وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث ضمن الجدران في المعاهد الوطنية للصحة، NINDS. فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء مختبر الطب الجزيئي وعلم الأعصاب، ريك درايفوس لمساعدة مع المجهري وباميلا النخل C. لمساعدة مع التحرير.

ملاحظة: للحصول على زراعة الروتيني للسلف العصبية والخلايا النسب oligodendrocytic، ويتم حضانة في 37 ° C في مرطب الجو 2 5٪ CO. كل يوم 2، يتم استبدال المتوسطة باستخدام 50 إلى 100٪ من متوسط ​​جديدة اذا الثقافة هي متموجة 40-70٪. في وقت confluency القريب، وpassaged الثقافات في قارورة 2-2.5e6/T75 عادة على الجدول الأسبوعي. 1. إعداد قارورة المغلفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد قوارير المغلفة تمييع 5 ملغ من بولي-D-يسين (PDL) في 100 مل من الماء منزوع الأيونات (DI-الماء)، ثم معطف T75 القوارير مع 50 ميكروغرام / مل من PDL في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام. بعد ساعة ½ 1، نضح في PDL وشطف القوارير مرة واحدة مع DI-الماء. السماح للقوارير جافة قبل البذر الخلايا (الجدول 1). </li></ol> 2. بدء تمايز الخلايا العصبية في السلف السلف oligodendrocytes قد المشتقة (PDO) بروتوكول لهوolate الإنسان الخلايا الاصلية CNS الموضح في نشرة سابقة وأنها ليست جزءا من هذا البروتوكول 1. تم عزل الخلايا الاولية CNS الإنسان من الدماغ الانتهائي من الدماغ الحمل لمدة 8 أسابيع الجنين، تم الحصول عليها في المعاهد الوطنية للصحة فقا للمبادئ التوجيهية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينمو السكان multipotential من الخلايا الاصلية العصبية على قوارير مغلفة في PDL المتوسطة neurobasal تستكمل مع 25 نانوغرام / مل من bFGF و 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) (الشكل 1A). لا تستخدم إذا كان لهم أعلى من مرور 11 (P11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ في التفريق بين الخلايا العصبية عند السلف ثقافة ما يقرب من 70٪ متموجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل كاملة التمايز المتوسطة باستخدام المصل دبقية قليلة التغصن خالية DMEM / HAMS المتوسطة 1:01 F12 تستكمل مع مصل الألبومين البقري، الجلوتامين L-، جنتاميسين، مكونات N2، T3، SHH، NT-3، bFGF، وPDGF-AA (الجدول 1) . وسيتم تحديد هذه الوسيلة كوسط بنسبة ضئيلة مع عوامل النمو (بنسبة ضئيلة المتوسطة + GF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PROGENوسائل الإعلام itor من قوارير، وشطف الخلايا مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ثم يضاف بنسبة ضئيلة المتوسطة + GF (التفاصيل الواردة في 2.3) لبدء التمايز دبقية قليلة التغصن. والخلايا فقط ملتزمة نسب النمو oligodendrocytic (1B الشكل). ثقافة الخلايا في هذه الوسيلة لمدة 3 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل أسبوع، عندما الخلايا في مرور 90-95٪، التقاء لهم باستخدام التربسين (0.05٪)-EDTA (0.1٪) (4 مل لقارورة T75). نقل متوسطة بالكامل من الخلايا المراد passaged في أنبوب 50 مل المخروطية، وسيتم استخدام هذه الوسيلة مكيفة لارواء التربسين. تأكد من عدم تجفيف الخلايا. ثم يضاف التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في التربسين لمدة 5 دقائق في RT، والتنصت بلطف القارورة عدة مرات للمساعدة في مفرزة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخماد التربسين بإضافة مل 4-5 من متوسطة إلى تكييف القارورة مع خلايا منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل متوسطة وخلايا في أنبوب 50 مل المخروطية نفسها. أجهزة الطرد المركزي على المديين المتوسط ​​وخلايا في 1200 دورة في الدقيقة (~300 XG) لمدة 5 دقائق في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف، وإعادة تعليق بيليه الخلية، بلطف ترجيح الأنبوب، ثم قم بإضافة جديدة بنسبة ضئيلة المتوسطة + GF. بلطف ماصة المتوسطة وخلايا صعودا ونزولا لجعل التعليق خلية موحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا، ونقل 2.5e6 في كل قارورة T75 الجديدة PDL المغلفة. </li></ol> 3. الخطوة النهائية في التفريق بين oligodendrocytes قد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 أسابيع من الثقافة في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة + GF، عندما الخلايا في التقاء 70-80٪، وبدء عملية التمايز النهائي (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة بنفس الطريقة باعتبارها وسيلة بنسبة ضئيلة + GF ولكن دون إضافة GF الأربعة: SHH، NT-3، وbFGF PDGF AA-. وسيتم تحديد هذه الوسيلة دون GF الأربعة المتوسطة بنسبة ضئيلة - GF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة بنسبة ضئيلة + GF من القارورة، وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ثم قم بإضافة وحدة تخزين ما مجموعه 16 مل من المتوسط، والتي ¾ (12 مل) بنسبة