This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. السلالات، والثقافة، والمجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعامل معها والحفاظ على سلالات C. ايليجانس كما هو موضح سابقا (19). تتوفر من مركز علم الوراثة انواع معينة (CGC) السلالات. ملاحظة: السلالات المستخدمة في هذه التجارب كانت CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ، Pmyo-3 :: Mtgfp) الأول؛ له 8 (e1489 IV)) مع GFP البروتينات الانصهار محلية إلى الميتوكوندريا ونوى. PJ727 (jls01 (ميو-3 :: GFP، رول-6 (su1006))؛ UNC-54 :: lacZ V) مع البروتينات GFP الانصهار مترجمة إلى جهاز مقلص وPD55 (ccIs55 (سوب-7 (ST5)؛ unc- 54 :: lacZ) V) مع β غالاكتوزيداز البروتينات الانصهار مترجمة إلى العصارة الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجارب رني كاملة كما هو موضح سابقا في تجارب الأجيال رني 13 والحصول على البكتيريا رني من تسلسل التحقق منها مكتبة ORF-رني شيدت من قبل مارك فيدال وآخرون 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء سلالات تحتوي على &lt;<html> م&gt; غرف التجارة والصناعة 4251، jls01 أو CCIS 55 باستخدام التقنيات القياسية 20. استخدام هذه الجينات المحورة لخلق سلالة لتقييم هيكل الشبكة الميتوكوندريا، منظمة الميوسين أو حالة استتباب بروتيني، على التوالي. عبور سلالات متحولة إلى حيث تبحث في واحدة من هذه المقصورات شبه الخلوية هو المطلوب في كل حيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مثبطات PtdIns-3-كيناز، LY-294002 (LY) كما هو موضح سابقا 21. لفترة وجيزة، إضافة LY-294002 في تركيز النهائي من 160 ميكرومتر على رأس-OP50 المصنف الجافة لوحات NGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط كافة الصور باستخدام فلتر GFP لاجراء تجارب على أساس GFP والمجهر مع فلتر ثلاثي تمرير الذي يسمح التصوير من القنوات الأحمر والأخضر والأزرق في وقت واحد لتقييم المجراة غشاء المحتملة مع C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O، عادة تسويقه باعتباره MitoTracker الأحمر CMXRos. إجراء تحليل الصور وإعداد الرقم في برامج معالجة الصور. </li></ol>S = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. تزامن L1 اليرقية الحيوانات عن طريق الجاذبية التعويم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما لا يقل عن 1 يوم قبل الحاجة، وجعل M9 عازلة - 22.04 ملي KH 2 PO 4، 42.27 ملي نا 2 هبو 4، 85.56 ملي مول كلوريد الصوديوم (تركيزات النهائي)، وتعقيم بواسطة التعقيم. مرة واحدة يتم تبريده الى 45 درجة مئوية، إضافة عقيمة MgSO 4 الى 1 ملي بعد التعقيم لمنع هطول الأمطار 22. السماح للM9 لتبرد في 4 درجات مئوية، وقسامة إلى 50 مل أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من التجربة، إضافة 3 مل M9 عازلة لواحدة 9 سم مع لوحة أرقام عالية من L1 اليرقات. غسل لوحة مرارا بواسطة الشفط السائل M9 وpipetting لضد سطح أجار مع لوحة عقدت في زاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل وL1 من لوحة ومن ثم نقل M9 إلى 10 مل أنبوب اختبار باستخدام ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يترك لمدة 2.5 دقيقة للسماح لأكبر الكبار والحيوانات لاحقة مرحلة اليرقات ليسقط إلى أسفل أنبوب الاختبار وتبقى الحيوانات L1 أصغر قرب رالمرجع المخزن المؤقت M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أكبر 500 ميكرولتر من M9 في أنبوب الاختبار باستخدام ماصة. ثم ماصة M9 تحتوي على L1 اليرقات إلى لوحة NGM المصنفة جديدة مع 500 ميكرولتر OP50 تحت نطاق تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عادة، تهدف إلى نقل ~ 200-300 L1 اليرقات لكل لوحة. مراقبة لوحات يوميا من سن البلوغ، وإذا لزم الأمر، واختيار الحيوانات على لوحات OP50 NGM جديدة لمنع مصدر الغذاء OP50 يجري استهلاكها. ملاحظة: هذا هو عادة 1-3 قطرات من M9 باستخدام ماصة P1000، على الرغم من أن هذا يختلف إلى حد كبير اعتمادا على عدد من L1 على لوحة أصلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وإذا رغبت الدراسات المستقبلية في الحيوانات الفردية، مرة واحدة تصل إلى مرحلة البلوغ الحيوانات، واختيار الحيوانات الفردية لفصل وحات NGM المصنفة. الحيوانات نقل كل 24-48 ساعة لفصل اليرقات من الحيوانات. </li></ol> 3. حركة فحوصات 19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما لا يقل عن 2 ساعة قبل بدء التجريب، وإزالة قسامة 50 مل من M9 والسماح لتتوازن إلى درجة حرارة الغرفةerature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار حيوان بالغ واحد إلى 50 ميكرولتر M9 عازلة على شريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد عدد من الانحناءات الجسم اليسرى واليمين في 10 ثانية، حيث ينحني نحو اليسار واليمين واحد واحد يساوي بضربة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر عدد من السكتات الدماغية لإعطاء الجسم ما مجموعه 5 على الأقل من القياسات التي في المتوسط ​​يمكن اتخاذها. تتضاعف هذه الأرقام من خلال ستة لإعطاء معدل حركة لكل دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، ونقل الحيوانات إلى طبق بتري. هذه الطريقة يمكن قياس الزمني للحركة على مدار العمر كله في C. elegan S. </li></ol><img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1: فحوصات الحركة. مرة واحدة يتم انتقاؤها الديدان في المخزن، تتم إضافة نحو اليسار واحد (A) واحد اليمين (ب) منحنى معا لتعطي حركة واحدة كاملة(السكتة الدماغية). 