وقد تم تمويل هذا المشروع من خلال منحة من جمعية التصلب المتعدد لكندا RKRWO هي المستفيدة من دراسية لمن جمعية التصلب المتعدد في كندا. حقوق السحب الخاصة هي المستفيدة من المنح الدراسية ما بعد الدكتوراه من جمعية التصلب المتعدد من كندا والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة.

<ol>
	<li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+"oligospheres"+that+retain+differentiation+potential.">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage.">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li><li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li><li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li><li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses.">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li><li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li><li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+characterization,+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors.">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li><li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors.">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+(NGF)+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons.">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا التقرير يصف طريقة لعزل OPCs الفئران عن التمايز في الثقافات OL - OL المخصب أو / DRGN المشترك الثقافات. عند المثقف وحده ، OPCs تفرق في عملية شريان الحياة MBP + هاء ، وإنتاج النخاعين مثل أوراق غشائي. عندما تضاف إلى أسرة DRGN neurite ، شريان الحياة في غلف neurites DRGN مع MBP + غشاء هاء. هذا النموذج يفيد التحقيق في الأسس التي تحكم معقدة رأ بوساطة ensheathment محواري. في حين أن قيمة كبيرة ، وإنشاء مثل هذه الثقافات يشكل تحديا تقنيا. على وجه الخصوص ، وتشمل الجوانب تطالب كفاءة الهضم الأنسجة / التفكك ، والحفاظ على توازن درجة الحموضة ثقافة الإعلام ، والتغيرات DRGN وسائل الإعلام. من المهم أن نرى أن طول الهضم ، ويجري استيعاب كمية الأنسجة وكمية سحن يؤثر على فعالية ونتيجة نهاية تفارق الأنسجة. ليس من غير المألوف بالنسبة للباحثين من ذوي الخبرة للحصول على غلة الخلوية منخفضة من فصل أنسجة الجهاز العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، OPCs الفئران تميل إلى أن تكون حساسة للتغيرات في درجة الحموضة وسائل الإعلام والثقافة ، وخاصة في ظل الظروف القلوية. الحفاظ على الثقافات في CO 2 و 8.5 ٪ يهدف إلى منع حدوث ذلك ، تظهر منذ OPCs على تحمل الظروف الحمضية أفضل بقليل الأساسية. فيما يتعلق DRGNs التغذية ، ويجب إجراء تغييرات وسائل الإعلام بسرعة حتى لا يجفف الخلايا العصبية ، ومع ذلك ، يجب أن يكون لطيف حتى لا تعطل السرير neurite النامية. وسائل الاعلام قد المفاجئ التغييرات طرد من السرير neurite الركيزة ، ويؤدي على الأرجح في التفكك التام من ساترة. ميزة المحتملة لهذا النظام النموذجي يلقي بظلاله بشكل كبير طبيعته تطالب تقنيا. ميزة واحدة من هذا النظام هو استخدام ما بعد الولادة الفئران لاشتقاق ثقافة الخلية ، ملتفا على ضرورة التضحية تربية الإناث لحصاد الأنسجة الجنينية. ميزة أخرى هي عدم وجود شرط لعوامل النمو (GFS) للتوسع في OPCs. ثقافات مختلطة الدبقية توفير بيئة تدعم نشر OPCs ، ويفترض أن يعود إلى وجود عوامل التغذية نجمية المشتقة. أساليب أخرى ، مثل الاشتقاق عبر neurospheres 7،8 ، تعتمد على خصائص مولد للتفتل من GFS مثل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، عامل نمو البشرة (EGF) وصفائح المستمدة عامل النمو (PDGF) للتوسع OPC. وبالمثل ، وذلك باستخدام ما بعد الولادة (P5 - 10) الفئران ليتجنب DRGNs شرط المكمل لثقافة الإعلام مع عامل نمو الاعصاب (NGF) ، وهو عامل التغذية العصبية اللازمة للبقاء على قيد الحياة في المختبر من DRGNs الجنينية 9 و 10. فمن مصلحة لتجنب استخدام NGF كما أنه