ضئيلة هي المتوسطة - GF و¼ (4 مل) هو PDN المتوسطة مكيفة، ل 6-10 يوما). استخدام تكييف الهواء والمتوسطة من PDN ليست حرجة لعملية التمايز أو لبقاء الخلايا. ونحن في الحقيقة لاحظت أن الاتصال المباشر الوحيد من شركة تنمية نفط عمان مع خلايا PDN في المشاركة في التجارب ثقافة كان لها تأثير على طول بقاء شركة تنمية نفط عمان. ويمكن تمديد GF إلى أسبوعين أو ثلاثة أسابيع إذا هي الخلايا شركة تنمية نفط عمان شارك في تربيتها مع خلايا PDN - الوقت البقاء على قيد الحياة في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة. يوصف بروتوكول للتمييز خلايا العصبية في PDN السلف في منشور السابقة وأنها ليست جزءا من هذا البروتوكول 1. انسحاب النمو عامل من نتائج ثقافة المتوسط ​​في الثقافة متباينة من الخلايا تدريجيا مع عمليات متعددة (1D الشكل). </li></ol> 4. تدفق الخلوي الفحص الفحص التدفق الخلوي يقارن اقتناء علامات دبقية قليلة التغصن أثناء عملية التمايز في العلاقة مع تلك من سكانها الوالدين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برو العصبيةgenitors والسيطرة. شركة تنمية نفط عمان في خلايا البذور 2.5x10 6 خلايا في اثنين من قوارير T75 المغلفة مع البولي يسين GF-D في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد أسبوع، مع استبدال المتوسطة المتوسطة بنسبة ضئيلة الطازجة + GF في قوارير وثقافة الرقابة لبقاء الخلية، في حين كان بنسبة ضئيلة قوارير أخرى متوسطة - GF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفصل الخلايا في كل من شركة تنمية نفط عمان وسائل الإعلام استخدام 20 U / مل من التربسين وغراء لا. وذلك لأن لديها غراء ألطف تأثير على الخلايا خلال التفكك الحفاظ على التشكل الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من محلول الملح المتوازن للايرل (EBSS) إلى قارورة غراء. ضع قارورة في C ° 37 لمدة 10 دقيقة أو حتى يذوب تماما غراء والحل يبدو واضحا. هذا هو الحل غراء يستخدم لفصل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من EBSS إلى قارورة ديوكسي ريبونيوكلياز (الدناز) I (الجدول 1). المزيج بلطف. إضافة 0.25 مل من هذا المحلول إلى قارورة من غراء المنحل. هذا المستحضر يحتوي على تركيز النهائي من غراء حوالي U / 20 مل و 00.005٪ الدناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان غراء الحل (كما هو موضح أعلاه) على الخلايا واحتضان في C ° 37 ل15-30 دقيقة؛ رصد مفرزة من الخلايا باستخدام المجهر. وقف رد الفعل مع 5 مل من المتوسط ​​مع أو بدون GF وأجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الكريات خلية من كل من القوارير إلى قسمين أنابيب البولي بروبلين مختلفة 5 مل وغسلها مع المتوسطة الفسيولوجية الطبيعية (NPM: 145 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1.8 ملي CaCl 2، ملي Hepes 10 و 10 ملي الجلوكوز) تستكمل مع 1 ملغ / مل الأبقار مصل الزلال (NPM + BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء سطح المناعية عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة باستخدام الأجسام المضادة الأولية المحددة ومعاير مناسب لO4، A2B5، GalC (الجدول 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع NPM + C BSA في ° 4 لمدة 5 دقائق واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لهم محددة في C ° 4 لمدة 20 دقيقة (الجدول 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار لمستضدات الخلايا بما في ذلك nestin، ييفي الحمضية الدبقية بروتين (GFAP)، ويكون من الدرجة الثالثةتا؛-تويولين، والبروتين المايلين الأساسية (MBP) (الجدول 2)، وإصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 2٪ (PFA) لمدة 20 دقيقة في RT وpermeabilize من البرد الإيثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 1X PBS واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية محددة (الجدول 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على التمييز بين الخلايا السليمة والحطام التحت خلوية خلال تحليل التدفق الخلوي، وصمة عار مع خلايا 4،6-diamidino-phenyllindole-2، هيدروكلوريد (دابي) (لايف تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تحقيق الاستفادة المثلى من بروتوكول أعلاه، أجرينا كل التجارب المراقبة المناسبة لتأكيد خصوصية كل immunoreagent. لفترة وجيزة، عن الأجسام المضادة المسماة مباشرة، كان عنصر التحكم المناسب سلبية على الضد مترافق مباشرة للطبقة المناعي نمط إسوي نفس (أو فئة فرعية) والمكورات ملون تألقي والأجسام المضادة الأولية (أي سيطرة نمط إسوي). لالمناعية غير المباشرة من الأجسام المضادة الأولية، والتحكم المناسبة السلبية ثكما الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى ملون تألقي الفائدة التي تستهدف على وجه التحديد الطبقة الغلوبولين المناعي (أو فئة فرعية) من المضيف الذي تم إنشاء الأجسام المضادة الأولية. كنا