4. التصوير من شبكات الميتوكوندريا وSarcomeres في جدار الجسم العضلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: ينطبق هذا البروتوكول نفسه لتصوير كل من الميتوكوندريا وsarcomeres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزامنة الديدان كما هو موضح سابقا (القسم 1) وتنمو ل48-60 ساعة عند 20 درجة مئوية عندما تصل إلى مرحلة البلوغ والشباب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 20 الديدان (ممثل من لوحة) من لوحات في 20 ميكرولتر M9 على شريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق زلة تغطية، والشروع في الصورة باستخدام مجهر فلوري تحت مرشح GFP (460-500 نانومتر والأزرق ضوء الإثارة) في 40X التكبير. </li></ol> 5. تقييم غشاء المحتملة باستخدام تراكم في فيفو الفحص مع MitoTracker الأحمر CMXRos (C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزامنة CB5600 (القسم 1)، وجميع المسمى مع GFP في الميتوكوندريا من عضلات، وتنمو إلى مرحلة البلوغ في وقت مبكر على NGM تحتوي على OP50 ل48-60 ساعة عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر DMSO إلى قسامة 50 ميكروغرام من C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O لجعل محلول المخزون من 940.692 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 اتخاذ ميكرولتر من محلول المخزون 940.692 ميكرومتر و resuspend في 199 ميكرولتر M9 لخلق حل العاملة من 4.70 ميكرومتر (4.70346 ميكرومتر). إعداد هذه البنية في 1.5 مل أنابيب لC 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O هو حساس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 20 مكل من 4.70 ميكرومتر الحل (20 الديدان البالغة في 20 ميكرولتر قسامة) العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 20 حيوان بالغ إلى 20 ميكرولتر من 4.70 ميكرومتر C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O في البني 1.5 مل أنابيب. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة 1 ساعة، إضافة 1 مل M9 إلى البني 1.5 مل أنابيب تحتوي على الديدان، وأجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 ثانية ثم قم بإزالة طاف. كرر هذه الخطوة يغسل قبل إعادة التعليق بيليه دودة ونقل 20 μ المتبقيةل (التي تحتوي على الديدان) إلى شريحة للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور من الميتوكوندريا مع 40X التكبير باستخدام فلتر ثلاثي النجاح الذي يسمح التصور من كل من القنوات الأحمر والأزرق والأخضر في وقت واحد. التصوير باستخدام الفلتر الثلاثي تمريرة يظهر المشارك توطين C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O مع GFP محلية إلى الميتوكوندريا الظهور كما البرتقال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد أخذت صورة من الميتوكوندريا البرتقال والصور والتبييض الحيوان لمدة 10 ثانية باستخدام ضوء طول موجي 540/25 نانومتر على ضبط الحد الأقصى مع جميع المرشحات إزالتها. وهذا تبييض الأحمر داخل الميتوكوندريا وكشف GFP الميتوكوندريا وحدها لتأكيد colocalization في الميتوكوندريا العضلات. </li></ol> 6. تقييم من تدهور البروتين في العضلات C. ايليجانس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزامنة PD55s (أو أي سلالة تحتوي على التحوير lacZ) على لوحات NGM المصنف مع OP50 (القسم 1). تنمو إلى مرحلة الشباب ل48-60 ساعة عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 20 الديدان البالغة في 20 ميكرولتر DDH 2 O على شريحة المجهر. كن حذرا في محاولة لالتقاط الدودة فقط وليس أي بكتيريا مع الاختيار. تسمية شريحة المجهر في قلم رصاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع في المجفف لمدة 30 دقيقة حتى يجف والكراك بشرة من الحيوانات. ضمان ختم مشددة على استخدام مجفف الشحوم حول الختم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من جفاف كانت فعالة تحت نطاق تشريح (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غمر الشريحة المجهر في الأسيتون المثلج لمدة 3.5 دقيقة ثم تترك الشريحة المجهر على منشفة ورقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح للالأسيتون على الشريحة لتتبخر. في هذه المرحلة ذوبان الجليد في X-غال والأكسدة العازلة والسماح توازنه لدرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر X-غال إلى 100 ميكرولتر عازلة الأكسدة ودوامة بلطف لضمان هذا هو متجانس. هذا هو X-غال / الأكسدة مزيج الرئيسي العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من X-غال / الأكسدة مزيج الرئيسي عازلة لكل سمنطقة riginal من 20 الديدان. تفتيش تحت نطاق تشريح لضمان مزيج الرئيسي يغطي تماما جميع الحيوانات تماما. إمالة بلطف الشريحة المجهر لنقل مزيج الرئيسي على المناطق التي لا تغطيها الحيوانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع شريحة المجهر في غرفة الرطوبة ل1-2،5 ساعة عند 20 درجة مئوية. الحيوانات صورة عند اللون الأزرق الغامق موجود في عضلات جدار الجسم من الحيوانات السيطرة. تقييم حيوانات السيطرة تحت نطاق تشريح كل 15 دقيقة لتحديد متى يجب تصوير الحيوانات. </li></ol><img alt="الرقم 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600" /> الشكل 2: تقييم تدهور البروتين في العضلات باستخدام فحوصات β غالاكتوزيداز. يتم انتقاؤها (A) الحيوانات تحتوي على التحوير lacZ من أطباق بتري ل20 ميكرولتر DDH 2 O على شريحة المجهر (B). الحيوانات المجفف وتصبح كسور <sترونج&gt; (C). ثم يتم غسل الحيوانات في الأسيتون (D). مرة واحدة يتبخر الأسيتون يضاف X-غال / الأكسدة مزيج الرئيسي عازلة (E). ويتم تقييم تطور اللون الأزرق في الحيوانات المراقبة في 15 دقيقة فترات (فلوريدا) من ر = 0 دقيقة (F) حتى يتم الحصول على اللون الأزرق الداكن عبر طول الحيوانات (L). تؤخذ الصور من الديدان في 2.5X التكبير في AE و8X في فلوريدا. الأزيز في C، D، F، G، و L هي 4X التكبير الأصلي.

