우리는 입력 및 빠 디야 연구소 회원의 의견을 우리의 감사를 전달하고 싶습니다. 이 작품에서 선충류의 긴장은 연구 자원에 대한 NIH 국립 센터 (NCRR)의 지원을 받고 있습니다 Caenorhabditis 유전학 센터에 의해 제공되었다. 우리는 공 촛점 현미경과 기술 지원을 위해 박사 론 턴벌을 인정하고 감사합니다. 이 작품은 PAP에 대한 국립 과학 재단 (NSF-IOS, 직업)에서 교부금에 의해 지원되었습니다

1. 샘플 준비 <ol><li> 해당 유전자 변형 C.를 생성하거나 획득 elegans는 유전자 변형 방법을 사용하여 관심이나 Caenorhabditis 유전학 증권 센터 (CGC) 또는 동료의 변형. 세포 분열에 대한 마커로 염색체와 중심체를 시각적으로 5,이 경우에서 우리는 (파이-1 :: GFP :: H2B 파이-1 :: tbg-1 :: GFP) 부담 TH32를 사용하고 있습니다. </li><li> 세 가지 방법 중 하나를 사용하여 동기화 된 인구를 생성 : 1) 차아 염소산염 솔루션의 gravid 성인 분해 및 시드 판에 gravid 성인을 선택하고 1-2 시간에 배아를 덮어두고 나머지 배아에게 6 2)를 사용하거나, 3) L4를 선택 새로운 시드 판에 혼합 인구 이동의 애벌레. </li><li> 20 nematodes를 성장 ° C L1의 유충 또는 24 시간 후 L4의 털을 갈다에서 부화에서 72 시간을 약 96 시간를 취할 것입니다 gravid 젊은 성인에. 자궁에서 태아 (2-20 셀) imag에 대한 최적의 크고 blastomeres와 핵을 포함ING 하위 세포와 하위 핵 변화, 각각. 이 방법론은 초기 배아의 풍부한 숫자를 포함 젊은 성인의 인구를 생성 할 수있는 방법을 제공합니다. </li></ol> 2. 슬라이드 준비 및 산소 결핍 상공 회의소는 설정 <ol><li> 충분한 크기의 뚜껑으로 덮여 큰 페트리 접시 또는 빈 내부에 습기가 종이 타월을 배치하여 준비된 슬라이드를 개최 할 수있는 습윤 챔버를 확인합니다. </li><li> 전자 레인지 나 물 목욕을 통해 유리의 혼합물을 가열하여 deionized H 2 O에서 용융 2퍼센트 아가로 오스를 준비합니다. </li><li> 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 따뜻한 아가로 오스 1-3 방울을 넣으십시오. 바로 아가로 오스 드롭 (들)의 상단에 수직 반전 두 번째 슬라이드를 배치, 결과 패드가 얇고 기포 무료로 될 것이라고 약간 있도록 키를 누릅니다. </li><li> 시원하고 천천히 슬라이드 중 하나에 아가로 오스 패드를 그대로두고 두 현미경 슬라이드를 갈라 놓을로 시간을 허용합니다. 이 아가로 오스 패드 interfe하지 할 수있을만큼 얇고을 보장하는 것이 중요합니다나중에 현미경 초점을 맞출 수있는 능력을 다시. 샘플을 시각화하는 능력은 현미경 사이에 다를 수 있습니다 사용 목적의 특정 광학 거리,에 따라 달라집니다. </li><li> 작은 광장으로 아가로 오스 패드를 형성하기 위해 깨끗한 면도날을 사용합니다. 사용할 준비가 될 때까지 준비한 습기 챔버에 저장합니다. </li><li> 주의 깊게 같은 깨끗한 면도날 사용하여 아가로 오스 패드의 가장자리를 타고 원형 25mm 마이크로 coverglass로 슬라이드에서 전송, 패드 아래에 기포의 축적을 피하고. 사용하도록 선택 둥근 coverglass은 microincubator에 적절하게 맞출 수 있습니다. </li><li> 마취 용으로 사용 아가로 오스 패드로 마취 (0.5 % tricaine, M9 버퍼에 0.05 % tetramisole)의 방울을 추가합니다. 마취의 드롭에 5-10 웜 및 장소를 선택합니다. 운동을 중단 할 수 웜에 대해 1-3 분 소요됩니다. </li><li> , 성인 자궁 내에서 태아를 관찰하는 대신 해부하는 배아의에 대한 근거는 배아 desicca의 가능성을 최소화하는 것입니다기 및 배아에서 질소 가스의 흐름에 따라 이동. </li><li> 즉시 가스 챔버를 통해 흘러되기 때문에 탈수에서 웜을 방지하기 위해 웜의 상단에 할로 카본 오일 한 방울을 추가합니다. 