ברצוננו להביע את הערכתנו לקלט והערות מחברי מעבדת הפדייה. זנים נמטודות בעבודה זו נמסרו על ידי גנטיקת Caenorhabditis המרכז, אשר ממומן על ידי NIH המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR). אנו מכירים בכך ומודים לד&quot;ר לון טרנבול לסיוע טכני במיקרוסקופיה confocal. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומי למדע (NSF-IOS, קריירה) לPAP

1. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר או להשיג המהונדס ג המתאים elegans להתאמץ עניין שימוש במתודולוגיות מהונדסות או מCaenorhabditis גנטיקת מלאי מרכז (CGC) או קולגה. במקרה זה אנו משתמשים במתח TH32 (עוגה-1 :: TBG-1 :: GFP; עוגה-1 :: GFP :: H2B) 5 לדמיין הכרומוזומים וcentrosomes כסמנים לחלוקת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור אוכלוסייה מסונכרנת באמצעות אחת מהשלוש שיטות: 1) תתפורר מבוגרים הרה בתמיסת היפוכלוריט ולהשתמש עוברים שנותרו 6, 2) לאסוף מבוגרים הרה לצלחת seeded ונותן שיגעו לעוברים 1-2 שעות, או 3) לאסוף L4 זחלים מאוכלוסייה ומהלך מעורב לצלחת seeded חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול נמטודות ב 20 ° C לבגרות הרה צעירה, שתיקח כ 96 שעות מבקיעה, 72 שעות מזחלי L1 או נשירת 24 שעתי הודעת L4. עוברים (2-20 תא) ברחם מכילים לסטומרים וגרעינים גדולים שהם אופטימליים למתארים לעצמיing שינויים תת סלולריים ותת גרעיניים, בהתאמה. מתודולוגיה זו מספקת אמצעי ליצירת אוכלוסייה של צעירים המכילים מספר שופע של עוברים מוקדמים. </li></ol> 2. הכנת מצגת וanoxia קאמרי הגדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תא לח להחזיק שקופיות שהוכנו על ידי הצבת מגבת נייר לחה בתוך צלחת פטרי גדולה או פח מכוסה במכסה בהיקף מספיק גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מותך 2% agarose בdeionized H 2 O על ידי חימום תערובת זכוכית באמבטיה באמצעות מיקרוגל או מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 1-3 טיפין של agarose החם בשקופית מיקרוסקופ זכוכית נקיה. מייד למקם את השקופית שנייה ההפוכה ניצב בראש טיפת agarose (הים), לחץ מעט כדי שהמשטח שיתקבל יהיה דק וללא בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר זמן להתקרר ולפרק לאט את שתי שקופיות מיקרוסקופ עוזבים את כרית agarose שלם על אחת המגלשות. זה חשוב כדי להבטיח את כרית agarose הוא דק מספיק כדי לא interfeמחדש עם היכולת להתמקד מיקרוסקופ מאוחר יותר. יכולת לחזות מדגם תלוי גם במרחק המסוים האופטי של המטרה בשימוש, אשר יכול להשתנות בין מיקרוסקופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסכין גילוח נקי לעצב כרית agarose בכיכר קטנה. אחסן בתא הלח המוכן עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות, תוך שימוש באותה סכין הגילוח נקי, לקחת את קצה משטח agarose ולהעביר אותו מהשקופית על coverglass מ&quot;מ מייקרו 25 עגול, הימנעות מההצטברות של בועות אוויר מתחת לכרית. Coverglass הסיבוב בחר להשתמש משתלב כראוי בmicroincubator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של חומר ההרדמה (0.5% tricaine, tetramisole 0.05% בM9 חיץ) על כרית agarose לשימוש כחומר הרדמה. פיק תולעים ומקום 5-10 לירידה של חומר הרדמה. אפשר 1-3 דקות לתולעים להפסקות תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרציונל להתבוננות עוברים בתוך הרחם הבוגר, במקום עוברים מכותרים, הוא למזער את הפוטנציאל של העובר desiccation ותנועה בגלל הזרימה של גז חנקן על פני העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להוסיף טיפת שמן halocarbon על גבי את התולעים כדי למנוע את התולעים מהתייבשות כזרם גז דרך החדר. מאז שמן halocarbon צמיג אחד יכול להשתמש בטיפ pipet או קצה תולעת לאסוף לאסוף נפט וירידה על התולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע coverglass המעגלי המכיל את התולעים מוכן, שני חצי ליידן נסגרו זלוף microincubator מופרדים, ואז coverglass הוא מונח בזהירות הזקופה לטבעת התחתונה. שני הצדדים של החדר לאחר מכן, סגורים היטב יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן התא מחובר למכל גז החנקן באמצעות צינור פלסטי גמיש ולהציב לתוך המקום המתאים בשלב מיקרוסקופ (התרשים 1C). בשלב זה הצינור וmicroincubator צריכים להיבדק בזהירות לכל דליפות על ידי הבטחת התקשרות בטוחה של הצנרת ושל תקעי היציאה בצד של החדר. אפשר אלכך התפשט בקלילות כמות קטנה של מי סבון על הצינורות לחפש בועות, שתהווינה אם דליפה היא הווה. </li></ol> 3. מיקרוסקופי באנוקסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר חיות בהגדלה נמוכה, ולאחר מכן, להעביר להגדלה המתאימה הגבוהה יותר (64x עבור יישום זה) לרקמת תאי תמונה או עניין כגון לסטומרים או ביציות עובריות במבוגרים. הפעל את ליזר ננומטר 488 כדי להציג אות ה-GFP ולאתר חלבון היתוך GFP בתא (הים) של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את המעצר בשלב מסוים של מחזור תא מעצר (prophase מאוחר למשל) לזהות blastomere בשלב מוקדם של חלוקת תא (לדוגמא interphase מאוחר או prophase מוקדם). סמנים סלולריים כמו עמדת centriole, ייזום של עיבוי כרומוזום, כרומוזום מיקום ונוכחות או עדר של מעטפת הגרעין יסייעו לזהות שלב מחזור תא (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז הקאמרי הוא perfused עם גז חנקן (99.999%N 2; &lt;2 עמודים לדקת פלט 2). במקרה זה אנו משתמשים בלחץ של 6 אטמוספרות, אולם לחץ ייתכן שיצטרך להיות מותאם ומותאם בהתאם לגודלו של כל microincubator וקוטר של צינורות בשימוש. המשך לעקוב אחר blastomere (הים) כחנקן ממלא את החדר, התאמת מטוס המוקד בהתאם לצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה זו, הדמית זמן לשגות החלה. הדמיה מבוצעת לכל זמן שיידרש כדי ללכוד תופעה של עניין, במקרה המעצר הזה prophase והעגינה של כרומוזומים לקרום הגרעין הפנימי. תמונות נלקחות פעם אחת בכל 10 שניות לא יותר מ 30 דקות. תדרים של לכידת תמונה והגדרות כגון רווח וכוח הליזר צריכים להיות מותאמים לפי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזמן שבו העוברים מגיבים לסביבת anoxic יכול להשתנות בהתאם לשלב מחזור התא בתגובה לחשיפת חמצן בדם. בדרך כלל מעצר prophase אנוקסיה מושרה מתרחש בתוך 20-30 דקות מתחילת זרימת גז חנקן. אנו צפינו occu עצירת מחזור התא אנוקסיה המושריתrring ב&lt; 20 דקים &#39;. תמונות ניתן לקבל במסגרת זמן זו, או תמונות מסוימות יכולות להיות מבודדות מאוחר יותר מסדרת הזמן לשגות. אפשרות נוספת היא להשתמש במיקרוסקופ וידאו לדמיין מבני משנה הסלולר בעוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתעד את ההתאוששות מהמדינה נעצרה אנוקסיה המושרית, מופעל הגז מול וקאמרי הוא יורשה לחזור לnormoxia ידי דיפוזיה עת הקלטת סדרת זמן לשגות. חידוש התקדמות מחזור התא וundocking של כרומוזומים מתרחש בדרך כלל בתוך 5-20 דקות של כיבוי גז החנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לציין כי בניסויים נפרדים מחוון חוסר חמצן, resazurin, הוצב בזרימה דרך microchamber; נקבע כי התא הופך anoxic בממוצע של כ 19 דקות לאחר שזרימת גז החנקן החלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות וקטעי וידאו מעובדים באמצעות Imaris, התמונה J או פוטושופ ויובאו לQuickTime לתצוגה. </li></ol>