يؤثر سلبا على قدرة myelinating عملية شريان الحياة عند المثقف مع DRGNs 4. تجنب استخدام GF - تستكمل وسائل الإعلام أيضا فوائد اقتصادية ، إذ أن هذه الكواشف تصبح مكلفة عند استخدامها على نطاق واسع. ولعل أهم فائدة من هذا النموذج هو ثقافة الاشتقاق من الماوس فقط الأنسجة ، وبالتالي توفير الفرص لاستخلاص كل من OPCs وDRGNs من تشكيلة واسعة من خطوط الفأر المعدل وراثيا. وهذا يسمح لدراسة كل من و / أو DRGN OPC محددة الخصائص التي تحكم تكون الميالين. وسوف يكون هذا أهمية خاصة بالنسبة للتوضيح التفاعلات مستقبلات / يجند تنظيم رأ بوساطة تكون الميالين من المحاور. في كل شيء ، هذه التقنية هي ذات قيمة كبيرة بالنسبة للبحوث علم الأعصاب بسبب تطبيقاتها نحو فهم الاشارات الجزيئية الكامنة وراء تكون الميالين.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المنتج </td><td> شركة </td><td> رقم المنتج </td></tr><tr><td> Dulbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM) </td><td> Multicell </td><td> 319-005 - CL </td></tr><tr><td> هانك محلول الملح المتوازن (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> وسائل الإعلام الأساسية الدنيا (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> الجنين مصل البقر (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> البنسلين الستبرتوميسين (القلم / بكتيريا) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> بولي - L - يسين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> الأبقار مصل الزلال (BSA) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> الإنسان merosin تنقية البروتين (LN2) </td><td> ميليبور </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> المؤتلف عامل الفئران عصبية الهدبية (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L - هرمون الغدة الدرقية </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> هولو ، ترانسفيرين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 تكملة </td><td> GIBCO </td><td> 0080085 - SA </td></tr><tr><td> الأنسولين البقري </td><td> سيغما الدريخ </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3،3 &#39;،5 - Triiodo - L - ثيرونين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> البروجسترون </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> بوتريسين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> الصوديوم زيلونيت </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5 - الفلورية 2&#39; - deoxyuridine (FuDR) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> غراء الحل </td><td> ورثينجتون </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L - السيستين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24 الأطباق جيدا زراعة الأنسجة </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> T25 النسيج ثقافة القوارير مع غطاء تنفيس </td><td> كورنينج </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 سم أطباق زراعة الأنسجة </td><td> كورنينج </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 سم طبق بتري </td><td> فيشر العلمية </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> كولاجيناز A </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 ميكرون فلتر (اختياري) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> بروتين النخاعين الأساسي (MBP) جسم </td><td> عبد Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 الأضداد </td><td> ميليبور </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> المايلين المرتبطين جلايكوبروتين (MAG) الأضداد </td><td> ميليبور </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;، 3&#39; - دائرى - النوكليوتيدات 3&#39; - فسفودايستراز (CNP) الأضداد </td><td> كوفانس </td><td> SMI - 91R - 100 </td></tr><tr><td> أكتين عموم AB - 5 