نود أن نشكر جميع الماضي الجامعية كثيرة، طلاب الدراسات العليا وما بعد الدكتوراه الذين ساهموا وقتهم وجهدهم لدراسة تكون الألياف الكولاجين في مختبرنا. قدمت العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا باستمرار تمويل دراسات الكولاجين لدينا.

ملاحظة: المياه المستخدمة في بروتوكولات كل لها مقاومة&gt; 18 MΩ.cm. 1. ييفات الكولاجين الأصلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين 6 ميكرولتر من المياه، 20 ميكرولتر من 200 مم نا 2 HPO 4 تعديلها لدرجة الحموضة 7 مع حمض الهيدروكلوريك و 10 ميكرولتر من 400 ملم بوكل في أنبوب microfuge والمزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 ميكرولتر من مونومر الكولاجين (~ 3 ملغ / مل في حمض الهيدروكلوريك N 0.01) إلى أنبوب microfuge والمزيج. ينبغي أن تكون واضحة والحل عديم اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب يحتوي على microfuge خليط التفاعل في كتلة الحرارة التي تم قبل تحسنت إلى 37 ° C وترك لمدة 3 إلى 4 ساعات. في هذه المرحلة، ينبغي أن يكون الحل غائم قليلا، وتحتوي على الألياف الكولاجين الأصلي في المقام الأول. </li></ol> 2. ليفية الكولاجين تباعد طويل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze 1 مل من الكولاجين مونومر (~ 3 ملغ / مل في حمض الهيدروكلوريك N 0.01) باستخدام غشاء 12-14 كيلو دالتون ضد MWCO 400 مل من الماء، وتغيير المياه أربعة أضعاف خلال فترة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وcollag مدالويمكن تخزين EN مونومر عدم استخدام على الفور في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين 20 ميكرولتر من الماء، و 20 ميكرولتر من 3 بروتين سكري الحمضية α1 ملغ / مل في الماء و 20 ميكرولتر من مونومر الكولاجين مدال في أنبوب microfuge. ينبغي أن تكون واضحة والحل عديم اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الأنبوب الذي يحتوي على microfuge خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في هذه المرحلة، ينبغي أن يكون الحل غائما وتحتوي على الألياف الكولاجين FLS في الغالب. </li></ol> 3. قطعي الكولاجين تباعد طويل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين 67 ميكرولتر من المياه، و 60 ميكرولتر من 100 العازلة جليكاين، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 3،3 ملم على و 40 ميكرولتر من 10 ملغ / مل في الماء ATP في أنبوب microfuge والمزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 33 ميكرولتر من مونومر الكولاجين (~ 3 ملغ / مل في حمض الهيدروكلوريك N 0.01) إلى أنبوب microfuge والمزيج. ينبغي أن تكون واضحة والحل عديم اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الأنبوب الذي يحتوي على microfuge خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عند هذه النقطة، فإن الحل لا يزال يظهر واضحا، ولكن ينبغيتحتوي على الكولاجين SLS في الغالب. </li></ol> 4. AFM توصيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلتصق سطح قطعة من الميكا تعلق على الركيزة AFM من خلال تغطية سطح الميكا مع قطعة من شريط لاصق ثم تقشير بعيدا. تحقق من الشريط بعد ذلك لتأكيد أنه تم المشقوق طبقة كاملة من الميكا من أجل الحد من المخالفات على السطح وضمان أن تتم إزالة عينة من العمر إذا كان يتم إعادة استخدام الميكا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 20 ميكرولتر من الحل ليفية الكولاجين لالركيزة الميكا المشقوق حديثا. يترك لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف قبالة بلطف حل ليفية الكولاجين بالماء. فإنه من المستحسن عدم تطبيق مباشرة على المياه وسط الركيزة الميكا ولكن على حافة والسماح لها بالتدفق عبر العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجف السطح تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين. فإنه من المستحسن أن توجيه تيار على حافة وليس في مركز الركيزة الميكا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر الضوئي في التكبير × 200،ينبغي أن العينات الأصلية الكولاجين وFLS تظهر كتل من الألياف. سوف SLS الكولاجين لا تكون مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن ملاحظة خصائص فريدة من ثلاثة هياكل مختلفة من الكولاجين AFM. عموما، نحن ييفات الكولاجين الصورة الأصلية مع AFM في وضع الاتصال المتقطع باستخدام السيليكون تحقيقات AFM، في حين FLS والكولاجين SLS ييفات نحن عادة صورة مع AFM في وضع الاتصال باستخدام السيليكون نيتريد تحقيقات AFM. ونحن نفعل ذلك لأن من الوقت واعتبارات التكلفة. السيليكون تحقيقات AFM وعادة ما تكون أكثر حدة من نيتريد السيليكون تحقيقات AFM، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص للتصوير في أضيق النطاقات هيكل من الألياف الكولاجين الأصلية. ومع ذلك، السيليكون تحقيقات AFM هي أكثر عرضة للتلوث عن طريق عينات من الكولاجين نيتريد السيليكون تحقيقات AFM وتحتاج إلى استبدال كثير من الأحيان. ولذلك، فإننا نحتفظ استخدام السيليكون AFM تحقيقات في الغالب لييفات الكولاجين الأصلية التصوير حيث القرار هو أكبر الضرورة ونعمل في وضع الاتصال المتقطع لprolاونج من عمر جدوى. </li></ol> نوصي أولية 100 × 100 ميكرون 2 المسح الذي ينبغي أن تظهر على الأقل يبني الكولاجين قليلة. من التكبير، وهناك في لمسح أحجام 10 × 10 ميكرون 2 ثم 2 × 2 ميكرومتر 2 إلى مراقبة دورية النطاقات الكولاجين الأصلية وFLS، أو ملامح أدق من الكولاجين SLS. بل هو أيضا فكرة جيدة للتحقق من اثنين على الأقل من مناطق أخرى على عينة الكولاجين للتحقق من أن المسح الأولي تمثل.

