Vorremmo ringraziare tutti i numerosi precedenti universitari, dottorandi e post-dottorato che hanno contribuito con il loro tempo e fatica per lo studio della fibrogenesi collagene nel nostro laboratorio. Le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada ha costantemente fornito un finanziamento per i nostri studi di collagene.

NOTA: L&#39;acqua utilizzata in tutti i protocolli ha una resistività&gt; 18 MΩ.cm. 1. Fibrille di collagene nativo <ol><li> Combinare 6 microlitri di acqua, 20 pl di 200 mM Na 2 HPO 4 regolato a pH 7 con HCl e 10 pl di 400 mM KCl in una provetta e mescolare. </li><li> Aggiungere 4 ml di collagene monomero (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) nella provetta per microcentrifuga e mescolare. La soluzione deve essere limpida e incolore. </li><li> Posizionare la provetta da microcentrifuga contenente la miscela di reazione in un blocco di calore che è stato pre-riscaldato a 37 ° C e lasciato per 3 a 4 ore. A questo punto, la soluzione deve essere leggermente nuvoloso e contiene fibrille di collagene prevalentemente nativi. </li></ol> 2. Fibrosa collagene spaziatura lungo <ol><li> Dializza 1 ml di collagene monomero (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) utilizzando 12-14 kDa membrana MWCO contro 400 ml di acqua, cambiando l&#39;acqua quattro volte per un periodo di 24 ore a temperatura ambiente. Il collag dializzatoen monomero che non viene utilizzato subito può essere conservato a 4 ° C per un uso futuro. </li><li> Combinare 20 pl di acqua, 20 ml di 3 mg / ml α1-glicoproteina acida in acqua e 20 ml di collagene monomero dializzato in una provetta per microcentrifuga. La soluzione deve essere limpida e incolore. </li><li> Lasciare la provetta da microcentrifuga contenente la miscela di reazione a temperatura ambiente per 30 min. A questo punto, la soluzione deve essere nuvoloso e contenere fibrille di collagene prevalentemente FLS. </li></ol> 3. Segmentale collagene spaziatura lungo <ol><li> Combinare 67 microlitri di acqua, 60 pl di 100 mM glicina-HCl a pH 3,3 e 40 ml di 10 mg / ml in acqua ATP in una provetta e mescolare. </li><li> Aggiungere 33 ml di collagene monomero (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) nella provetta per microcentrifuga e mescolare. La soluzione deve essere limpida e incolore. </li><li> Lasciare la provetta da microcentrifuga contenente la miscela di reazione a temperatura ambiente per 2 h. A questo punto, la soluzione apparirà ancora chiara, ma devecontengono principalmente collagene SLS. </li></ol> 4. Caratterizzazione AFM <ol><li> Fendere la superficie di un pezzo di mica attaccato ad un substrato AFM coprendo la superficie mica con un pezzo di nastro adesivo e poi peeling via. Controllare il nastro dopo per confermare che un intero strato di mica è stato tagliato in modo da ridurre le irregolarità sulla superficie e garantire che il campione precedente viene rimossa se la mica viene riutilizzato. </li><li> Applicare 20 microlitri della soluzione di collagene fibrillare al substrato di mica appena spaccati. Lasciar riposare per 5 min. </li><li> Delicatamente sciacquare soluzione di fibrille di collagene con l&#39;acqua. Si consiglia di non applicare l&#39;acqua direttamente sul centro del substrato di mica, ma al bordo e per consentirgli di fluire attraverso il campione. </li><li> Asciugare la superficie con un leggero flusso di azoto. Si consiglia di dirigere il flusso al bordo e non al centro del substrato di mica. </li><li> Sotto un microscopio ottico a 200 × ingrandimento,i campioni di collagene nativo e FLS dovrebbe mostrare macchie di fibrille. Collagene SLS non sarà visibile. </li><li> Le caratteristiche uniche delle tre strutture diverse di collagene sono osservabili da AFM. In generale, noi immagine fibrille di collagene nativo con un AFM in modalità di contatto intermittente con silicio sonde AFM, mentre FLS e collagene SLS fibrille che tipicamente immagine con un AFM in modalità di contatto con nitruro di silicio sonde AFM. Lo facciamo perché di tempo e di considerazioni di costo. Silicon sonde AFM sono di solito più tagliente di nitruro di silicio sonde AFM, che li rendono particolarmente utili per l&#39;imaging della struttura stretta strisce di fibrille di collagene nativo. Tuttavia, silicio sonde AFM sono molto più inclini alla contaminazione da campioni di collagene di nitruro di silicio sonde AFM e la necessità di sostituire frequentemente. Ci riserviamo pertanto l&#39;uso di silicio sonde AFM per lo più per fibrille di collagene nativo di imaging in cui la risoluzione è una necessità maggiore e operiamo in modo intermittente a contatto prolong loro vita di utilità. </li></ol> Si consiglia un iniziale di 100 × 100 micron 2 scan che dovrebbe mostrare almeno un paio di costrutti di collagene. Da lì, lo zoom per eseguire la scansione di dimensioni di 10 × 10 micron 2 e poi 2 × 2 micron 2 per osservare la periodicità bande di collagene nativo e FLS, o le caratteristiche più sottili di un collagene SLS. E &#39;anche una buona idea controllare almeno due altre regioni sul campione collagene per verificare che le scansioni iniziali sono rappresentativi.