할로 카본 오일은 점성 때문에 하나는 웜에 오일 앤 드롭를 수집하는 선택 웜의 pipet 팁 또는 팁을 사용할 수 있습니다. </li><li> 웜을 포함하는 원형 coverglass가 준비되면, 라이덴의 두 절반은 microincubator이 분리되어 재관류를 폐쇄하고, coverglass는 조심스럽게 아래쪽 링에 수직으로 배치합니다. 챔버의 양면 그런 다음 긴밀하게 함께 종료되었습니다. </li><li> 챔버 그런 다음 유연한 플라스틱 튜브를 통해 질소 가스 탱크에 연결 현미경 단계 (그림 1C)에서 원하는 지점에 위치합니다. 이 때 튜브와 microincubator는 조심스럽게 튜브와 챔버의 측면을 따라 포트 플러그의 안전한 첨부 파일을 확보하여 누수를 확인한다. 하나는 알 수그렇게 쉽게 누설가있는 경우 형성 거품,을 찾을 수있는 튜브 위에 비누 물을 소량의 확산. </li></ol> 3. 산소 결핍에 현미경 <ol><li> 낮은 배율에서 동물을 찾은 다음, 이미지 조직 또는 성인 배아 blastomeres 또는 oocytes과 같은 관심 셀에 적절한 높은 배율 (이 응용 프로그램에 대한 64x)로 이동합니다. GFP 신호를 확인하고 관심있는 셀 (들)에 GFP 융합 단백질을 찾습니다 488 nm의 레이저를 사용합니다. </li><li> 세포주기 체포의 특정 단계에서 체포을 시각화하기 위해 (예를 들면 말 prophase) 세포 분열의 이전 단계 (예 : 말 계면 또는 초기 prophase)에 blastomere를 확인합니다. 이러한 centriole 위치, 염색체 응축의 개시, 염색체 위치와 핵 봉투의 유무 등의 세포 마커는 세포주기 단계 (그림 2A)을 확인하는 데 도움이됩니다. </li><li> 챔버 그런 다음 질소 가스 (99.999 %로 perfused 수 있습니다N 2, &lt;2 ppm으로 O 2). 우리는 6 psi의 압력을 사용하여이 경우에, 그러나 압력은 조정 각 microincubator의 크기와 사용 튜브의 직경에 따라 최적화해야 할 수 있습니다. 질소는 필요에 따라 초점 평면을 조정, 방을 가득로 blastomere (들)을 모니터링하고 있습니다. </li><li> 이 시점에서, 시간 경과 영상이 시작되었습니다. 영상은 내부 핵 막에 염색체의 경우 prophase의 체포와 도킹에 관심 현상을 캡처 할 수있는 한 필요에 따라에 진행됩니다. 이미지는 30 분 이상 더 이상마다 10 초에 한 번 촬영​​하고 있습니다. 이미지 캡처 및 이득과 레이저 전원과 같은 설정 주파수는 필요에 따라 조정해야합니다. </li><li> 배아는 anoxic 환경에 대응하는 시간은 산소 결핍에 노출시 세포주기 단계에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 산소 결핍 유도 prophase의 체포는 질소 가스의 흐름을 시작으로 20-30 분 이내에 발생합니다. 우리는 산소 결핍 유발 세포주기 체포 occu을 관찰 한&lt;20 분에 rring. 이미지는이 기간 동안 얻을 수 또는 특정 이미지는 나중에 시간이 경과 시리즈에서 격리 할 수​​ 있습니다. 추가 옵션은 배아에서 하위 세포 구조를 시각화하는 비디오 현미경을 사용하는 것입니다. </li><li> 산소 결핍 유도 체포 상태에서 복구를 문서화하려면, 가스는 꺼져 있고 챔버는 시간 경과 시리즈를 녹음하면서 확산에 의해 normoxia로 돌아갑니다 허용됩니다. 염색체의 세포주기의 진행과 undocking의 재개는 일반적으로 질소 가스를 사용하지 않도록 설정의 5-20 분 이내에 발생합니다. </li><li> 별도의 실험에서 산소 결핍 표시기, resazurin가 흐름을 통해 microchamber에 배치 된 있습니다, 그것은 질소 가스의 흐름이 시작 후 챔버은 약 19 분의 평균 anoxic 될 것으로 판단되었다. </li><li> 이미지와 동영상은 Imaris, 이미지 J 또는 포토샵을 사용하여 처리 및 표시를 위해 퀵타임으로 가져옵니다. </li></ol>