عندما استخدمت الأجسام المضادة الأولية من المضيفين متعددة (الماوس، الأرنب، الدجاج) معا، والأجسام المضادة الثانوية استهداف الأجسام المضادة الأولية من كل مضيف والأجسام المضادة الثانوية تستخدم كل وعادة عبر كثف المناعية ضد من المضيفين الآخرين لتقليل عبر استضافة تفاعلية مناعية. تضمنت الضوابط الإيجابية المناعية مباشرة أو غير مباشرة من الخلية يعرف الاستعدادات للتعبير عن مستضدات ذات الاهتمام باستخدام إما مباشرة أو غير مباشرة immunoreactions مع الأجسام المضادة الأولية المحددة لهذه المستضدات. نفذت أساليب التحسين المذكورة أعلاه مرة واحدة لكل نوع من التجارب المناعية. كشفت immunoreactions التحكم لم كبيرة عبر حاتمة تفاعلية مناعية بين الأجسام المضادة الأولية والثانوية. تم إجراء التدفق الخلوي بشكل موحد علىعلقت الخلايا fluorescently المسمى باستخدام خلية SE FACVantage فارز (BD العلوم البيولوجية، سان خوسيه، كاليفورنيا) مجهزة مع ثلاثة أشعة الليزر، والتي توفر موجات الإثارة ضبطها إلى 488 نانومتر، 647 نانومتر، والأشعة فوق البنفسجية واسعة (351-364 نانومتر) (الشكل 2) . </li></ol> 5. الفحص المناعي ملاحظة: للحصول على التجارب المناعي، ومطلي شركة تنمية نفط عمان في GF بنسبة ضئيلة أو متوسطة + المتوسطة بنسبة ضئيلة - GF في 2.5e5 في 6 لوحات مغلفة جيدا PDL. يتم إصلاح الخلايا في PFA 2٪ عند نقاط زمنية مختلفة بعد الانسحاب من عوامل النمو. يتم تنفيذ الأجسام المضادة وصمة عار على لوحات بلاستيكية 6 جيدا بدلا من coverslips الزجاج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام وإضافة PFA 2٪. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل PFA. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 3 مرات، 5 دقائق في كل مرة. يجب الحرص على عدم تجفيف الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize الخلايا داخل الخلايا باستخدام علامات ل0.25٪ تريتون في حل PBS لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع غير محددة وملزمة الخلايا كتلة، وأو 10 دقيقة مع HHG (1 عازلة HEPES ملم، 2٪ من مصل الحصان، و 10٪ مصل الماعز في حل هانكس &quot;الملح متوازن). تخفيف الأجسام المضادة الأولية محددة (الجدول 2) إلى تركيز محدد مسبقا في HHG. وضع الأجسام المضادة المخفف على الخلايا. 1 ساعة احتضان RT في على شاكر أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، لمدة 5 دقائق في كل مرة. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (الجدول 2) إلى جانب وجود ملون تألقي إلى تركيز محدد مسبقا في HHG. ضع مزيج من الأجسام المضادة الثانوية المخفف على الخلايا. 1 ساعة احتضان RT في على شاكر في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، لمدة 5 دقائق في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب photobleaching إضافة 10 ميكرولتر من إطالة الذهب مع دابي إلى الخلايا ووضع ساترة الزجاج على رأسها. تصور الخلايا المسماة باستخدام المجهر مضان Axiovert 200M (زايس، Thornwood، NY) (الشكل 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+pathway+of+human+brain+progenitor+cells+identified+by+JC+virus+susceptibility.">Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility.</a> Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11, 951-966 (1993).</li><li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system.">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li><li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+central+nervous+system.">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276, 66-71 (1997).</li><li>Belachew, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+NG2+proteoglycan-expressing+progenitor+cells+are+intrinsically+multipotent+and+generate+functional+neurons.">Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons.</a> J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).</li><li>Almazan, G., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oligodendrocyte+precursor+cell+line+from+rat+optic+nerve.">An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve.</a> Brain Res. 579, 234-245 (1992).</li><li>Filipovic, R., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+minocycline+in+co-cultures+of+human+fetal+neurons+and+microglia.">Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia.</a> Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).</li><li>Goldman, S. A., Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+niche-defying+feat:+induced+oligoneogenesis+in+the+adult+dentate+gyrus.">A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus.</a> Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).