The authors have nothing to disclose.

العضلات هي الأنسجة المتعددة الوظائف، عن تقديره جيدا لدورها في الحركة ودعم وضع الجسم والتمثيل الغذائي. تطوير وصيانة العضلات صحية تتطلب تنسيق العمليات والمكونات الخلوية متعددة. إما من خلال الضرر أو المرض، يمكن أن تحدث التقلبات، مما أدى إلى تغير بنية العضلات و / أو وظيفة. الانخفاض المرتبط بالعمر في وظيفة العضلات يمثل عبئا كبيرا على ميزانيات الرعاية الصحية في العالم الغربي، لأن العضلات 1،2 وخاصة القوة العضلية والتحمل 3-5 ويرتبط سلبا مع فيات. قياس الجوانب المتعلقة تدهور وظيفة العضلات مثل وظيفة الميتوكوندريا تغييرها أو تعطيل قسيم عضلي، يمكن أن تسمح فهم أعمق للآليات التي تقوم عليها تنمية العضلات والصحة العامة. ايليجانس C aenorhabditis (C. ايليجانس) هو بيز الخيطية المجهريةر معروف لأنه كان أول متعددة الخلايا أن يكون الجينوم بأكمله التسلسل 6، الأولى لإسكات الجينات باستخدام رني 7، وmetazoan الوحيد الذي لديه كامل النسب خلية 8 و 9 التشريح العصبي تحديدها. C. ايليجانس من كان أول من اقترح كما وقد اعترف نموذجا للدراسة وراثية تحكم السلوك في عام 1974 من قبل سيدني برينر (10) وأهمية هذا العمل واللاحقة مع أول ثلاثة جوائز نوبل التي منحت لC. ايليجانس الباحثين. حوالي 35٪ من جيم ايليجانس وقد حددت الجينات orthologues في البشر، مع C. ايليجانس كونها كائن الرئيسية المستخدمة لفهم السيطرة الوراثية للتنمية العضلات 11. تقريبا كل الجينات في جينوم C. ايليجانس يمكن ترسيتها خلال رني 7،12. وبالتالي، من خلال هدمت الجينات في عضلة تطويره بالكامل، العناصر الوراثية التي تسهم في إعادةgulation الصحة العضلات يمكن التحقيق مع البساطة النسبية 13. القدرة مجتمعة لاستخدام رني، المسوخ، والمركبات الكيميائية تجعل C. ايليجانس نظام رئيس الوزراء لاستكشاف التنظيم الجيني 7،14،15 من بنية العضلات وظيفة مع التقدم في العمر 16 و 17 في نماذج المرض. ويمكن قياس تأثير ضربة قاضية الجينات، الطفرة، و / أو التعرض للمركبات الكيميائية على بنية العضلات و / أو وظيفة من خلال جوانب متعددة. نحن هنا وصف موجز تقنيات بسيطة لتقييم C. هيكل ايليجانس العضلات وظيفة، وكثير منها يمكن أن تستخدم في الدراسات المستقبلية للصحة العضلات. وقد مكن تطوير بروتين الفلورية الخضراء (GFP) 18 التصور كل محلة بروتينات محددة والهيكل العام للعضيات في C. ايليجانس. نحن هنا شرح كيفية أعرب GFP SPECIfically داخل الجسم الميتوكوندريا العضلات الجدار، نوى، أو sarcomeres يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان الضمور هذه الهياكل الفرعية الخلوية موجودا. كما هيكل ليس دائما بديل موثوق به لوظيفة، كيف نفسر أيضا استخدام الأصباغ الموجبة في الجسم الحي يسمح بتقييم ضعف إمكانات غشاء الميتوكوندريا داخل العضلات. عندما تستخدم الأصباغ في تركيبة مع GFP، فإنها تسمح دراسة الهندسة المعمارية وظيفة بطريقة الزمنية طوال العمر. وأخيرا، فإننا شرح أيضا كيف توازن البروتين داخل العضلات ويمكن تقييم وكيف أن كل هذه التدابير يمكن أن تستخدم لربط التغيرات في عضلة الصحة الحيوانية كلها عن طريق استخدام المقايسات الحركة. هذه التقنيات، جنبا إلى جنب مع ضربة قاضية الجينات، والطفرات، و / أو المركبات الكيميائية وتوفر ترسانة قوية لدراسة كيف يمكن للجينات أو مركبات معينة تؤثر على صحة العضلات في الجسم الحي. أوجه التشابه في الهيكل، والتمثيل الغذائي وظيفة جسيمة لعضلة بين C. ايليجانس والثدييات يعني C. ايليجانس هو كائن نموذجا بارزا لفهم تنظيم العضلة في الكائنات العليا، بما في ذلك البشر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:195px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:187px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O)</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td style="width:187px;">Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">67-63-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">KH2 PO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">7778-77-0</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:103px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">301584L</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgSO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7506</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Microscopy Slides</td>
			<td style="width:103px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">K220</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Microscopy Cover Slips</td>
			<td style="width:103px;">VW2 International</td>
			<td style="width:119px;">631-0124</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">1.5ml Eppendorph Tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB74031</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Dessicator</td>
			<td style="width:103px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">D2672</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">H600L</td>
			<td style="width:187px;">Nikon H600L microscope with proprietary software</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Camera</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">DS-Fi1</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:195px;">Zeiss Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Ax10</td>
			<td style="width:187px;">Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Plates 9cm</td>
			<td style="width:103px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">82-1473</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:195px;">Plates 6cm</td>
			<td rowspan="2" style="width:103px;">Gosselin</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">BP53-01</td>
			<td rowspan="2" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">Potassium Ferrocyanide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">14459-95-1&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgCl2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="61" rowspan="3" style="height:61px;width:195px;">Na3PO4</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7601-54-9</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="147" rowspan="3" style="height:147px;width:195px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7240-90-6&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">N,N8-dimethylformamide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">68-12-2&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans

العضلات هي الأنسجة الحيوية التي تستجيب للتغيرات في التغذية، وممارسة، ودولة المرض. فقدان كتلة العضلات ووظيفتها مع المرض والعمر والصحة العامة أعباء كبيرة. ونحن نفهم حاليا سوى القليل عن التنظيم الجيني للصحة العضلات مع المرض أو التقدم في السن. الديدان الخيطية C. ايليجانس هو نموذج أنشئت لفهم التنظيم الجينومي من العمليات البيولوجية من الفائدة. عضلات جدار الجسم هذه الدودة تعرض على درجة كبيرة من التماثل مع عضلات الأنواع metazoan أعلى. منذ C. ايليجانس هو كائن شفاف، وتوطين GFP إلى الميتوكوندريا وsarcomeres يسمح التصور من هذه الهياكل في الجسم الحي. وبالمثل، تغذية الحيوانات الأصباغ الموجبة، والتي تتراكم على أساس وجود إمكانات غشاء الميتوكوندريا، يسمح للتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي. هذه الأساليب، فضلا عن تقييم بروتين العضلات homeostaجهاز الأمن والمخابرات، وجنبا إلى جنب مع تقييم وظيفة عضلة الحيوان كله، في شكل المقايسات حركة، للسماح للارتباط العيوب شبه الخلوية مع الإجراءات الوظيفية للأداء العضلات. وبالتالي، توفر جيم ايليجانس منصة قوية التي لتقييم تأثير الطفرات، ضربة قاضية الجينات، و / أو المركبات الكيميائية على بنية العضلات وظيفة. وأخيرا، كما GFP، والأصباغ الموجبة، والمقايسات حركة يتم تقييم غير جراحية، ويمكن إجراء الدراسات المستقبلية من بنية العضلات وظيفة عبر مسار الحياة وهذا كله في الوقت الحاضر لا يمكن تحقيق بسهولة في الجسم الحي في أي كائن آخر.