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	<li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans.">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li><li>Padilla, P. A., Ladage, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+animation,+diapause+and+quiescence:+Arresting+the+cell+cycle+in+C.+elegans.">Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer.">Dauer.</a> WormBook. , 1-19 (2007).</li><li>Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+and+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Longevity and stress in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).</li><li>Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+cytoplasmic+dynein+heavy+chain+in+Caenorhabditis+elegans+with+fast-acting+temperature-sensitive+mutations.">Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).</li><li>Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sub-nuclear+changes+in+Caenorhabditis+elegans+embryos+exposed+to+brief,+intermediate+and+long-term+anoxia+to+analyze+anoxia-induced+cell+cycle+arrest.">Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest.</a> BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).</li><li>Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anoxia. , (2012).</li><li>Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPP-16/Nup50+function+and+CDK-1+inactivation+are+associated+with+anoxia-induced+prophase+arrest+in+Caenorhabditis+elegans.">NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).</li><li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+animation+in+C.+elegans+requires+the+spindle+checkpoint.">Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li><li>Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+and+making+of+the+nuclear+envelope.">Breaking and making of the nuclear envelope.</a> J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).</li><li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans.">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li><li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+are+protected+from+lethal+hypoxia+by+an+embryonic+diapause.">C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause.</a> Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

산소가 결핍되어서 및 일시 중지 애니메이션 심각한 산소가 결핍되어서에 노출 어떤 생물에 치명적일 수 있지만, 일부 생물은 산소 결핍에 노출 생존 할 수 있습니다. C.의 경우 elegans는 산소 결핍 노출의 생존은 발달 단계 및 산소 결핍에 대한 응답에 따라 달라집니다 항목은 관찰 할 수있는 생물학적 과정의 번호가 체포되는 정지 애니메이션의 치료 상태로 있습?