<ol>
	<li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans.">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li><li>Padilla, P. A., Ladage, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+animation,+diapause+and+quiescence:+Arresting+the+cell+cycle+in+C.+elegans.">Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer.">Dauer.</a> WormBook. , 1-19 (2007).</li><li>Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+and+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Longevity and stress in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).</li><li>Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+cytoplasmic+dynein+heavy+chain+in+Caenorhabditis+elegans+with+fast-acting+temperature-sensitive+mutations.">Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).</li><li>Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li><li>Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sub-nuclear+changes+in+Caenorhabditis+elegans+embryos+exposed+to+brief,+intermediate+and+long-term+anoxia+to+analyze+anoxia-induced+cell+cycle+arrest.">Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest.</a> BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).</li><li>Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anoxia. , (2012).</li><li>Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPP-16/Nup50+function+and+CDK-1+inactivation+are+associated+with+anoxia-induced+prophase+arrest+in+Caenorhabditis+elegans.">NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).</li><li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+animation+in+C.+elegans+requires+the+spindle+checkpoint.">Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li><li>Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+and+making+of+the+nuclear+envelope.">Breaking and making of the nuclear envelope.</a> J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).</li><li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans.">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li><li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+are+protected+from+lethal+hypoxia+by+an+embryonic+diapause.">C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause.</a> Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מחסור בחמצן ואנימצית מושעה למרות חשיפה למחסור בחמצן חמור יכולה להיות קטלנית לאורגניזמים מסוימים, כמה אורגניזמים מסוגלים לשרוד חשיפה לחמצן בדם. במקרה של ג elegans, הישרדות חשיפת אנוקסיה תלויה על במה ותגובה לאנוקסיה התפתחותית היא...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים / ציוד </td><td></td><td></td><td> הרכב </td></tr><tr><td> פתרון hypochlorite </td><td></td><td></td><td> 0.7 גרם KOH, המ&quot;ל NaOCl 12 5%, מביא ל50 מ&quot;ל עם DDH 2 0 </td></tr><tr><td> M9 חיץ </td><td></td><td></td><td> 3 גרם KH 2 PO 4, 11 גרם Na 2 4 HPO, 5 גרם NaCl, 1 המ&quot;ל (1 M) 4 MgSO לL DDH 2 O 1 </td></tr><tr><td> שקופיות מיקרוסקופ זכוכית </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 12-550-343 </td><td> 3 מ&quot;מ &quot;x1&quot; x1.0 </td></tr><tr><td> סיבוב המייקר coverglass </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 72223-01 </td><td> קוטר 25 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> שמן Halocarbon 700 </td><td> סיגמא </td><td> H8898-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> חומר מרדים </td><td></td><td></td><td> 0.5% tricAine, tetramisole 0.05% </td></tr><tr><td> ליידן הסגורה זלוף Microincubator </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 650041 </td><td></td></tr><tr><td> חנקן UHP </td><td> Calgaz (Liquide אוויר) </td><td></td><td> &gt; 99.9990% N 2 &lt;2 O 2 עמודים לדקה </td></tr><tr><td> צינורות פלסטיק </td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> .062 &quot;מזהה x 0.125&quot; OD </td></tr><tr><td> ספינינג confocal מיקרוסקופ דיסק </td><td> מערכות McBain </td><td></td><td> Zeiss התהפך מיקרוסקופ מערכת אופטית, epifluorescence תאורה, סורק CSU-10 Yokogawa confocal, מצלמת CCD מכפיל אלקטרוני Hamamatsu. </td></tr></tbody></table>