<ol>
	<li>Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+at+a+glance.">Collagen at a glance.</a> J. Cell Sci. 120, 1955-1958 (2007).</li><li>Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+Collagen+Characterization+for+Bio+Studies.">Guide to Collagen Characterization for Bio Studies.</a> J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).</li><li>Baselt, D. R., Revel, J. -. P., Baldeschwieler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfibrillar+Structure+of+Type+I+Collagen+Observed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Subfibrillar Structure of Type I Collagen Observed by Atomic Force Microscopy.</a> Biophys. J. 65, 2644-2655 (1993).</li><li>Petruska, J. A., Hodge, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subunit+Model+for+Tropocollagen+Macromolecule.">A Subunit Model for Tropocollagen Macromolecule.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51, 871-876 (1964).</li><li>Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Pattern+in+Native+Collagen.">Molecular Pattern in Native Collagen.</a> Nature. 219, 157-158 (1968).</li><li>Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+collagen+from+connective+tissue+by+neutral+salt+solutions.">Extract of collagen from connective tissue by neutral salt solutions.</a> PNAS. 41, 1-7 (1955).</li><li>Gale, M., Pollanen, M. S., Markiewicz, P., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+assembly+of+collagen+revealed+by+atomic+force+microscopy.">Sequential assembly of collagen revealed by atomic force microscopy.</a> Biophys. J. 68, 2124-2128 (1995).</li><li>Wood, G. C., Keech, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+fibrils+from+collagen+solutions.">The formation of fibrils from collagen solutions.</a> Biochem. J. 75, 588-597 (1960).</li><li>Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+Fibril+formation.">Collagen Fibril formation.</a> J. Biol. Chem. 253, 6578-6585 (1978).</li><li>Holmes, D. F., Capaldi, M. J., Chapman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+collagen+fibrils+in+vitro;+the+assembly+process+depends+on+the+initiating+procedure.">Reconstitution of collagen fibrils in vitro; the assembly process depends on the initiating procedure.</a> Int. J. Biol. Macromol. 8, 161-166 (1986).</li><li>Paige, M. F., Rainey, J. K., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrous+long+spacing+collagen+ultrastructure+elucidated+by+atomic+force+microscopy.">Fibrous long spacing collagen ultrastructure elucidated by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 3211-3216 (1998).</li><li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+mucoprotein+with+soluble+collagen;+an+electron+microscope+study.">The interaction of mucoprotein with soluble collagen; an electron microscope study.</a> PNAS. 37, 286-291 (1951).</li><li>Ghadially, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ultrastructural pathology of the cell and matrix. , (1988).</li><li>Paige, M. F., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+and+assembly+of+segmental+long+spacing+collagen+studied+by+atomic+force+microscopy.">Ultrastructure and assembly of segmental long spacing collagen studied by atomic force microscopy.</a> Micron. 74, 355-361 (2001).