayla modları aynı temel fizik doğan, ancak ilk analit konsantrasyonu ve / veya örnek birikimi için ayrılan süreyi göre farklı farklı rejimleri temsil eder. Biz ilk ayrıntılı bir model pik modunda deneyde tanımlamak ve sonra E. nükleik asitlerin ekstraksiyonu için bir zirve modu tahlil göstermek coli hücre kültürü. Biz ayrımı görselleştirmek için olmayan bir odak tracer (NFT) türleri kullandığınız yere, bir plato modu test sunarak başına ve sonuçlandırmakAmino asitlerin kantitatif oluştururlar.

Watch this Scientific Journal Video about On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids at JoVE.com

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Isotachophoresis (ITP) toksini tanıma ve numune hazırlama kadar uygulamaları ile sağlam bir elektrokinetik ayırma ve zenginleştirme tekniktir. Ayırma ve küçük moleküller ve hücre kültürü lizatı nükleik asitlerin saflaştırılması tespiti: Biz ITP fiziksel prensipleri ve iki özel örnek uygulamalar için bu tekniği uygulayarak metodolojisi gözden geçirin.

İyonların ayrılması ve Nükleik Asit Saflaştırılması için on-chip Isotachophoresis

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

on-chip-isotachophoresis-for-separation-ions-purification-nucleic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Current and Resistance

SCIENTISTS IN ACTION

24.4K Görüntüleme.  Stanford University. Isotachophoresis (ITP) toksini tanıma ve numune hazırlama kadar uygulamaları ile sağlam bir elektrokinetik ayırma ve zenginleştirme tekniktir. Ayırma ve küçük moleküller ve hücre kültürü lizatı nükleik asitlerin saflaştırılması tespiti: Biz ITP fiziksel prensipleri ve iki özel örnek uygulamalar için bu tekniği uygulayarak metodolojisi gözden geçirin.

Video: On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Biyomühendislik

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Çok açılı Aydınlatma ve Pixel Super çözünürlüklü istihdam Lensfree On-chip Tomografik Mikroskopi

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Su Arıtma Membranlar olarak Zehirli Özelliklere Sahip Hidrojeller Sentezi

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Kuru zar elektrokimyasal mikrosıvısal Biyoalgılayıcı fotorezist tabanlı Platform: Cihaz imalat, On-chip tahlil hazırlama ve sistemin çalışması

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...