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비 </td><td></td><td></td><td> 구성 </td></tr><tr><td> 차아 염소산염 솔루션 </td><td></td><td></td><td> 0.7 g 코, 12 ML 5 % NaOCl은 ddH 2 0과 50 ML에 가져 </td></tr><tr><td> M9 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 3g KH 2 PO 4, 11g 오세영 2 HPO 4, 5g NaCl, 1 L ddH 2 O 당 1 ML (1 M) MgSO 4 </td></tr><tr><td> 유리 현미경 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-550-343 </td><td> 3 &quot;개&quot;x1.0의 mm </td></tr><tr><td> 라운드 마이크로 coverglass </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 72223-01 </td><td> 25mm의 직경 </td></tr><tr><td> 할로 카본 오일 700 </td><td> 시그마 </td><td> H8898-100ml </td><td></td></tr><tr><td> 마취제 </td><td></td><td></td><td> 0.5 % tricaine, 0.05 % tetramisole </td></tr><tr><td> 라이덴 휴일 재관류 Microincubator </td><td> 하버드 장치 </td><td> 650041 </td><td></td></tr><tr><td> UHP 질소 </td><td> Calgaz (에어 Liquide) </td><td></td><td> &gt; 99.9990 % N 2 &lt;2 ppm으로 O 2 </td></tr><tr><td> 플라스틱 튜브 </td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> 0.062 &quot;ID X 0.125&quot;OD </td></tr><tr><td> 디스크 공 촛점 현미경을 스피닝 </td><td> McBain 시스템 </td><td></td><td> Zeiss 광학 현미경, epifluorescence 조명 시스템, CSU-10 요코 공 촛점 스캐너, 하마 마츠 전자 배율 CCD 카메라를 거꾸로. </td></tr></tbody></table>

use of time lapse microscopy to visualize anoxia-induced suspended animation in c. elegans embryos

Caenorhabdits elegans는 성인과 배아 단계의 투명성에 의해뿐만 아니라 융합 단백질 1-4의 무수한을 표현 유전자 돌연변이 유전자 변형 종자의 가용성에 의해 촉진되어 스트레스 저항의 연구에서 널리 사용되었습니다. 또한, 이러한 세포 분열과 같은 동적 프로세스는 휘황 표시 기자 단백질을 사용하여 볼 수 있습니다. 유사 분열의 연구가 손상 생물 등 다양한 시스템에서 시간 경과 실험의 사용을 통해 촉진 될 수있다; 따라서 초기 C. elegans의 배아가 잘 본 연구에 적합합니다. 고성능 현미경에 설치를 통해 간단한 가스의 흐름을 이용하여 스트레스가 가능합니다, 여기에 제시된 것은 anoxic에 대한 응답 (&lt;2 ppm으로 O 2 99.999 % N 2) 하위 세포 구조를 생체 이미징에있는이 기술입니다. microincubation 챔버는을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 사용됩니다동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들 수 있습니다. 사용 GFP를 태그 감마 tubulin과 히스톤은 역학과 세포 분열의 체포는 동안과 산소 박탈 환경에 노출 후, 전에 모니터 할 수 있습니다. 이 기법의 결과는 산소가 결핍되어서에 노출 배아의 blastomeres에서 높은 해상도, 자세한 동영상 및 세포 구조의 이미지입니다.

심각한 산소가 결핍되어서 (산소 결핍)에 노출 C. elegans의 배아는 개발 및 세포 분열 7 등의 생물학적 과정을 체포하여 생존 할 수 있습니다. 세포 분열의 산소 결핍 유발 체포 동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 microincubation 챔버를 사용하여, 하위 세포 수준에서 모니터 할 수 (그림 1). ?...

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Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

는 여기에 설명<em&gt; 생체 내</em회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 microincubation 챔버를 통해 가스의 흐름을 이용하여 산소 결핍에 노출 동물의 이미지를 하위 세포 구조에&gt; 기술. 이 방법은 간단하고 실험 매개 변수 및 모델 시스템의 다양한 맞게 할 수있을만큼 유연하다.

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em&gt; C. elegans</em&gt; 태아

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

11.5K 조회수.  University of North Texas. 는 여기에 설명 생체 내 기술. 이 방법은 간단하고 실험 매개 변수 및 모델 시스템의 다양한 맞게 할 수있을만큼 유연하다.

비디오: Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

연구

생물학

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해<em&gt; C. 엘레</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...