</li><li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nat. Med. 9, 439-447 (2003).</li><li>Lyssiotis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+induces+developmental+plasticity+in+oligodendrocyte+precursor+cells.">Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).</li><li>Sim, F. J., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+progenitor+cells+reside+in+an+oligodendrogenic+niche.">White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche.</a> Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-396 (1983).</li><li>Windrem, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cells+derived+from+the+adult+human+subcortical+white+matter+disperse+and+differentiate+as+oligodendrocytes+within+demyelinated+lesions+of+the+rat+brain.">Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain.</a> J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+oligodendrocytes+from+embryonic+stem+cells:+conserved+SHH+signaling+networks+and+divergent+FGF+effects.">Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects.</a> Development. 136, 1443-1452 (2009).</li><li>Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroblasts+distinguished+from+O-2A+glial+progenitors+by+surface+phenotype+(O4+GalC-)+and+response+to+cytokines+using+signal+transducer+LIFR+beta.">Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta.</a> Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+oligodendrocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li><li>Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oligodendrocyte+and+its+many+cellular+processes.">The oligodendrocyte and its many cellular processes.</a> Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).</li><li>Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+human+oligodendroglial+development+in+vitro.">Tracing human oligodendroglial development in vitro.</a> J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).</li><li>Bradl, M., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes:+biology+and+pathology.">Oligodendrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).</li><li>Chong, S. Y., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tapping+into+the+glial+reservoir:+cells+committed+to+remaining+uncommitted.">Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted.</a> J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).</li><li>Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+development+and+the+onset+of+myelination+in+the+human+fetal+brain.">Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain.</a> Front Neuroanat. 3, 5 (2009).</li><li>Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serum-free+derivation+of+oligodendrocyte+precursors+from+neural+stem+cell-enriched+cultures.">Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures.</a> Stem Cells. 27, 116-125 (2009).</li><li>D'Intino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triiodothyronine+administration+ameliorates+the+demyelination/remyelination+ratio+in+a+non-human+primate+model+of+multiple+sclerosis+by+correcting+tissue+hypothyroidism.">Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism.</a> J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).</li><li>Cui, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+different+gestational+stages+exhibit+substantially+different+potential+to+myelinate.">Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate.</a> Stem Cells Dev. , (2012).</li><li>Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+nestin+in+neural+and+glial+cells+in+the+developing+human+CNS+defined+by+a+human-specific+anti-nestin+antibody.">Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody.</a> Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا البروتوكول يصف كيفية اشتقاق oligodendrocytes قد الجنين من المرحلة الابتدائية خلايا العصبية السلف وتميز النمط الظاهري وذلك باستخدام كل من التدفق الخلوي المناعي وتلطيخ. وقد تم توسيع ونمو الأسلاف العصبية من الجهاز العصبي المركزي الجنين بشكل جيد للغاية ووصف 1-4. ومع ذ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تركيز النهائي </td></tr><tr><td> بورصة دبي للطاقة / HAMS F12 01:01 </td><td> أوميغا عالم </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> الأبقار الزلال </td><td> سيجما </td><td> A9418 </td><td> 1٪ </td></tr><tr><td> جنتاميسين </td><td> الجودة البيولوجية </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> الجودة البيولوجية </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 مم </td></tr><tr><td> T3 </td><td> سيجما </td><td> T2877 </td><td> 3 نانومتر </td></tr><tr><td> مكونات N2 </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> شركة PeproTech </td><td> 450-03 </td><td> 2 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> SHH </td><td> R &amp; D النظام </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> شركة PeproTech </td><td> 100-18B </td><td> 20 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> شركة PeproTech </td><td> 100-13A </td><td> 10 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> PDL </td><td> سيجما </td><td> P6407 </td><td> 50 ميكروغرام / م </td></tr><tr><td> PFA </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 15712 </td><td> 2٪ </td></tr><tr><td> التربسين </td><td> الجودة البيولوجية </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> غراء </td><td> ورثينجتون </td><td> LK003178 </td><td> 20 سنة FIFA / مل </td></tr><tr><td> الدناز قارورة </td><td> ورثينجتون </td><td> LK003172 </td><td> 0.005٪ </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> ورثينجتون </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> إطالة الذهب معدابي </td><td> إينفيتروجن </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. الكواشف. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الرئيسية ABS (كل في 1 ميكروغرام / مل) </td><td></td><td> الأنواع نمط إسوي </td><td> مصدر </td><td> الثانوية عبس </td></tr><tr><td colspan="5"> تدفق الخلوي </td></tr><tr><td> A2B5-البيوتين </td><td> فأر </td><td> الغلوبولين المناعي </td><td> هدية J. نيلسون </td><td> Streptavidin PETR، إينفيتروجن، CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> فأر </td><td> الغلوبولين المناعي </td><td> هدية من نيلسون J. </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> فأر </td><td> الغلوبولين المناعي </td><td> ميليبور، MA </td><td> gαm الغلوبولين المناعي-FITC، إينفيتروجن، CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> فأر </td><td> الغلوبولين المناعي </td><td> ميليبور، MA </td><td> gαm الغلوبولين المناعي-FITC، إينفيتروجن، CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> فأر </td><td> مفتش 3 </td><td> ميليبور، MA </td><td> gαm مفتش 3-PE، جنوب الحيوية، AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> دجاج </td><td> IGY </td><td> ميليبور، MA </td><td> dαck IGY-AMCA، جاكسون اللقاحات.، PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> فأر </td><td> مفتش 1 </td><td> Messam وآخرون 2000 28 </td><td> gαm مفتش 1-PECy5، إينفيتروجن، CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> أرنب </td><td> مفتش الحكومة </td><td> ميليبور، MA </td><td> gαrb مفتش-PE، جاكسون اللقاحات، PA </td></tr><tr><td> βIII تويولين </td><td> فأر </td><td> مفتش 2 </td><td> كوفانس، CA </td><td> gαm مفتش 2 A-PETR، إينفيتروجن، CA </td></tr><tr><td colspan="6"> كيمياء سيتولوجية مناعية </td></tr><tr><td> βIII تويولين (1:1،500) </td><td> فأر </td><td> مفتش 2A </td><td> كوفانس، CA </td><td> gαm مفتش 2A-FITC، إينفيتروجن، CA (1:1،000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1،000) </td><td> أرنب </td><td> مفتش الحكومة </td><td> ميليبور، MA </td><td> gαrb مفتش-FITC، جاكسون اللقاحات، PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> دجاج </td><td> IGY </td><td> ميليبور، MA </td><td> dαck IGY-FITC، جاكسون اللقاحات، PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> فأر </td><td> الغلوبولين المناعي </td><td> ميليبور، MA </td><td> gαm الغلوبولين المناعي-AF546، إينفيتروجن، CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> أرنب </td><td> مفتش الحكومة </td><td> ميليبور، MA </td><td> gαm الغلوبولين المناعي-AF750، إينفيتروجن، CA (1:100) </td></tr></tbody></table> الجدول 2 الأجسام المضادة (ABS) المستخدمة في التدفق الخلوي وفحوصات الأجسام المضادة كيمياء سيتولوجية مناعية تقارن: PE، فيكوإيريترين؛ PETR، فيكوإيريترين تكساس الأحمر؛ AMCA، ميثيل الأمينية الكومارين-خلات؛ قبرصي، cyanine؛ FITC، فلوريسئين ايزوثيوسيانيت صك الحكم:. المناعي. . AF: اليكسا فلور؛ gαm: الماعز المضادة للماوس؛ gαrb: الماعز المضادة للأرنب؛ dαck: حمار مكافحة الدجاج. </td></tr></tbody></table>

progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain

التفريق بين الأسلاف العصبية الإنسان في أنواع الخلايا العصبية والدبقية تقدم نموذجا للدراسة والمقارنة بينها تنظيم الخلية العصبية الجزيئية للتنمية النسب. في توسيع المختبر من الأسلاف العصبية من الأنسجة الجنينية CNS اتسمت أيضا. على الرغم من تحديد وعزل الأسلاف الدبقية من الكبار المسألة الفرعية القشرية الإنسان الأبيض وتطور الأوضاع المختلفة لثقافة التمييز المباشر من الأسلاف العصبية الجنينية في إنتاج oligodendrocytes قد المايلين، والحصول على oligodendrocytes قد البشرية الكافية لفي المختبر التجريب لا يزال صعبا. التفريق بين غالاكتوسيريبروزيد + (GalC) وO4 + تم الإبلاغ عن السلائف دبقية قليلة التغصن أو الخلايا الاصلية (OPC) من الخلايا العصبية باستخدام السلائف 2 الثلث الدماغ الجنين. ومع ذلك، فإن هذه الخلايا لا تتكاثر في غياب الخلايا النجمية بما في ذلك دعم والخلايا العصبية، وسرعان ما فقدت مع مرور الوقت في الثقافة. لا تزال الحاجة لنظام الثقافة لإنتاج خلايا دبقية قليلة التغصن من سلالة مناسبة لفي التجريب المختبر. يمكن أن ثقافة الإنسان oligodendrocytes قد الابتدائي، على سبيل المثال، تكون نموذجا مفيدا لدراسة العوامل المعدية التسبب في الموجهات العصبية مثل الفيروسة التورامية الإنسان، JCV، في الجسم الحي أن يصيب تلك الخلايا. يمكن لهذه الخلايا المستزرعة توفر أيضا نماذج من الأمراض الأخرى المزيل من الجهاز العصبي المركزي (CNS). الأولية، والجنين البشري الدماغ المستمدة، multipotential تتكاثر الخلايا الاصلية العصبية في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى خلايا عصبية (عصبونات السلف المستمدة، PDN) والخلايا النجمية (المشتقة من الخلايا النجمية السلف، PDA) تظهر هذه الدراسة أن يمكن أن يتسبب الأسلاف العصبية للتميز من خلال العديد من مراحل التنمية النسب oligodendrocytic (السلف المستمدة من oligodendrocytes قد، PDO). نحن الخلايا العصبية الثقافة السلف في وسائل الإعلام المصل خالية DMEM-F12 سوبplemented مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو (PDGF-AA)، القنفذ الصوتي (SHH)، وعامل التغذية العصبية 3 (NT-3)، N-2 و triiodothyronine (T3). وpassaged في الخلايا المستزرعة في خلايا 2.5e6 في قوارير 75CM تقريبا كل سبعة أيام. باستخدام هذه الشروط، فإن غالبية الخلايا في الثقافة حفاظ على مورفولوجيا تتميز بعض العمليات وعلامات صريحة من قبل خلايا دبقية قليلة التغصن، مثل A2B5 وO-4. عندما كنا إزالة عوامل النمو الأربعة (GF) (bFGF، PDGF-AA، SHH، NT-3) وإضافة وسائط مكيفة من PDN، تبدأ الخلايا للحصول على مزيد من العمليات وعلامات صريحة محددة من التمايز دبقية قليلة التغصن، مثل GalC والمايلين الأساسية البروتين (MBP). أجرينا توصيف المظهري باستخدام متعدد الألوان التدفق الخلوي لتحديد علامات فريدة من دبقية قليلة التغصن.

