يجمع البروتوكول بين العزلة الخاصة بالعمر للثقافات المختلطة العفوية المشتقة من الخلايا الجذعية العصبية التي تحتوي على الخلايا السليفة والخلايا الفلكية المتمايزة ، والكؤس التي تحاكي الحالات المرضية ، والقراءات القوية عالية المحتوى. هذه الخصائص تجعل من الممكن دراسة تفاضلية المايلين التنموية وإعادة الايلين الكبار في الظروف الفسيولوجية والمرضية وفي البيئة الدقيقة التي تأخذ في الاعتبار مساهمة الخلايا الفلكية. لعزل الخلايا الجذعية العصبية من اليوم الجنيني 13.5 إلى 14.5 العقول الجنينية، ضع رؤوس الأجنة في طبق بيتري نظيف مع برنامج تلفزيوني بارد الجليد واستخدام ملقط لإزالة الجلد من الجمجمة تحت التكبير.
بمجرد أن يكون الدماغ مرئيا ومخلوا من الجلد ، استخدم ملقطا للضغط على الدماغ من الجمجمة وإزالة المخيخ. استخدام ملقط لإزالة السحايا ووضع الأنسجة المعزولة في العازلة الفصام غير الأنزيمية. عندما تم عزل جميع أنسجة الدماغ، اسحب عينتين إلى ثلاث عينات في 150 ميكرولتر من عازل التفكك غير الأنزيمي لكل أنبوب 1.5 ملليلتر، واحتضان الأنابيب لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر.
في نهاية الحضانة، أضف 850 ميكرولتر من الوسط القياسي إلى كل أنبوب وماصة لخلطها حتى يصبح التعليق خاليا من الكتل. إذا كانت الأنسجة غير المفككة لا تزال مرئية، فسمح للعينات بالراحة لمدة دقيقتين للسماح للأنسجة بالاستقرار في أسفل الأنابيب. عندما يكتمل التفكك، تقوم خلايا الصفائح بكثافة من 10 إلى 50 خلية لكل ميكرولتر في 10 إلى 30 ملليلتر من التركيز المتوسط للغلاف العصبي في قارورة T25 أو T45، ووضع القارورة في حاضنة ثقافة الخلية في وضع عمودي لمنع ارتباط الخلية.
من الفئران البالغة من العمر 2.5 شهرا، وضع العقول من أربعة إلى خمسة فئران بالغة في أنبوب 50 ملليلتر من HBSS الجليد الباردة ووضع دماغ واحد، الجانب البطني إلى أسفل، في الاتجاه الوردي-caudal على قارورة معقمة الألومنيوم المغطاة احباط مليئة ناقص 20 درجة مئوية الماء البارد بين عشية وضحاها. استخدم شفرة حلاقة لإزالة المصابيح الشمية وقطع شريحتين إلى ثلاث شرائح تاجية سمكها ملليمتر واحد من القشرة إلى الشياسما البصرية. ضع الشرائح على السطح البارد في وضعية البطين الظهري، وحدد كالوسوم الجسم والبطينين الجانبيين.
باستخدام التكبير، عزل جدران البطينين الجانبيين، مع الحرص على عدم تضمين قطع من كالوسوم الجسم، ووضع الأنسجة المعزولة في خمسة إلى 10 ملليلتر من العازلة الانزيمية الفصام لمدة 15 دقيقة حضانة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، ماصة الأنسجة 50 مرة على الأقل قبل احتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق إضافية. في نهاية الحضانة، تحييد التريبسين مع خمسة ملليلتر من المتوسطة الثقافة القياسية وتصفية تعليق الأنسجة من خلال مرشح 70 ميكرون.
طرد مركزي الحل المصفى لمدة خمس دقائق في 400 مرة غرام، وإعادة تعليق بيليه في محلول السكروز لطارد مركزي ثان. في نهاية الطرد المركزي، إعادة تعليق بيليه في مصل البقر حل غسل الألبومين لطارد مركزي آخر، ثم إعادة تعليق بيليه في المتوسط الثقافة القياسية لعد ولوحة الخلايا في قارورة T-25 أو T-45 تستقيم. للتمايز العصبي الأساسي، أضف عوامل النمو الأساسية للخلايا الليفية والظهارية إلى ثقافة الخلايا الجذعية العصبية كل يومين.
عندما تصل الخلايا العصبية إلى قطر يتراوح بين 100 و500 ميكرون، فإن مرور الخلايا عن طريق الانفصال الميكانيكي وفقا للبروتوكولات القياسية. لتمايز الغلاف الأرضي، عالج الخلايا بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية في العامل المشتق من الصفائح الدموية-AA كل يومين. عندما يصل قطر الأطباق إلى قطر يتراوح بين 100 و150 ميكرون، ينفصم المجالات عن طريق التفكك الميكانيكي وفقا للبروتوكولات القياسية ويزرع تعليق الخلية بكثافة 3000 خلية لكل سنتيمتر مربع على لوحات مغلفة بطبقات بولي-DL-ornithine.