</li><li>Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+particle+type+in+certain+connective+tissue+extracts.">A new particle type in certain connective tissue extracts.</a> PNAS. 39, 459-470 (1953).</li><li>Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+segment-long-spacing+crystallites:+their+role+in+collagen+fibrillogenesis.">Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis.</a> PNAS. 76, 313-317 (1979).</li><li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+observations+of+certain+fibrous+structures+obtained+from+connective+tissue+extracts.">Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts.</a> JACS. 72, 3321-3322 (1950).</li><li>Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O+prokollagene+kohzi.">O prokollagene kohzi.</a> Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).</li><li>Lin, A. C., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+ultrastructure+of+fibrous+long+spacing+collagen+by+parallel+atomic+force+and+transmission+electron+microscopy.">Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy.</a> Proteins. 49, 378-384 (2002).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تنقية مونومر الكولاجين هو مستقر في انخفاض الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة وتشكيل الكولاجين الألياف الأصلي ينطوي أساسا رفع درجة الحموضة ودرجة حرارة الكولاجين حل مونومر. وقد وجدت إجراءات لإعادة تشكيل الكولاجين الألياف النطاقات من مونومرات لأكثر من 50 عاما. تلخيص الإجراء الذي مختبرنا المستخدمة في دراساتنا الأولى مع الكولاجين قبل 15 عاما واستند 7 على الإجراءات التي تشابمان وزملاء العمل في 1986 10. وكانت الظروف لتشكيل الكولاجين لييف في هذا العمل في وقت سابق 0.18 مغ / مل من الكولاجين في مونومر نا 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0.2، ودرجة الحموضة 7.4) المخزن المؤقت في 34 ° C. والعيب في هذه وغيرها من الإجراءات التي حاولنا أن هناك الألياف unbanded دائما إلى جانب تشكيل لييفات النطاقات المطلوب. شروطنا الجديدة ~ 0.3 ملغ / مل من الكولاجين في مونومر الفوسفات 100 ملم و 100 ملم على بوكل الرقم الهيدروجيني 7 غادر في 37 درجة مئوية لمدة ساعة 3-4. اإلجراءاتوصف dure هنا يختلف في كل جانب من جوانب من الإجراء في وقت سابق لصنع الألياف الكولاجين الأصلية. ولكن معظم بشكل ملحوظ، ونحن قد تضاعفت قوة الأيونية عن طريق رفع تركيز العازلة وبإضافة 100 ملي بوكل. الزيادة في نتائج القوة الأيونية في تشكيل أكثر اتساقا من الألياف الكولاجين النطاقات حصرا. في تجربتنا، وكان مرات فقط أن هذا الإجراء لم تنتج الكولاجين نوع الأصلية عندما حل مونومر الكولاجين بعد موعد أوصت الشركة المصنعة للاستخدام. وعندما يحدث هذا، لوحظ ما يتراوح بين أقل الألياف التي unbanded جميع لاحظ العديد من الألياف ولكن لا يزال يغلب عليها الطابع unbanded. نلاحظ أن منتهية الصلاحية مونومر الكولاجين وغالبا ما يزال استخدامها بنجاح لجعل الكولاجين الأصلية، ولكن عندما فشل في ذلك يتعين شراؤها جديدة مونومر بالتأكيد أن الكولاجين. كان أول من عرف من FLS Highberger وآخرون 17 في التحضيرات الكولاجين لحساب Orekhovicح وآخرون 18. أدى إجراء المزيد من الدراسات وHighberger شميت أن نستنتج أن كان بروتين سكري الحمضية α1 تعزز تشكيل FLS 12. كنا في وقت لاحق قادرة على تكرار الإجراء لصنع الكولاجين من خلال الجمع بين FLS المتاحة تجاريا مونومر الكولاجين وبروتين سكري الحمضية α1 في انخفاض الرقم الهيدروجيني ودرجة الحموضة مما يسمح ببطء ليرتفع بنسبة dialyzing الخليط ضد الماء لمدة 24 ساعة 11. نقدم الآن تعديل هذا الإجراء من قبل dialyzing المونمر الكولاجين ضد الماء