use of time lapse microscopy to visualize anoxia-induced suspended animation in c. elegans embryos

elegans Caenorhabdits כבר נעשה שימוש נרחב בחקר עמידות למצבי עקה, שהקלה על ידי השקיפות של השלבים הבוגרים ועובר, כמו גם על ידי הזמינות של מוטציות גנטיות וזנים מהונדסים המבטאים את מספר עצום של חלבוני היתוך 1-4. בנוסף, תהליכים דינמיים כגון חלוקת תא ניתן לצפות באמצעות חלבונים שכותרתו fluorescently כתב. המחקר של מיטוזה ניתן מתאפשר באמצעות השימוש בניסויי זמן לשגות במערכות שונות, כוללים אורגניזמים שלמים, ולכן מוקדם ג עובר elegans גם מתאים למחקר זה. מוצג כאן היא טכניקה שבאמצעותה בתחום הדמית vivo של מבנים תת סלולריים בתגובה לanoxic (99.999% N 2; &lt;2 עמודים לדקת פלט 2) לחץ אפשרי באמצעות זרימת גז פשוט ועד התקנה במיקרוסקופ רב עצמה. קאמרי microincubation משמש יחד עם זרימת חנקן וגז באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובבכדי ליצור סביבה מבוקרת שבה ניתן הדמית בעלי חיים בחי. שימוש GFP מתויג-טובולין גמא והיסטון, הדינמיקה ומעצרו של חלוקת תא ניתן לנטר לפני, במהלך ולאחר החשיפה לסביבת חמצן מקופח-. התוצאות של טכניקה זו הן ברזולוציה גבוה, קטעי וידאו ותמונות מפורטים של מבנים תאיים בתוך לסטומרים של עוברים שנחשפו למחסור בחמצן.

עוברי ג elegans החשופים למחסור בחמצן קשה (אנוקסיה) מסוגלים לשרוד במעצר תהליכים ביולוגיים הכולל פיתוח וחלוקת תא 7. מעצר אנוקסיה המושרית של חלוקת תא יכול להיות במעקב, ברמת משנה הסלולר, באמצעות תא microincubation בשיתוף עם זרימת חנקן וגז באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתו?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos at JoVE.com

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

תאר כאן<em&gt; In vivo</em&gt; טכניקה למבני תמונת משנה הסלולר בבעלי חיים שנחשפו לחוסר חמצן באמצעות זרימת גז דרך חדר microincubation בשיתוף עם מיקרוסקופ confocal דיסקה מסתובב. שיטה זו היא פשוטה וגמישה מספיק כדי להתאים למגוון רחב של פרמטרים ניסיוניים ומערכות מודל.

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

use-time-lapse-microscopy-to-visualize-anoxia-induced-suspended

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

11.5K Views.  University of North Texas. תאר כאן In vivo טכניקה למבני תמונת משנה הסלולר בבעלי חיים שנחשפו לחוסר חמצן באמצעות זרימת גז דרך חדר microincubation בשיתוף עם מיקרוסקופ confocal דיסקה מסתובב. שיטה זו היא פשוטה וגמישה מספיק כדי להתאים למגוון רחב של פרמטרים ניסיוניים ומערכות מודל.

Video: Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...