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Purificato monomero collagene è stabile a pH basso e temperatura e la formazione di fibrille di collagene nativo coinvolge essenzialmente aumentare il pH e la temperatura della soluzione di monomero collagene. Le procedure per la ricostituzione di fibrille di collagene a banda di monomeri esistono da più di 50 anni. La procedura che il nostro laboratorio utilizzato nei nostri primi studi con il collagene 15 anni fa 7 è stato sulla base di procedure riassunte da Chapman e collaboratori nel 1986 10. Le condizioni per la formazione di fibrille di collagene che in lavori precedenti erano 0,18 mg / ml di collagene monomero in Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) tampone a 34 ° C. L&#39;inconveniente di questa e di altre procedure che abbiamo provato è che ci sono sempre unbanded fibrille formate lungo le fibrille desiderati banda. Le nostre nuove condizioni sono ~ 0,3 mg / ml di collagene monomero fosfato in 100 mM e 100 mM KCl a pH 7 sinistra a 37 ° C per 3-4 ore. La procedura didure descritte nel presente documento si differenzia in ogni aspetto dalla procedura precedente per fare fibrille di collagene nativo. Ma la maggior parte notevolmente, abbiamo raddoppiato la forza ionica, aumentando la concentrazione del tampone e l&#39;aggiunta di 100 mM KCl. L&#39;aumento della forza ionica in formazione più coerente delle fibrille di collagene esclusivamente fasciato. Nella nostra esperienza, le uniche volte che tale procedura non ha prodotto collagene nativo tipo di prodotto era quando la soluzione di monomeri di collagene era oltre la data consigliata dal costruttore, di utilizzo. In questo caso, ciò che si osserva varia da meno fibrille che sono tutti unbanded a fibrille molti ancora accertate ma prevalentemente unbanded. Si noti che monomero collagene scaduti spesso può ancora essere usato con successo per fare collagene nativo, ma quando fallisce, monomero nuovo collagene dovrebbe assolutamente essere acquistato. FLS è stato identificato da Highberger et al 17. In preparati di collagene accreditati Orekhovich et al. 18. Ulteriori studi ha portato Highberger e Schmitt a concludere che si trattava di α1-glicoproteina acida, che promuove la formazione di FLS 12. Siamo stati poi in grado di replicare la procedura relativa alle collagene FLS combinando monomero collagene disponibile in commercio e α1-glicoproteina acida a pH basso e lentamente consentendo il pH ad aumentare di dialisi la miscela contro l&#39;acqua per 24 ore 11. Presentiamo ora una modifica di tale procedura da dialisi monomero collagene contro acqua prima e semplicemente la combinazione con α1-glicoproteina acida in acqua per formare collagene FLS. Le condizioni per il collagene FLS montaggio qui descritte sono molto meno tempo. Il monomero collagene deve ancora essere pre-dializzato contro acqua, ma può essere fatto in massa e poi conservate a 4 ° C fino a quando non viene stabilmente utilizzato. Questo produce nuova procedura FLS prevalentemente fibrille di collagene a banda. Dalla nostra esperienza, α1-acido glicoproteina con un più basso contenuto proteico combinata e acqua, e dal contenuto di zuccheri inferenza maggiore, è fondamentale per effettuare correttamente fibrille FLS. Noi di solito verificare con il produttore che l&#39;α1-glicoproteina acida molto che usiamo ha un combinato% di contenuto di proteine ​​e di acqua di 82 o meno. E come con la procedura per la sintesi del collagene nativo, monomero collagene che è troppo vecchio può anche comportare la mancata produzione di collagene FLS. Inoltre, la purezza dell&#39;acqua utilizzata per la dialisi è critico in questa procedura. Ad esempio, la dialisi contro collagene di monomero anche ~ 8 MΩ.cm anziché&gt; 18 risultati MΩ.cm acqua in una soluzione di collagene che non si formerà collagene FLS. Dei tre tipi di fibrille di collagene, il più facile da fare è il collagene SLS. La prima preparazione di SLS è stato descritto da Schmitt e collaboratori 15. Abbiamo pubblicato un adattamento di tale procedura 12 anni fa per la produzione di collagene SLS utilizzando coll disponibile in commercioagen 14. La procedura comporta semplicemente combinando 2 mg / ml ATP e 0,5 mg / ml di collagene nel monomero 0,05% (v / v) di acido acetico a pH 3,5, e lasciando la miscela a temperatura ambiente per una notte. Nella nostra esperienza, l&#39;aspetto critico di assemblaggio SLS che deve essere controllato è il pH della soluzione di reazione. SLS assemblati in più condizioni di base (~ pH 3,6-3,9) si traduce in ciuffi di aggregati cristallini. Condizioni più acide (pH ~ 2,9-3,2) si traduce in più sottili, cristalliti più separati rispetto a quelli montati nelle condizioni ideali di pH 3,3-3,5. PH di reazione fuori di questo intervallo (&lt;2.8 e&gt; 4) non danno alcun collagene SLS. In passato, abbiamo regolato il pH della miscela di reazione per aggiunta di acido acetico. Per semplificare la procedura ulteriormente, in questo manoscritto abbiamo introdotto una glicina-HCl per controllare il pH. Le tre strutture di collagene diverse formate dai protocolli sopra descritti hanno caratterecaratteristiche teristiche che possono essere individuate da strumenti in grado di risoluzione nanometrica. Collagene nativo e FLS sono caratterizzati da bande periodicità di ~ 67 nm e circa 270 nm. La dimensione maggiore di collagene SLS è solo ~ 360 nm. Abbiamo descritto in particolare il modo in cui utilizzare un AFM per caratterizzare le tre strutture diverse di collagene. Tuttavia, qualsiasi operativo AFM a contatto o modalità contatto intermittente con qualsiasi sonda AFM avente &lt;10 nm raggio dovrebbero anche essere in grado di immagine queste strutture collagene. Inoltre, microscopia elettronica può essere ed è stato utilizzato per caratterizzare tali strutture collagene 19. Il principale vantaggio di queste procedure è che essi producono principalmente collagene desiderato costruire. L&#39;unica altra forma di collagene che si trova in queste reazioni è il monomero di partenza, che spesso è visibile sullo sfondo delle immagini AFM. Nel caso di collagene nativo e FLS, possono essere facilmente separato dalla maggior parte del unreamonomero CTED per centrifugazione e lavaggio ripetuto del nativo risultante o FLS collagene pellet con acqua. Abbiamo presentato procedure semplici e affidabili per rendere nativi, FLS e collagene SLS utilizzando avanzati, materiali di partenza commercialmente disponibili. Il monomero collagene utilizzato in tutte queste procedure è disponibile in commercio in una forma purificata. α1-glicoproteina acida e ATP sono entrambi disponibili in commercio.