بعد ثلاثة أيام، استبدال supernatant من كل ثقافة مع نفس الحجم من oligodendrocyte التمايز المتوسطة. لإجراء تحريض كتلة التمايز بوساطة الالتهاب ، بعد تفكك الغلاف العصبي وأثناء إنتاج oligosphere ، أضف مزيج السيتوكين المثير للاهتمام إلى وسيط الثقافة. للحث على موت خلية الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، بعد يومين من البذر في لوحات متعددة الآبار ، قم بنقل الناسخ من كل ثقافة إلى آبار فردية من لوحة متعددة الآبار.
إضافة نصف حجم OGD المتوسطة إلى الآبار، ونقل الثقافات إلى غرفة نقص الأكxia محكم المشبعة 95٪ النيتروجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ضع الغرفة في حاضنة ثقافة الخلية. بعد ثلاث ساعات، استبدل الوسط في الغرف بالوسط المخصص للوحة الثقافة متعددة الآبار.
بعد التحقق من جودة تلطيخ الخلية ، في قائمة الاستحواذ على برنامج الفحص عالي المحتوى ، حدد وقت التعرض الثابت والمسح الضوئي المصغر ، وحدد 10 حقول لكل بئر وبأبارين لكل حالة تجريبية للسماح بتعيين معلمات التحليل في المجموعة الفرعية من الحقول للوح بأكمله. اتبع سير العمل خطوة بخطوة لتطوير الخوارزمية بأكملها. حدد صورة العملية لكل قناة وانقر فوق إزالة الخلفية لتحديد المستوى المطلوب للإشارة.
لتحديد وتحديد النوى عن طريق تلطيخ النووية، انقر فوق تحديد الكائن الأساسي، وضبط عتبة لتحديد نواة واحدة، وانقر على التحقق من صحة الأجسام الأولية لتعيين العتبات على أساس مناطق الكائن والموقف. انقر فوق تحديد البقع لكل قناة المقابلة لعلامات النسب محددة، وتعيين عرض قيمة الحلقة إلى ثلاثة والمسافة إلى الصفر للسماح بتحديد الفلورية الخلوية. حدد المستويات المرجعية في سير العمل لبناء التحليل والسماح بالفرز التلقائي للنوى المكثفة استنادا إلى الحجم النووي وكثافة التلطيخ النووي والخلايا الإيجابية المحددة القائمة على الفلورية الخلوية التي حددها الحلقة ، ثم انقر فوق تشغيل.
خلال المرحلة الأولى من الثقافة ، تحافظ الخلايا الجذعية العصبية على تعبير النستين. غالبية الخلايا هي أيضا NG2 إيجابية. CNPase إيجابية الخلايا المقابلة لمرحلة ما قبل oligodendrocyte يمكن الكشف عنها بعد ثلاثة إلى ستة أيام من تحريض التمايز T3 بوساطة, في حين أن الخلايا الأوليغوديندريسيتية إيجابية MBP ناضجة تظهر في نسبة كبيرة بعد ستة إلى 12 يوما في المختبر.
يسمح تحليل الفحص عالي المحتوى باكتشاف خلايا مفردة داخل الثقافة من خلال تحليل تلطيخ نووي وكثافة الفلورسينس. يختلف تكوين الثقافة في نهاية مرحلة التمايز اعتمادا على ما إذا كانت الثقافات من أصل جنيني أو بالغ ، مع ثقافات الجنين أكثر استجابة للتمايز بوساطة T3 ، وتصل إلى نسبة أعلى من oligodendrocytes الناضجة. لاحظ أنه عندما يتم بذر الخلايا السليفة المشتقة من الخلايا الجذعية العصبية oligodendrocyte بكثافة عالية ، فإنها تجمع ، وتكرار الخلايا الفلكية تنتج بسرعة طبقة خلية التقاء ، مما يمنع مراقبة شكل شبكة العنكبوت المميزة لخلايا أوليغودندروسيت الناضجة.
التهاب بوساطة, حجب التمايز يؤدي إلى انخفاض قوي في oligodendrocytes قبل وناضجة, كما اكتشفت من قبل CNPase وMBP تلطيخ في كل من الثقافات الجنينية والكبار. زيادة في عدد خلايا أوليغودندروسيت السلائف يحدث أيضا في الثقافات الكبار المعالجة بالسيتوكين. في حين أن خلايا السلائف الأوليغوديندريوسيت الجنينية والبالغة تظهر نفس الشيء مع التعرض للالتهابات السيتوكين ، إلا أن الثقافات المشتقة من الجنين فقط هي الحساسة لسمية الحرمان من الأكسجين والجلوكوز.
ويمكن تنفيذ هذه الطريقة مع أي نوع من الخلايا السلائف oligodendrocyte، والتمايز والنضج التدخل عملية، لاختبار استراتيجيات جديدة تهدف إلى مكافحة الأمراض التي تؤثر على المايلين أو إعادة الايلين