أولا والجمع ببساطة مع α1 بروتين سكري الحمضية في الماء لتكوين الكولاجين FLS. شروط FLS الكولاجين الجمعية الموصوفة هنا هي اقل بكثير من مضيعة للوقت. ومونومر الكولاجين لا تزال بحاجة إلى أن تكون قبل مدال ضد المياه، ولكن يمكن أن يتم ذلك في معظم وتخزينها ثم في 4 درجات مئوية حتى ستابلي استخدامها. هذا الإجراء الجديد غلة FLS في الغالب ييفات الكولاجين النطاقات. من تجربتنا، α1 الحمضية غليكوالبروتين مع البروتين والماء أقل مجتمعة، وفقا للمحتوى الاستدلال أعلى السكر، أمر بالغ الأهمية لصنع الألياف FLS بنجاح. ونحن عادة تحقق مع الشركة المصنعة أن الكثير بروتين سكري الحمضية α1 التي نستخدمها ومجتمعة نسبة البروتين والماء من 82٪ أو أقل. ويمكن كما هو الحال مع الإجراء لتخليق الكولاجين الأصلية، مونومر الكولاجين ما هو قديم جدا يؤدي أيضا إلى عدم إنتاج الكولاجين FLS. وبالإضافة إلى ذلك، على نقاء المياه المستخدمة لغسيل الكلى أمر بالغ الأهمية في هذا الإجراء. على سبيل المثال، غسيل الكلى من مونومر الكولاجين حتى ضد ~ 8 MΩ.cm بدلا من&gt; الماء MΩ.cm 18 نتيجة في حل الكولاجين التي لن تشكل الكولاجين FLS. ثلاثة أنواع من الكولاجين ليفية، وأسهل لجعل هو SLS الكولاجين. ووصف أقرب إعداد SLS بواسطة شميت وزملاء العمل-15. نشرنا على التكيف من هذا الإجراء قبل 12 عاما لصنع الكولاجين باستخدام SLS كول المتاحة تجارياآجا 14. الإجراء ينطوي ببساطة الجمع بين 2 ملغ / مل و 0.5 ATP ملغ / مل من الكولاجين في مونومر 0.05٪ (V / V) حامض الخليك في درجة الحموضة 3.5، وترك الخليط في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. في تجربتنا، وجانبا مهما من الجمعية SLS التي يجب أن يسيطر هو الرقم الهيدروجيني للمحلول التفاعل. SLS تجميعها في ظروف أكثر الأساسية (درجة الحموضة 3،6-3،9 ~) النتائج المجمعة في كتل من crystallites. أكثر حمضية الظروف (درجة الحموضة 2،9-3،2 ~) النتائج في crystallites أرق، وأكثر من فصل تلك التي جمعت تحت الظروف المثالية من درجة الحموضة 3،3-3،5. بالوسط رد فعل خارج هذا النطاق (&lt;2.8 و&gt; 4) لا تسفر عن أي الكولاجين SLS. في الماضي، نحن تعديل الرقم الهيدروجيني للخليط التفاعل عن طريق إضافة حمض الخليك. لتبسيط الإجراء إلى أبعد من ذلك، في هذه المخطوطة قدمنا ​​منطقة عازلة جليكاين، حمض الهيدروكلوريك للسيطرة على الرقم الهيدروجيني. ثلاثة هياكل مختلفة الكولاجين تكونت من البروتوكولات المذكورة أعلاه لها طابعلا يمكن إلا أن ميزات istic يمكن تمييزها عن طريق الصكوك قادرة على قرار نانومتر. وتتميز الكولاجين الأصلية وFLS من النطاقات دوريات من 67 نانومتر ~ و ~ نانومتر 270. أطول البعد الكولاجين SLS هو مجرد ~ نانومتر 360. وقد وصفت ونحن على وجه التحديد كيفية استخدام AFM لوصف ثلاثة هياكل الكولاجين مختلفة. ومع ذلك، فإن أي AFM التشغيل على اتصال متقطع أو وضع أي اتصال مع التحقيق AFM وجود &lt;دائرة نصف قطرها 10 نانومتر تكون ايضا قادرة على صورة هذه الهياكل الكولاجين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون الإلكترون المجهري واستخدمت لوصف هذه الهياكل الكولاجين 19. والميزة الرئيسية لهذه الإجراءات هو أنها تنتج في الغالب بناء الكولاجين المطلوب. الشكل الوحيد أخرى من الكولاجين التي وجدت في ردود الفعل هذه هو مونومر انطلاق، التي غالبا ما تكون وضوحا في الخلفية من الصور AFM. في حالة الكولاجين الأصلية وFLS، يمكن انهما انفصلا بسهولة من معظم unreaالمديرية مونومر بواسطة الطرد المركزي المتكررة وغسل الأم أو الناتجة FLS بيليه الكولاجين بالماء. قدمنا ​​إجراءات بسيطة وموثوق بها لجعل الأم، والكولاجين FLS SLS باستخدام المتقدمة، متوفرة تجاريا المواد الأولية. ومونومر الكولاجين المستخدمة في كل هذه الإجراءات هي متاحة تجاريا في شكل منقى. α1 بروتين سكري الحمضية وATP هي أيضا وكلاهما متاح تجاريا.