Il collagene è una classe di proteine ​​strutturali che hanno una struttura a tripla elica formata da tre catene polipeptidiche. Questi monomeri tripla elica inoltre riunirsi in modo gerarchico a formare strutture sempre più grandi. Ci sono almeno 28 tipi di collagene geneticamente diversi che sono stati identificati 1. Insieme, collagene costituiscono il 30% delle proteine ​​totali trovato in animali, di tipo I con la contabilità forma predominante fino al 90% di tutte le proteine ​​del collagene 2. Collagene di tipo I si trova come strutture fibrillous in pelle, legamenti, tendini e ossa. Microscopio a forza atomica (AFM) e microscopio elettronico (EM) immagini di tipo I fibre di collagene nativo di solito mostrano bande con un periodo caratteristico di ~ 67 nm (spesso definito come D-banding) 3-5. Monomero di tipo I collagene è una eterotrimero tripla elica composta da due identici α1 (I) catene e un α2 (I) catena, ciascuno più di unmille amminoacidi lunghi. È lungo e sottile con dimensioni di 300 nm di lunghezza e 1,4 nm di diametro. Monomero collagene di tipo I può essere facilmente ottenuta con rompersi formatesi naturalmente strutture di ordine superiore 6. Abbiamo 7 e molti altri 8-10 hanno mostrato che questi solubili blocchi monomero può quindi essere utilizzato per ricostruire D-banda fibrille in vitro (Figura 1). Oltre a fibrille di collagene nativo, due altre strutture collagene di ordine superiore sono stati trovati per formare in vitro utilizzando lo stesso blocco di monomero. Le due strutture sono fibrose spaziatura lungo (FLS) e segmentale spaziatura lungo (SLS) collagene (Figura 1). FLS collagene è un costrutto fibrillous come collagene nativo, ma è caratterizzata da una periodicità più bande di collagene nativo 11. In vitro, collagene FLS forma quando il monomero collagene è combinato con α1-glicoproteina acida <sup&gt; 12. Collagene FLS è stata osservata in vivo e, anche se raramente 13. Collagene SLS è descritto come cristalliti perché i monomeri sono allineati nel registro come in un reticolo cristallino 14. Collagene SLS forma quando il monomero collagene è combinato con l&#39;adenosina trifosfato (ATP) 15. Naturale collagene SLS è stato osservato nel mezzo di coltura di fibroblasti ma non in campioni di tessuto estratti, probabilmente a causa della sua piccola dimensione e la mancanza di distinguibili caratteristiche topografiche 16. L&#39;obiettivo di questo manoscritto è quello di presentare le procedure dettagliate per la preparazione di fibrille di collagene nativo come pure FLS e collagene SLS che anche il ricercatore più inesperto in grado di riprodurre. L&#39;utilizzo di materiali avanzati disponibili in commercio a partire, abbiamo cercato di rendere i protocolli più semplice possibile e ancora li hanno funzionare correttamente. Abbiamo anche dettagliatamente come utilizzare un AFM per caratterizzare la diversa struttura del collagenes che sono fatti. Questo lavoro sarà utile per i ricercatori che vogliono studiare una o più di queste strutture di ordine superiore di collagene e / o utilizzare come precursori in altre applicazioni, ma attualmente la mancanza di competenze o semplicemente non vogliono lavorare con campioni di tessuto.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale / reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Collagene di tipo I monomero (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) </td><td> Inamed Avanzata Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> Lot 1261443 (2,9 mg / ml, pH 2,1) Lot 1629346 (3,2 mg / ml, pH 2,1) Lotto 6006 (3,2 mg / ml, pH 2,1) </td></tr><tr><td> ATP </td><td> Biochemicals di ricerca internazionali </td><td> A-141 </td><td> Lot FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1-glicoproteina acida da plasma bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3643 </td><td> Lotto 051K7440 (89,8%) Lotto 011K7410 (82%) Lotto 065K7405 (71,2%) Lotto 063K7495 (71,9%) Lotto 117K7535 (75,9%) (Proteine ​​+ contenuto di acqua) </td></tr><tr><td> a1-acido glycoprotein da plasma umano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9885 </td><td> Lotto 128H7606 (70,9%) Lotto 049K7565V (68%) (Proteine ​​+ contenuto di acqua) </td></tr><tr><td> mica </td><td> Ted Pella </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - Silicon SPM-Sensor </td><td> Nanomondo </td><td> NHC </td><td> Silicon AFM sonda che usiamo per la modalità di contatto intermittente </td></tr><tr><td> Veeco nanoprobe Suggerimenti </td><td> Veeco (Ora Bruker sonde AFM) </td><td> NP-S </td><td> Silicio nitruro sonda AFM che usiamo per la modalità di contatto </td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen

Fibrille di collagene sono presenti nella matrice extracellulare del tessuto animale per fornire ponteggio strutturale e resistenza meccanica. Queste fibrille di collagene nativo ha una periodicità caratteristica bande di ~ 67 nm e sono formati in vivo attraverso l&#39;assemblaggio gerarchico di tipo I monomeri collagene, che sono 300 nm di lunghezza e 1,4 nm di diametro. In vitro, variando le condizioni alle quali l&#39; blocchi monomero sono esposti, strutture uniche che vanno in scale di lunghezza fino a 50 micron possono essere costruiti, tra cui non solo fibrille di tipo nativo, ma anche fibrosa spaziatura lungo e segmentale collagene spaziatura lungo. Qui, presentiamo procedimenti di formazione delle tre strutture collagene diversi da un monomero comune collagene disponibile in commercio. Utilizzando i protocolli che noi e altri hanno pubblicato in passato per rendere questi tre tipi di solito portano a miscele di strutture. In particolare, fibrille unbanded erano comunemente found quando si effettua collagene nativo, e fibrille native erano spesso presenti quando si effettua fibroso collagene lunga distanza. Queste nuove procedure hanno il vantaggio di produrre il desiderato tipo quasi esclusivamente fibrille di collagene. La formazione delle strutture desiderate è verificata immagini utilizzando un microscopio a forza atomica.