من المهم جدا لبدء عملية التمايز من -80٪ 70٪ متموجة العصبية السلف زراعة الخلايا (الشكل 1A). سوف تنقرض العديد من الخلايا بعد تغيير ثقافة المتوسط ​​من السلف والمتوسطة بنسبة ضئيلة نظرا لأنه يتضمن عوامل نمو محددة. هذا يدل على أن لن نمو الخلايا العصبية السلف لم يرتكب ...

Watch this Scientific Journal Video about Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain at JoVE.com

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

الأولية، والإنسان الجنين الدماغ المستمدة، تتكاثر الخلايا الاصلية multipotential<em&gt; في المختبر</em&gt; مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى خلايا عصبية والخلايا النجمية. هذا العمل يدل على أن يمكن أن يتسبب الأسلاف العصبية للتميز من خلال مراحل النسب oligodendrocytic من تكييف عوامل النمو مختارة.

السلف المستمدة من نظام الثقافة دبقية قليلة التغصن من دماغ الجنين البشري

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K Views.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. الأولية، والإنسان الجنين الدماغ المستمدة، تتكاثر الخلايا الاصلية multipotential في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى خلايا عصبية والخلايا النجمية. هذا العمل يدل على أن يمكن أن يتسبب الأسلاف العصبية للتميز من خلال مراحل النسب oligodendrocytic من تكييف عوام...

Video: Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

جيل من الخلايا الجذعية العصبية من الأنسجة الجنينية البشرية المهملة القشرية

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

الاشتقاق الثقافات Oligodendrocyte المخصب وOligodendrocyte نيورون / Myelinating المشارك من الثقافات في مرحلة ما بعد الولادة مناديل الفئران

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

وهناك طريقة توسيع المركب-ينطبق على مجاميع من العصبية الجذعية البشرية والخلايا المشتقة من الخلايا السلف الجذعية المحفزة أو الجنين أنسجة المخ

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

جيل بسيطة من ثقافة عالية الغلة المستحث الخلايا العصبية من الخلايا الليفية الجلد الكبار البشرية

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

جيل من Oligodendrocytes وOligodendrocyte- متوسطة مكيفة للتجارب الثقافة المشتركة

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

تشريح وعزل الفئران الدبقية من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

الحصول على ميكروجليا الإنسان من أنسجة الدماغ البشري الكبار

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

توليد الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...