الكولاجين هو فئة من البروتينات الهيكلية التي يكون لها هيكل ثلاثي حلزونية تكونت من ثلاث سلاسل ببتيد. هذه مونومرات الثلاثي حلزونية تجميع مزيد بطريقة الهيكل التنظيمي لتشكيل هياكل أكبر تدريجيا. هناك ما لا يقل عن 28 أنواع مختلفة وراثيا الكولاجين التي تم تحديدها 1. مجتمعة، تشكل الكولاجين 30٪ من البروتين الكلي وجدت في الحيوانات، مع النوع الأول الشكل السائد المحاسبة لمدة تصل إلى 90٪ من مجموع بروتينات الكولاجين و2. تم العثور على النوع الأول الكولاجين والهياكل fibrillous في الجلد، والأوتار والأربطة والعظام. مجهر القوة الذرية (AFM) والمجهر الالكتروني (EM) صور النوع الأول ألياف الكولاجين الأصلية عادة ما تظهر النطاقات مع فترة 67 نانومتر من سمات ~ (غالبا ما يشار إليها باسم D-النطاقات) 3-5. النوع الأول الكولاجين مونومر هو heterotrimer حلزونية ثلاثية تتكون من اثنين من α1 متطابقة (I) سلاسل واحد α2 (I) السلسلة، أكثر من كلألف الأحماض الأمينية طويلة. وهو طويل ورقيقة مع أبعاد 300 نانومتر في الطول و 1.4 نانومتر في القطر. النوع الأول يمكن الحصول عليها بسهولة مونومر الكولاجين عن طريق تحطيم هياكل تشكلت طبيعيا مرتبة أعلى 6. لقد أظهرنا الكثير من 8-10 7 و غيرها من الجهات التي يمكن بعد هذه مونومر ذوبان كتل بناء يمكن استخدامها لإعادة بناء D-النطاقات الألياف في المختبر (الشكل 1). بالإضافة إلى الألياف الكولاجين الأصلية، تم العثور على اثنين آخرين الكولاجين أعلى ترتيب لتشكيل الهياكل في المختبر باستخدام بناء مونومر نفس الكتلة. الهياكل هما تباعد طويلة ليفية (FLS) وتباعد طويل قطعي (SLS) الكولاجين (الشكل 1). FLS الكولاجين هو بناء fibrillous مثل الكولاجين الأصلية، ولكن يتميز أكبر من الكولاجين دورية النطاقات المحلية 11. في المختبر، FLS الكولاجين تتشكل عندما يتم الجمع بين مونومر مع الكولاجين بروتين سكري الحمضية α1 <suف&gt; 12. وقد لوحظ FLS الكولاجين في الجسم الحي أيضا، على الرغم من أن نادرا ما 13. يوصف SLS الكولاجين وcrystallites ليتم محاذاة مونومرات في سجل مثل في الكريستال المشبك 14. SLS تشكل الكولاجين عندما يتم الجمع بين مونومر الكولاجين مع الأدينوساين ثلاثي (ATP) 15. وقد لوحظ التي تحدث بشكل طبيعي SLS الكولاجين في الخلايا الليفية المتوسطة ثقافة ولكن ليس في عينات الأنسجة المستخرجة. الأرجح بسبب صغر حجمها وعدم وجود ميزات الطبوغرافية مميزة 16 والهدف من هذا المخطوط هو تقديم الإجراءات التفصيلية لصنع الألياف الكولاجين الأصليين FLS جيدا وSLS الكولاجين أنه حتى الباحثين الأكثر الحاحا في الخبرة يمكن أن تتكاثر. استخدام المواد المتقدمة المتاحة تجاريا البداية، حاولنا جعل البروتوكولات بسيطة قدر الإمكان والعمل لا يزال يكون لهم بشكل موثوق. ونحن أيضا بالتفصيل كيفية استخدام AFM لوصف بنية الكولاجين مختلفةق التي يتم إجراؤها. وهذا العمل يكون مفيدا للباحثين الذين يرغبون في دراسة واحدة أو أكثر من هذه الهياكل أجل أعلى الكولاجين و / أو استخدامها كما السلائف في تطبيقات أخرى، ولكنها تفتقر حاليا من الخبرات أو ببساطة لا يرغبون في العمل مع عينات الأنسجة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المادة / كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> النوع الأول الكولاجين مونومر (~ 3 ملغ / مل في 0.01 N حمض الهيدروكلوريك) </td><td> Inamed المتقدمة Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> الكثير 1261443 (2.9 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 2.1) الكثير 1629346 (3.2 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 2.1) الكثير 6006 (3.2 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 2.1) </td></tr><tr><td> ATP </td><td> الكيميائية الحيوية البحوث الدولية </td><td> A-141 </td><td> الكثير FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1 الحمضية بروتين سكري من البلازما البقري </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G3643 </td><td> الكثير 051K7440 (89.8٪) الكثير 011K7410 (82٪) الكثير 065K7405 (71.2٪) الكثير 063K7495 (71.9٪) الكثير 117K7535 (75.9٪) (البروتين المحتوى المائي +) </td></tr><tr><td> A1-حمض glycoprotein من البلازما البشرية </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G9885 </td><td> الكثير 128H7606 (70.9٪) 049K7565V الكثير (68٪) (البروتين المحتوى المائي +) </td></tr><tr><td> الميكا </td><td> تيد بيلا </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - سيليكون SPM-الاستشعار </td><td> Nanoworld </td><td> NHC </td><td> السيليكون AFM التحقيق التي نستخدمها لوضع الاتصال المتقطع </td></tr><tr><td> نصائح Veeco Nanoprobe </td><td> Veeco (بروكر الآن تحقيقات AFM) </td><td> NP-S </td><td> السيليكون نيتريد AFM التحقيق التي نستخدمها لوضع الاتصال </td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen

ييفات الكولاجين موجودة في المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة الحيوانية لتوفير السقالات الهيكلية والقوة الميكانيكية. هذه الألياف الكولاجين الأصلي لها دورية مميزة النطاقات من 67 نانومتر ~ وتتكون في الجسم الحي من خلال الجمعية هرمية من نوع الكولاجين مونومرات I، والتي هي 300 نانومتر في الطول و 1.4 نانومتر في القطر. في المختبر، من خلال تغيير الظروف التي تكون ويتعرض اللبنات مونومر، يمكن بناء هياكل فريدة من نوعها تتراوح في جداول طول مدة تصل إلى 50 ميكرون، بما في ذلك ليس فقط الألياف نوع الأصلي، ولكن أيضا ليفية طويلة تباعد وقطعي الكولاجين تباعد طويل هنا، نقدم إجراءات تشكيل الكولاجين ثلاثة هياكل مختلفة من مونومر المشتركة الكولاجين متوفرة تجاريا. باستخدام البروتوكولات التي نحن وغيرنا قد نشرت في الماضي لجعل هذه الأنواع الثلاثة تؤدي عادة إلى مزيج من الهياكل. على وجه الخصوص، كانت الألياف عادة و unbandedound عند اتخاذ الكولاجين الأصلية، والألياف الأصلية كانت غالبا ما تكون موجودة عند اتخاذ الليفية الكولاجين تباعد طويل. هذه الإجراءات الجديدة لديها ميزة إنتاج الكولاجين المطلوب نوع يفية على وجه الحصر تقريبا. يتم التحقق من تشكيل الهياكل المطلوبة عن طريق التصوير باستخدام مجهر القوة الذرية.