حركة فحوصات لتحديد العيوب الحركة تراجع حركة هو مؤشر جيد للوفيات في C. ايليجانس 16، مع انخفاض معدلات مشيرا إلى مشاكل في الجهاز العصبي العضلي. تغييرات في الحركة، وفقا لتقييم المقايسات الحركة، يمكن أن تنجم عن رني ضد جين معين أو العلاج من تعاطي المخدرات (الأرقام 3-5) أو في الحيوانات الطافرة 13، 23. انخفاض في حركة يمكن أن تنجم عن تطوير المتغيرة على سبيل المثال التالية تدق التنموي أسفل الجينات نقل الإلكترون ترميز أنا معقدة، الثالث، الرابع أو الخامس 24. بالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار تدخلات محددة على الكبار فقط C. ايليجانس من أجل التحقيق في التأثير على فسيولوجيا ما بعد تنموي. على سبيل المثال، تعامل مع الحيوانات رني ضد UNC-112، والتي بترميز C. ايليجانس orthologue من Kindlin-1 والتي يتم ترجمتها إلى إنتغرين تحتوي علىالمجمعات التعلق العضلات (أرقام 3 و 4)، أو غاز-1، الذي يشفر أحد مكونات المجمع الأول من سلسلة نقل الإلكترون (الشكل 4)، وعرض تخفيض تدريجي في مقابل سيطرة حركة 48-72 ساعة بعد مرحلة البلوغ. قد يكون هذا مؤشرا على مشاكل مع فسيولوجيا العضلات. وبالمثل، وفقدان الحركة في الفترة من 24 - 72 ساعة لوحظ في الاستجابة للعلاج البالغين المتقدمة عادة مع العلاج مع مثبطات PI3K LY-294002 (الشكل 5). ومن الممكن أيضا لاختبار تأثير علاج ثانية رني، طفرة، أو دواء في استعادة الحركة في الحيوانات التي تظهر انخفاض الحركة ردا على هذا التدخل الأولي. على سبيل المثال، عرض unc- 112 المسوخ خفض كمي في الحركة مقارنة مع الحيوانات البرية النوع الذي الموهن في وجود طفرة ثانية في قاتمة-1 13. وبالتالي، يمكن تحديد كل من المقايسات حركة التدخلات التي تغير neuromuscuتطوير لار و / أو وظيفة، وكذلك تلك التي تعمل على تحسين و / أو استعادة وظيفة العصبية والعضلية. تقييم قسيم عضلي التعطيل وبعد تحديد وجود خلل الحركة، وغالبا ما يكون من المرغوب فيه لتحديد ما إذا كان سبب الخلل حركة يمكن تفسيرها من خلال مشاكل في الأعصاب والعضلات، أو كليهما. Sarcomeres هي مجمعات متعددة البروتين في العضلات التي تسمح للانكماش، وبالتالي إجبار جيل والحركة. من خلال الاستفادة من الحيوانات معربا عن الميوسين GFP البروتينات الانصهار مترجمة إلى جهاز مقلص، ومدى تعطل خيوط الميوسين وsarcomeres يمكن ملاحظة نسبيا غير جراحية ومستقبلي في الحيوانات الفردية من خلال تطوير و / أو مرحلة البلوغ. تعرض الحيوانات البرية من نوع sarcomeres المحتشدة التي تظهر خطوط خضراء متعددة كما مستقيمة متوازية في كل عضلات الجسم الجدار (الشكل 3). تعطيل لهذه المصفوفات العادية قد تكون طفيفة نسبيا معsarcomeres المحتشدة التي تظهر لدمج بدلا من البقاء في نفس الوقت. هذا النمط الظاهري، المرئي مع UNC-112 رني في ر = 24 ساعة أو 48 ساعة (الشكل 3)، يماثل خط Z-يتدفقون من مواقع الحجز الأكتين العضلات في الثدييات. وبالمثل، يمكن أن أجزاء صغيرة من صفائف تنهار أو أنها يمكن أن تختفي تماما مثل هذا العلاج مع UNC-112 رني في ر = 48 ساعة أو 72 ساعة = ​​ر (الشكل 3). وجود عيوب قسيم عضلي في عضلات الحيوانات التي تعرض لخلل الحركة (الشكل 3) غير كافية لتفسير خلل الحركة ولكن لا يستبعد بالضرورة وجود مشاكل أخرى مع العضلات، الأعصاب، و / أو الأنسجة الأخرى في الاستجابة للتدخل . تقييم الهيكل الميتوكوندريا الشبكة في وجود خلل الحركة من المرغوب فيه في بعض الأحيان إلى فحص العضلات عن غيرها من العيوب التي قد تسبب أو تساهم في الحركة ديfect. الميتوكوندريا توفر الجزء الأكبر من الطاقة الخلوية وتنخفض في حركة قد يكون نتيجة لانخفاض توفير ATP، مما يقلل من الطاقة المتاحة لتقلص العضلات. وبالتالي هيكل الميتوكوندريا ويمكن الاطلاع للشذوذ. فمن المهم عدم تخدير الحيوانات مع أزيد الصوديوم لأنها تفضي إلى تفتت الميتوكوندريا السريع. وقد يجمد