Collagene nativo La miscela di reazione di ~ 0,3 mg / ml di collagene monomero fosfato in 100 mM e 100 mM KCl a pH 7 sinistra a 37 ° C per 3-4 ore produrrà una soluzione contenente nativi fibrille di collagene di tipo trasparente con ~ 67 nm D-bande, senza fibrille unbanded. Sotto un microscopio ottico a 200 ingrandimenti ×, ciuffi di fibrille diverse possono essere normalmente visibile sul substrato di mica considerato segnatamente per contrasto interferenza differenziale (DIC) microscopio (Figura 2). In un tipico esempio, un caso 100 × 100 pm 2 scan da AFM di solito mostrano almeno un paio di fibrille che sono lunghe 5-50 micron (figure 3a-c). Individuale, separati da fibrille di collagene possono essere facilmente identificati in questa fase. Con un × 512 512 pixel 2 la scansione di immagini, lo zoom in un × 10 10 micron 2 dimensione scansione mostra che tutte le fibrille sono fasciato (figure 3d-f </strong&gt;). Al fine di misurare con precisione la periodicità bande, è meglio lo zoom in un 2 × 2 pm 2 superficie di scansione (figure 3g-i). Bande periodicità può essere determinato semplicemente misurando media e la distanza longitudinale tra diversi picchi o valli. In alternativa, se il software AFM permette, una trasformata di Fourier unidimensionale lungo una sezione longitudinale può essere utilizzato. Figura 4 mostra una immagine AFM altezza di fibrille e una corrispondente sezione longitudinale. FLS collagene La miscela di reazione di 1 mg / ml μ1-acida e ~ 1 mg / ml in acqua monomero collagene lasciato a temperatura ambiente per 30 min produrrà una soluzione di fibrille di collagene FLS. Ciuffi di fibrille, analogamente a quanto si osserva nel caso di collagene nativo, può essere facilmente visibile sul substrato di mica sotto un microscopio ottico a 200 m ×agnification. In un tipico esempio, un caso 100 × 100 pm 2 scan da AFM di solito mostrano almeno un paio di fibrille. Con 512 × 512 pixel 2 dimensione dell&#39;immagine di scansione, la periodicità bande può essere misurata con uno zoom a 10 × 10 micron 2 scan (Figura 5a), o più precisamente con un 2 × 2 um 2 scansione (figura 5b). Figura 5c mostra una sezione longitudinale di una fibrilla FLS. SLS collagene La miscela di reazione di 2 mg / ml e ATP ~ 0,5 mg / ml di collagene monomero in 100 mM glicina-HCl a pH 3,3 lasciata a temperatura ambiente per 2 h produrrà una soluzione di collagene SLS. Tipicamente, cristalliti SLS non saranno visibili al microscopio ottico. L&#39;AFM è necessario per confermare la presenza di cristalliti SLS. In un tipico esempio, un caso 100 × 100 pm 2 scan da AFM di solito mostrano i moltipunti. Lo zoom in un × 10 10 micron 2 scan di solito mostrano diversi cristalliti SLS (Figura 6a). E 2 × 2 um 2 scan (Figura 6b) mostra la struttura più sottile di un cristallite SLS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> Figura 1. Le tre forme strutturalmente diverse di fibrille di collagene che possono essere formati in vitro da monomero di collagene. Immagini AFM raffigurante monomero collagene e le tre maggiori strutture di collagene di ordine tutto su scala stesse dimensioni (2 × 2 micron 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> Figura 2. Immagine digitale a ~ 200 × ingrandimento di microscopia ottica in DIC di fibrille di collagene nativo di mica (a) intatta e (b) thresholded e affilata to evidenziare le fibrille. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> Figura 3. Immagini AFM di fibrille di collagene nativo di mica. Intermittenti contatti in modalità AFM ampiezza immagini vengono visualizzate. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> Figura 4. (A) 0,5 × 1 um 2 intermittente modalità immagine a contatto AFM altezza (scala verticale = 100 nm) e (b) sezione longitudinale di una delle fibrille di collagene nativo. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> Figura 5. Immagini AFM di fibrille di collagene FLS su mica. (A) 10 × 10 micron 2 contatto modalità immagine deflessione AFM, (b) 2 × 2 pm 2 contatto modalità immagine deflessione AFM e (c) longitudinalesezione trasversale di un collagene fibrillare FLS. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> Figura 6. Immagini AFM di collagene SLS di mica. Intermittenti contatti in modalità AFM ampiezza immagini vengono visualizzate.