الكولاجين الأصلية خليط التفاعل قدره 0.3 ~ مونومر الكولاجين ملغ / مل في الفوسفات 100 ملم و 100 ملم على بوكل الرقم الهيدروجيني 7 غادر في 37 درجة مئوية لمدة ساعة 3-4 سوف تسفر محلول يحتوي على الألياف الكولاجين الأصلي نوع واضحة ~ 67 نانومتر D-النطاقات، دون الألياف unbanded. تحت المجهر الضوئي في التكبير × 200، يمكن كتل من الألياف عدة ينظر عادة على الركيزة الميكا خاصة عندما شاهدوا على النقيض من التدخل الفرق (DIC) المجهر (الشكل 2). في عينة نموذجية، 100 × عشوائية سوف تفحص 100 ميكرون 2 من AFM عادة ما تظهر على الاقل الألياف القليلة التي هي ميكرون 5-50 طويلة (أرقام 3A-C). الفردية، يمكن ييفات الكولاجين مفصولة التعرف عليها بسهولة في هذه المرحلة. مع 512 × 512 بكسل مسح الصورة 2، التكبير إلى 10 × 10 ميكرون حجم 2 يبين المسح الضوئي التي تجمعت جميع الألياف (أرقام 3D-F </stroنانوغرام&gt;). من أجل قياس بدقة وتيرة النطاقات، فمن الأفضل للتكبير في حجم 2 × 2 ميكرومتر الفحص 2 (أرقام 3G-I). يمكن ربط دورية يحددها قياس ببساطة وبلغ متوسط ​​المسافة الطولية بين عدة قمم أو الوديان. بدلا من ذلك، إذا كان البرنامج يسمح AFM، وهو أحد الأبعاد تحويل فورييه على طول المقطع العرضي الطولي يمكن أن تستخدم أيضا. ويبين الشكل 4 صورة ارتفاع ليفية AFM والمقابلة طولية المقطع العرضي. FLS الكولاجين سوف خليط التفاعل من 1 بروتين سكري الحمضية μ1 ملغ / مل و~ 1 مونومر الكولاجين ملغ / مل في الماء ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تسفر عن حل لييفات الكولاجين FLS. يمكن كتل من الألياف، على غرار ما لوحظ في حالة الكولاجين الأصلية، ينظر اليه بسهولة على الركيزة الميكا تحت المجهر الضوئي في 200 م ×agnification. في عينة نموذجية، وعشوائية 100 × 100 ميكرون 2 المسح بواسطة AFM عادة ما تظهر على الاقل الألياف قليلة. مع 512 × 512 بكسل حجم 2 صورة المسح الضوئي، يمكن قياس وتيرة النطاقات من التكبير إلى 10 × 10 ميكرون 2 المسح الضوئي (الشكل 5A) أو بدقة أكثر مع 5C الشكل 2 × 2 ميكرومتر 2 المسح الضوئي (الشكل 5B). يظهر طولية المقطع العرضي ليفية FLS. SLS الكولاجين سوف خليط التفاعل من 2 ملغ / مل ATP و~ 0.5 ملغ / مل من مونومر الكولاجين في 100 العازلة جليكاين، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 3،3 ملم على ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة تسفر عن حل الكولاجين SLS. عادة، سوف crystallites SLS لا تكون مرئية تحت المجهر الضوئي. مطلوب AFM لتأكيد وجود crystallites SLS. في عينة نموذجية، وعشوائية 100 × 100 ميكرون 2 المسح بواسطة AFM عادة ما تظهر العديد منالنقاط. والتكبير في فحص 10 × 10 2 ميكرومتر عادة ما تظهر عدة SLS crystallites (الشكل 6A). و2 × 2 ميكرومتر 2 المسح الضوئي (الشكل 6B) يبين هيكل أدق من الكريستال SLS. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> الشكل 1. والأشكال الثلاثة مختلفة هيكليا من الألياف الكولاجين التي يمكن تشكيلها في المختبر من مونومر الكولاجين. الصور التي تصور AFM مونومر الكولاجين الكولاجين وثلاثة هياكل النظام أعلى على مقياس كل نفس الحجم (2 × 2 ميكرومتر 2). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> الشكل 2. الرقمية في صورة ~ التكبير × 200 بواسطة المجهر الضوئي من مدينة دبي للإنترنت الألياف الكولاجين الأصلية على الميكا (أ) لم يمسها و (ب) وشحذ ر thresholdedس تسليط الضوء على الألياف. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> الشكل 3. الصور AFM من الألياف الكولاجين الأصلية على الميكا. وتظهر متقطعة الاتصال AFM وضع الصور السعة. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> الشكل 4 (أ) 0.5 × 1 ميكرومتر 2 الوضع اتصال متقطع AFM صورة ارتفاع (المقياس العمودي = 100 نانومتر) و (ب) طولية المقطع العرضي ليفية الكولاجين الأصلية. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> الشكل 5. الصور AFM من الألياف الكولاجين FLS على الميكا. (أ) 10 × 10 ميكرون 2 اتصل انحراف AFM وضع الصور، (ب) 2 × 2 ميكرومتر 2 اتصل انحراف AFM وضع الصور والطولية (ج)المقطع العرضي ليفية الكولاجين FLS. <img alt="الشكل 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> الشكل 6. الصور AFM الكولاجين SLS على الميكا. وتظهر متقطعة الاتصال AFM وضع الصور السعة.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen at JoVE.com