الحيوانات في هذه التجارب من خلال الضغوط التي مورست من قبل انزلاق الغطاء. ضمن البرية من نوع C. ايليجانس هيئة العضلات الجدار، وترد الميتوكوندريا داخل شبكات منظمة (الشكل 4) وجود وظيفة الميتوكوندريا بمثابة شبكية 25. تعطل شبكة الميتوكوندريا كما يعرض تفتيت شبكة (الغاز-1 رني، الشكل 4B) 26. قد تصبح قاسية بما فيه الكفاية التشرذم الذي لا يشبه شبكات منظمة يبقى مثل العلاج مع UNC-112 رني (الشكل 4B و C) 13. كما واياضطرابات عشر في هيكل قسيم عضلي، وعيوب في بنية العضلات الميتوكوندريا في الحيوانات التي تعرض وجود خلل الحركة قد تكون كافية لتفسير خلل الحركة ولكن هذا لا ينفي بالضرورة وجود مشاكل أخرى مع العضلات، الأعصاب، و / أو الأنسجة الأخرى. على سبيل المثال، UNC-112 المسوخ 13 و العلاج مع UNC-112 رني (الشكلان 3 و 4) عرض كل من sarcomeres عطلت وتعطل البنية الميتوكوندريا. تقييم وظيفة الميتوكوندريا في فيفو تحدد إمكانات غشاء الميتوكوندريا قدرة الميتوكوندريا لخلق القوة الدافعة بروتون وتوليد ATP 27، وبالتالي فإن القدرة على تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الجسم الحي يشير إلى قدرة هذا الحيوان لإنتاج ATP. كما قد تعطل الهيكلية الميتوكوندريا أو قد لا يغير من القدرات الوظيفية الميتوكوندريا، قد يكون ديسيالقابلة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الحيوانات التي تظهر بنية المتقدرة المتغيرة. C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O يتراكم في الميتوكوندريا، من جميع أنواع الخلايا، حيث إمكانات غشاء موجودة والبقع الميتوكوندريا 28 (الشكل 4C). خصيصا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في العضلات، ويمكن للمرء استخدام C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O وGFP المسمى الميتوكوندريا العضلات لإظهار الآثار المترتبة على التدخل تحديدا على العضلات الميتوكوندريا (الشكل 4C). على سبيل المثال، فقدان غشاء الميتوكوندريا المحتملة بعد العلاج مع UNC-112 رني يمنع C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O من دخول المصفوفة. وبالتالي تظهر الميتوكوندريا القليل، إن وجدت تلطيخ الأحمر من الميتوكوندريا بالإضافة إلى وضع العلامات GFP من الميتوكوندريا (الشكل 4C). ويمكن أيضا الصورة تبيض استخدامها للتأكد من أن لاحظالميتوكوندريا هي بالتحديد تلك الموجودة في العضلات (الشكل 4C). تحديد سعة مخفضة لإنتاج ATP يكفي لتفسير عيب حركة احظ لكن لا يستبعد مشاكل أخرى داخل العضلات، الأعصاب، و / أو الأنسجة الأخرى. بغض النظر، كما يرتبط انخفاض قدرة إنتاج ATP مع الحالات المرضية في الإنسان 29 و 30 الشيخوخة، وتحديد هذا الخلل في استجابة لتدخل يوفر منصة للكشف عن المركبات و / أو العلاجات رني التي تعمل على تحسين القدرة الإنتاجية للاعبي التنس المحترفين وهذه قد ثم مزيد من الاستكشاف للإمكانيات العلاجية. تقييم تدهور البروتين في وجود خلل الحركة وsarcomeres العادية والميتوكوندريا من المستحسن أحيانا لفحص العضلات لغيرها من العيوب التي قد تسبب أو تساهم في خلل الحركة. القدرة على الحفاظ على التوازن البروتين هو توقيع ولاسوء الصحة، في حين أن الانخفاض في تخليق البروتين و / أو زيادة في تدهور البروتين هو نتيجة للتقدم في السن 31 والحالات المرضية المتعددة 32،33. ولذلك قد يكون من المستحسن دراسة عضلات الحيوانات مع وجود خلل الحركة لتغير البروتين التوازن. هذا يمكن إنجازه من خلال تقييم مستويات بروتينات العضلات عصاري خلوي. استخدام البروتينات المشفرة transgenically يسمح بتقييم استتباب بروتيني معين العضلات. على سبيل المثال، استخدام الحيوانات التي تحتوي على β غالاكتوزيداز، تنصهر لجزء من محطة N-الميوسين، الذي يتم تصنيعه تحت سيطرة المروج الميوسين ومحسن يسمح بتقييم العضلات عصاري خلوي محتوى البروتين 19. وجود بقع زرقاء