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In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Procedure semplici e riproducibili sono descritte per la realizzazione di tre assemblee collagene strutturalmente distinti da un tipo comune, disponibile in commercio ho monomero collagene. Tipo nativo, fibroso spaziatura lungo o segmentale collagene spaziatura lungo può essere costruito variando le condizioni a cui i 300 nm di lunghezza e diametro di 1.4 nm blocco monomero edificio è esposto.

In sintesi in vitro di Native, Spaziatura fibrosa lungo e segmentale collagene spaziatura lungo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

13.6K Views.  University of Toronto. Procedure semplici e riproducibili sono descritte per la realizzazione di tre assemblee collagene strutturalmente distinti da un tipo comune, disponibile in commercio ho monomero collagene. Tipo nativo, fibroso spaziatura lungo o segmentale collagene spaziatura lungo può essere costruito variando le condizioni a cui i 300 nm di lunghezza e diametro di 1.4 nm blocco monomero edificio è esposto.

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Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-strato Electrospinning di Mimic nativa Architettura arteriosa utilizzando Policaprolactone, elastina e collagene: uno studio preliminare

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Ricerca

Bioingegneria

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung3. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke4. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke14. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine8. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively11,13

Spin-trapping ESR spectroscopy was used to study the effect of plant antioxidants lycopene, pycnogenol and grape seed extract on scavenging gas-phase free radicals in cigarette smoke.

Un protocollo per il rilevamento e scavenging in fase gassosa radicali liberi nel fumo di sigaretta Mainstream

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

In situ carico di compressione e Correlativo imaging non invasiva del Bone-parodontale legamento-dente Fibrosa comune

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

A lungo termine intravitale immunofluorescenza Imaging di tessuto componenti della matrice con Epifluorescenza e due fotoni Microscopia

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

L&#39;utilizzo di microscala Silicon cantilever per valutare Cellular contrattile Funzione<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Dispositivo di Imaging dal vivo a lungo termine per una migliore manipolazione sperimentale delle larve di Zebrafish

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Sequenziamento di lettura ultra-lungo per analisi di DNA Genomic intero

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...