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

ووصف إجراءات بسيطة وقابلة للتكرار لصنع الكولاجين ثلاث جمعيات متميزة هيكليا من نوع شائع المتاحة تجاريا I مونومر الكولاجين. نوع الأصلي، ويمكن أن تبنى تباعد طويلة ليفية أو قطعي الكولاجين تباعد طويل من خلال تغيير الظروف التي تكون طويلة و300 نانومتر يتعرض 1،4 نانومتر مونومر قطر بنة.

في تركيب المختبر من تباعد الليفية الأصلية، طويل والقطاعي الكولاجين تباعد طويل

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

in-vitro-synthesis-native-fibrous-long-spacing-segmental-long-spacing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

13.6K Views.  University of Toronto. ووصف إجراءات بسيطة وقابلة للتكرار لصنع الكولاجين ثلاث جمعيات متميزة هيكليا من نوع شائع المتاحة تجاريا I مونومر الكولاجين. نوع الأصلي، ويمكن أن تبنى تباعد طويلة ليفية أو قطعي الكولاجين تباعد طويل من خلال تغيير الظروف التي تكون طويلة و300 نانومتر يتعرض 1،4 نانومتر ?...

Video: In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

ثلاثي الطبقات Electrospinning لتقليد العمارة الشرياني الأصلية باستخدام Polycaprolactone ، الإيلاستين ، والكولاجين : دراسة أولية

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung3. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke4. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke14. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine8. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively11,13

Spin-trapping ESR spectroscopy was used to study the effect of plant antioxidants lycopene, pycnogenol and grape seed extract on scavenging gas-phase free radicals in cigarette smoke.

بروتوكول لكشف ونبش النفايات الغاز مرحلة الجذور الحرة في دخان السجائر العادي

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

في الموقع تحميل ضاغطة والتصوير موسع الارتباطي من العظم اللثة الرباط الأسنان الليفية المشتركة

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

طويلة الأجل حيوي داخلي المناعي التصوير من الأنسجة مكونات مصفوفة مع Epifluorescence والميكروسكوب ثنائي الفوتون

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

استخدام الميكروسكيل السيليكون الكابولي لتقييم مقلص الخلوية وظيفة<em&gt; في المختبر</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

جهاز التقاط الصور الحية طويلة الأجل لتحسين التلاعب التجريبية من اليرقات الزرد

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

تصنيع نانوباتيرن التدرج الحراري نانويمبرينتينج تقنية والفحص لاستجابة الخلايا البشرية تشكيل مستعمرة غشائي

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

ترتيب القراءة طويلة جداً لتحليل الحمض النووي كله

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...