في البرية من نوع البالغين يوضح وجود نشط β غالاكتوزيداز وغياب مرضية عصاري خلوي تدهور البروتين. خسارة من تلطيخ في الاستجابة للعلاج تشير تدهور البروتين مرضية يحدث (الشكل 5 </strong&gt;)، كما β غالاكتوزيداز مستقرة ل72-96 ساعة بعد سن البلوغ في البرية من نوع البالغين 13،14،19. على سبيل المثال، عرض الحيوانات غير المعالجة من النوع البري مكثفة وصمة عار الزرقاء 72 ساعة بعد مرحلة البلوغ، في حين تعرض LY-249002 معاملة الحيوانات عدم وجود وصمة عار (الشكل 5). كما هو الحال مع عيوب في هيكل قسيم عضلي وظيفة الميتوكوندريا، وجود مرضية تدهور البروتين في العضلات كافية لحساب لعيب حركة الملحوظ لكن لا يستبعد بالضرورة وجود مشاكل أخرى مع العضلات، الأعصاب، و / أو الأنسجة الأخرى. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig3highres.jpg" width="600" /> الرقم 3: (A) UNC-112 رني يؤدي إلى خلل كبير في حركة ر = 72 ساعة (ب) تقييم المحتشدة هيكل فرقة داخل عضلة جدار الجسم. في ثر، وهناك فرق في العضلات تظهر خطوط مستقيمة كما في مرحلة الشباب (ر = 0 ساعة) وتبقى موحدة إلى حد كبير حتى إلى ما بعد 72 ساعة من سن البلوغ (انظر وزن التكبير). UNC-112 رني يسبب sarcomeres لتفقد العمارة في مناطق صغيرة من العضلة (ر = 24 ساعة)، وانهار sarcomeres المفقودين (ر = 48 ساعة)، وتجميع (ر = 72 ساعة لوحة أعلى والتكبير) وفقدان الخطي من sarcomeres (ر = 72 ساعة لوحة أسفل والتكبير). تمثل الحانات نطاق 25 ميكرومتر والأزيز هي 2.5X. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig4highres.jpg" width="600" /> الشكل 4: (A) UNC-112 أو الغاز-1 رني يؤدي إلى خلل الحركة (ب) تقييم الهيكل الميتوكوندريا داخل عضلة جدار الجسم. الميتوكوندريا في العضلات تظهر الخطوط المستقيمة الشبكية كما في مرحلة الشباب (بالوزن). معاملة الحيوانات مع UNC-112 رني النتائج في mitochondrتفتت الاتحاد العالمي للتعليم كما لوحظ سابقا بين 24 ساعة و 72 ساعة من سن البلوغ (الأزيز والسهم) 13. وبالمثل، رني ضد الغاز -1 النتائج في تفتيت شبكات الميتوكوندريا كما لوحظ سابقا 26. هذه هي الحاضرة كما فجوات صغيرة في شبكة الميتوكوندريا في ر = 24 ساعة وتقدم إلى الفوضى على نطاق واسع في 72 ساعة (انظر تقريب والسهم). (ج) تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الجسم الحي. في الحيوانات التي تحتوي أيضا GFP محلية إلى الميتوكوندريا، C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O يتراكم في جدار الجسم الميتوكوندريا العضلات ويظهر تحت اللون البرتقالي مرشح الثلاثي تمريرة من مرحلة الشباب (ر = 0 ساعة) حتى 72 ساعة بعد مرحلة البلوغ. العلاج مع UNC-112 رني يؤدي إلى الفقدان التدريجي للغشاء المحتملة كما هو مبين في 72 ساعة حيث تظهر الميتوكوندريا المتبقية تراكم أقل من C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O مقابل بالوزن. photobleaching من 10 SEج استخدام التبييض 540/25 نانومتر ضوء أحمر من MitoTracker ويكشف عن GFP محلية إلى الميتوكوندريا العضلات (التبييض + صور). الحانات النطاق تمثل 25 ميكرومتر والأزيز في على 2.5X. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig5highres.jpg" width="600" /> الرقم 5: (أ) العلاج مع LY-294002 الحيوانات يؤدي الى خلل الحركة (ب) تقييم تدهور البروتين باستخدام مقايسة β غالاكتوزيداز. وتزرع سن متزامنة وزن L1 اليرقات لمرحلة الشباب عند 20 درجة مئوية (ر = 0 ساعة) قبل ان ينتقل الى NGM المصنف مع OP50 (التحكم بالوزن) أو NGM المصنف مع LY-294002 (PI3K العلاج المثبط) لمدة 24 ساعة عند 20 ° C . في A، ملطخة حوالي 20-30 حيوانات للنشاط β غالاكتوزيداز (الأزرق) في ر = 0 ساعة وبعد 24 ساعة، 48 ساعة و 72 ساعة.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans at JoVE.com