الأضداد </td><td> فيتزجيرالد </td><td> 10R - A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilament - 200 (NF) الأضداد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> بيتا 3 تويولين سلسلة (Tuj1) الأضداد </td><td> ميليبور </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> الكسا فلور 488 الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L) الأجسام المضادة الثانوية </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> الكسا فلور 555 الماعز المضادة للمفتش الماوس (H + L) الأجسام المضادة الثانوية </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> الكسا فلور 647 ماعز مكافحة الجرذان (مفتش) (H + L) الأجسام المضادة الثانوية </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> الماعز المضادة للمفتش الماوس (H + L) - HRP الضد الثانوية مترافق </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> الماعز لمكافحة الفئران مفتش (H + L) - HRP الضد الثانوية مترافق </td><td> سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية </td><td> SC - 2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table> وصفات وسائل الاعلام OL - 100X الملحق * <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> إضافة إلى مبلغ </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 مل </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1.02 ز </td></tr><tr><td> البروجسترون </td><td> 0.6 ملغ </td></tr><tr><td> بوتريسين </td><td> 161 ملغ </td></tr><tr><td> الصوديوم زيلونيت </td><td> 0.05 ملغ </td></tr><tr><td> 3،3 &#39;،5 - Triiodo - L - ثيرونين </td><td> 4 ملغ </td></tr></tbody></table> * في مخزن -80 درجة مئوية في 250 aliquots ميكرولتر ر &quot;&gt; وسائل الاعلام OL <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> إضافة إلى مبلغ </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23.75 مل </td></tr><tr><td> OL - 100X الملحق </td><td> 250 ميكرولتر </td></tr><tr><td> البقري الأنسولين (من المخزون ملغ / مل 1) </td><td> 125 ميكرولتر </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 250 ميكرولتر </td></tr><tr><td> هولو ، ترانسفيرين (من المخزون ملغ / مل 33) </td><td> 37.5 ميكرولتر </td></tr><tr><td> B27 الملحق </td><td> 500 ميكرولتر </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 ميكرولتر </td></tr><tr><td> CNTF (من المخزون نانوغرام / ميكرولتر 50) </td><td> 25 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> مختلطة وسائل الإعلام الثقافة الدبقية (تتكون في DMEM) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10 ٪ </td></tr><tr><td> القلم / بكتيريا (0.33 ٪ من الأسهم) </td><td> 33 وحدة / مل البنسلين والستربتوميسين 33 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 1 ٪ </td></tr></tbody></table> DRGN سائل الإعلام (تتكون في DMEM) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10 ٪ </td></tr><tr><td> القلم / بكتيريا (1 ٪ من الأسهم) </td><td> 100 وحدة / مل و 100 البنسلين الستبرتوميسين ميكروغرام / مل </td></tr></tbody></table> وصفات الهضم الحل : OPC غراء الحل (تتكون في MEM) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> غراء الحل </td><td> 1.54 ملغ / مل </td></tr><tr><td> L - السيستين </td><td> 360 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 ميكروغرام / مل </td></tr></tbody></table> DRG غراء الحل (تتكون في HBSS) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> غراء </td><td> 1.54 ملغ / مل </td></tr><tr><td> L - السيستين </td><td> 360 ميكروغرام / مل </td></tr></tbody></table> DRG كولاجيناز حل (تتكون في HBSS) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> كولاجيناز A </td><td> 4 ملغ / مل </td></tr></tbody></table>

derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues

تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء التنمية رأ ليس فقط ضروري لتعزيز معرفتنا البيولوجيا الرتب الأخرى ، ولكن أيضا لفهم الآثار المرضية للأمراض المزيل مثل التصلب المتعدد (MS). تدرس عادة الخليوي تطوير النماذج الأولية مع ثقافة الخلية. زراعة الخلايا الأولية يسهل تقييم لإعطاء نوع من الخلايا من خلال توفير بيئة تسيطر عليها ، وخالية من المتغيرات الدخيلة التي تكون موجودة في الجسم الحي. في حين أن الثقافات رأ المستمدة من الفئران وفرت كمية هائلة من نظرة ثاقبة البيولوجيا OL ، وقد اجتمعت جهود مماثلة في إرساء ثقافات رأ من الفئران مع العقبات الرئيسية. تطوير أساليب عملية شريان الحياة لثقافة الفئران الأولية لا بد من أجل الاستفادة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا المتوفرة. وقد وصفت وسائل متعددة لاستخراج OPCs من أنسجة القوارض ، بدءا من neurosphere الاشتقاق ، والفرق تنقية التصاق immunopurification 1-3. بينما تقدم العديد من أساليب النجاح ، والأكثر ثقافة واسعة تتطلب مرات و / أو معدات مكلفة / الكواشف. للتحايل على هذا ، وتنقية OPCs من أنسجة الفئران مع تكييف الطريقة الموصوفة في الأصل من قبل Vellis مكارثي &amp; دي 2 هو المفضل. هذا الأسلوب ينطوي على OPCs جسديا فصل من ثقافة الدبقية المختلطة المستمدة من القشور القوارض الولدان. والنتيجة هي مجموعة من السكان OPC المنقى التي يمكن أن تكون متمايزة في ثقافة OL - المخصب. هذا النهج هو جذابة بسبب الوقت القصير نسبيا على ثقافتها وشرط ضروري لعوامل النمو أو الأضداد immunopanning. في حين استكشاف آليات التنمية رأ في ثقافة المنقى غني بالمعلومات ، فإنه لا يوفر البيئة الأكثر ملاءمة فيزيولوجيا لتقييم المايلين غمد تشكيل. وشارك في زرع شريان الحياة للسودان مع الخلايا العصبية تقديم نظرة ثاقبة على الأسس الجزيئية التي تنظم رأ بوساطة تكون الميالين من المحاور. بالنسبة للعديد من رأ / عصبون شارك في دراسات ثقافة ، وقد أثبتت الخلايا العصبية الظهرية العقدة الجذر (DRGNs) لتكون من نوع الخلايا العصبية في الاختيار. وهي مثالية للثقافة بالتعاون مع عملية شريان الحياة الخاصة بهم نظرا لسهولة استخراج ، كمية ضئيلة من الخلايا الملوثة ، وتشكيل أسرة neurite الكثيفة. بينما تم نشر الدراسات التي تستخدم الفئران / الماوس myelinating xenocultures 4-6 ، طريقة لاستخلاص هذه رأ / DRGN myelinating شارك في ثقافات ما بعد الولادة من أنسجة الفئران لم يتم وصفها. هنا نقدم طرق تفصيلية بشأن كيفية إنتاج مثل هذه الثقافات على نحو فعال ، جنبا إلى جنب مع أمثلة من النتائج المتوقعة. هذه الطرق مفيدة لمعالجة المسائل ذات الصلة بالتنمية رأ / الوظيفة myelinating ، وأدوات مفيدة في مجال علم الأعصاب.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues at JoVE.com

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

توضح هذه المقالة الطرق لاستخلاص اليورانيوم من السكان الفئران الخلايا السليفة oligodendrocyte (OPCs) في الثقافة الأولية ، والتي تفرق لإنتاج oligodendrocytes ناضجة (شريان الحياة). بالإضافة ، فإن هذا التقرير يصف التقنيات لانتاج الفئران myelinating المشترك الثقافات OPCs بذر الماوس على سرير neurite من الخلايا العصبية الظهرية الماوس العقدة الجذر (DRGNs).

الاشتقاق الثقافات Oligodendrocyte المخصب وOligodendrocyte نيورون / Myelinating المشارك من الثقافات في مرحلة ما بعد الولادة مناديل الفئران

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.0K Views.  Ottawa Hospital Research Institute. توضح هذه المقالة الطرق لاستخلاص اليورانيوم من السكان الفئران الخلايا السليفة oligodendrocyte (OPCs) في الثقافة الأولية ، والتي تفرق لإنتاج oligodendrocytes ناضجة (شريان الحياة). بالإضافة ، فإن هذا التقرير يصف التقنيات لانتاج الفئران myelinating المشترك الثقافات OPCs بذر الماوس على سري?...