طرق لتقييم المقصورات التحت خلوية للعضلات في C. ايليجانس | الأحياء | فيديو

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

العضلات الهيكلية هي ضرورية للتنقل وتخزين البروتين الرئيسي هي الهيئات. ووصف القياسات الصحية العضلات داخل C. ايليجانس. ويتم تقييم التغيرات المحتملة في بنية العضلات وظيفة باستخدام GFP المحلية والأصباغ الموجبة.

طرق لتقييم التحت خلوية من المقصورات في العضلات<em&gt; C. ايليجانس</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

methods-to-assess-subcellular-compartments-of-muscle-in-c-elegans

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Human Biology

Musculoskeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

16.4K Views.  University of Nottingham.  العضلات الهيكلية هي ضرورية للتنقل وتخزين البروتين الرئيسي هي الهيئات. ووصف القياسات الصحية العضلات داخل C. ايليجانس. ويتم تقييم التغيرات المحتملة في بنية العضلات وظيفة باستخدام GFP المحلية والأصباغ الموجبة. 

Video: Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

خلق بيئات الغازية محددة لدراسة تأثير نقص الأكسجة في<em&gt; C. ايليجانس</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الأجنة

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

قياس القوة خلال تقلص العضلات لتقييم وظيفة في يرقات اسماك الزرد

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

تلوين الأجسام المضادة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; عن طريق &quot;تجميد تكسير&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

نموذج نقص الأكسجين المجاعة لنقص التروية / ضخه في<em&gt; C. ايليجانس</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...