Video: Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

الحفظ بالتبريد من كتل الأنسجة القشرية للجيل الثقافات متعلق بالخلايا العصبية التخصيب

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

الاشتقاق من السلائف المقيد الغروية من E13 الفئران

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell lineage development. In vitro expansion of neural progenitors from fetal CNS tissue has been well characterized. Despite the identification and isolation of glial progenitors from adult human sub-cortical white matter and development of various culture conditions to direct differentiation of fetal neural progenitors into myelin producing oligodendrocytes, acquiring sufficient human oligodendrocytes for in vitro experimentation remains difficult. Differentiation of galactocerebroside+ (GalC) and O4+ oligodendrocyte precursor or progenitor cells (OPC) from neural precursor cells has been reported using second trimester fetal brain. However, these cells do not proliferate in the absence of support cells including astrocytes and neurons, and are lost quickly over time in culture. The need remains for a culture system to produce cells of the oligodendrocyte lineage suitable for in vitro experimentation.
Culture of primary human oligodendrocytes could, for example, be a useful model to study the pathogenesis of neurotropic infectious agents like the human polyomavirus, JCV, that in vivo infects those cells. These cultured cells could also provide models of other demyelinating diseases of the central nervous system (CNS). Primary, human fetal brain-derived, multipotential neural progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons (progenitor-derived neurons, PDN) and astrocytes (progenitor-derived astrocytes, PDA) This study shows that neural progenitors can be induced to differentiate through many of the stages of oligodendrocytic lineage development (progenitor-derived oligodendrocytes, PDO). We culture neural progenitor cells in DMEM-F12 serum-free media supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 and triiodothyronine (T3). The cultured cells are passaged at 2.5e6 cells per 75cm flasks approximately every seven days. Using these conditions, the majority of the cells in culture maintain a morphology characterized by few processes and express markers of pre-oligodendrocyte cells, such as A2B5 and O-4. When we remove the four growth factors (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) and add conditioned media from PDN, the cells start to acquire more processes and express markers specific of oligodendrocyte differentiation, such as GalC and myelin basic protein (MBP). We performed phenotypic characterization using multicolor flow cytometry to identify unique markers of oligodendrocyte.

Primary, human fetal brain-derived, multipotential progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons and astrocytes. This work shows that neural progenitors can be induced to differentiate through stages of the oligodendrocytic lineage by conditioning with select growth factors.

السلف المستمدة من نظام الثقافة دبقية قليلة التغصن من دماغ الجنين البشري

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

في وقت واحد قبل وبعد متشابك تسجيل الكهربية من<em&gt; القيطم</em&gt; العصبي العضلي المشارك الثقافات

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

إعداد العصبية المشارك الثقافات واحدة مع الدقة الخليوي

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

التحقيق التجديد الوظيفي في الحبل الشوكي عضوي النمط المشارك الثقافات نمت على صفائف متعدد القطب

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

الاشتقاق الثقافات السحايا الرقيقة يزدرع من تشريح الجهات المانحة الدماغ البشري

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which macrophages are induced to produce conditioned medium (CM) that promotes neurite outgrowth. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are acutely dissociated and plated. After the neurons are stably attached, peritoneal macrophages are co-cultured on a cell culture insert overlaid on the same well. Dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) is applied to the co-cultures for 24 h, after which the cell culture insert containing the macrophages is moved to another well to collect CM for 72 h. The CM from the co-cultures treated with db-cAMP, when applied to a separate adult DRG neuron culture, exhibits robust neurite outgrowth activity. The CM obtained from the db-cAMP-treated cultures consisting of single cell type alone, either DRG neuron or peritoneal macrophage, did not exhibit neurite outgrowth activity. This indicates that the interaction between neurons and macrophages is indispensable for the activation of macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity into CM. Thus, our co-culture paradigm will also be useful to study intercellular signaling in the neuron-macrophage interaction to stimulate the macrophages to be endowed with a pro-regenerative phenotype.

The current protocol presents experimental procedures to stimulate cultured macrophages to be endowed with capacity to release molecular factors that promote neurite outgrowth. Treatment of cAMP to the neuron-macrophage co-cultures induces the macrophages to produce conditioned medium that possesses strong neurite outgrowth activity.

بلعم العصبية الثقافات المشارك لتفعيل الضامة إفراز العوامل الجزيئية مع نشاط ثمرة نورت

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

إعداد و Immunostaining أورجانوتيبيك ميليناتينج شريحة الدماغ الثقافات

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...