ברצוננו להודות לכל תלמידים רבים בעבר לתואר ראשון, לתואר שני ופוסט דוקטורט שתרמו הזמן והמאמץ שלהם ללימוד fibrogenesis קולגן במעבדה שלנו. מדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה ספקו ברציפות מימון למחקרי קולגן.

הערה: המים המשמשים בכל הפרוטוקולים שיש התנגדות&gt; 18 MΩ.cm. 1. סיבי הקולגן Native <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 6 μl מים, 20 μl של 200 מ&quot;מ Na 2 HPO 4 מותאמים לחומציות 7 עם HCl ו 10 μl של 400 מ&quot;מ KCl בצינור microfuge ומערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μl של קולגן מונומר (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) לצינור microfuge והמערבב. הפתרון צריך להיות ברור וחסר צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צינור microfuge המכיל תערובת התגובה בגוש חום שכבר מראש חמם עד 37 ° C ולהשאיר במשך 3 עד 4 שעות. בשלב זה, הפתרון צריך להיות מעט עכור ומכיל סיבי הקולגן בעיקר ילידים. </li></ol> 2. לונג קולגן ריווח סיבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזת 1 מ&quot;ל של קולגן מונומר (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) באמצעות קרום 12-14 kDa MWCO נגד 400 מ&quot;ל של מים ומחליף את המים ארבע פעמים על פני תקופה של 24 שעות בטמפרטורת חדר. Collag הדיאליזהמונומר en שאינו משמש מייד ניתן לאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 20 μl מים, 20 μl של 3 מ&quot;ג / מיליליטר גליקופרוטאין α1 חומצה במים ו20 μl של מונומר קולגן דיאליזה בצינור microfuge. הפתרון צריך להיות ברור וחסר צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צינור microfuge המכיל תערובת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. בשלב זה, הפתרון צריך להיות מעונן ומכיל סיבי הקולגן בעיקר Fls. </li></ol> 3. לונג קולגן ריווח מגזרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 67 μl מים, 60 μl של חיץ 100 מ&quot;מימ גליצין-HCl ב-pH 3.3 ו 40 μl של 10 מ&quot;ג / המ&quot;ל ATP במים בצינור microfuge ומערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 33 μl של קולגן מונומר (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) לצינור microfuge והמערבב. הפתרון צריך להיות ברור וחסר צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צינור microfuge המכיל תערובת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. בשלב זה, הפתרון עדיין יופיע ברור, אבל צריךמכיל קולגן בעיקר SLS. </li></ol> 4. AFM אפיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב פני השטח של פיסה יציץ מצורפת מצע AFM על ידי כיסוי המשטח יציץ עם חתיכת הסרט דביק ולאחר מכן הפריד אותו. בדקו את הקלטת לאחר מכן כדי לוודא שכל שכבה של יציץ נבקעה על מנת לצמצם חריגות על פני השטח ולהבטיח שהמדגם הישן יוסר אם תציץ הוא להיות בשימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 20 μl של פתרון קולגן ליפון למצע יציץ טרי בקע. השאר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשטוף את הפתרון של קולגן יפון עם מים. מומלץ שלא להחיל את המים ישירות על מרכז המצע יציץ אבל בקצה ולאפשר לו לזרום על פני המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את המשטח שמתחת זרם עדין של גז חנקן. כדאי להפנות את הזרם בקצה ולא במרכז המצע יציץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלת × 200,דגימות קולגן הילידים וFLS צריכות להראות גושים של סיבים. קולגן SLS לא יהיה גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המאפיינים הייחודיים של השלושה המבנים השונים קולגן ניתנים לצפייה על ידי AFM. באופן כללי, אנו סיבי קולגן עם תמונה מקוריים AFM במצב מגע לסירוגין באמצעות בדיקות סיליקון AFM, ואילו FLS וקולגן SLS סיבים אנחנו בדרך כלל תמונה עם AFM במצב קשר באמצעות בדיקות AFM סיליקון ניטריד. אנו עושים זאת בגלל הזמן ושיקולי עלות. בדיקות AFM סיליקון הן בדרך כלל חד יותר בדיקות סיליקון ניטריד AFM, שהופכים אותם שימושיים במיוחד עבור הדמית מבנה הפסים הצר יותר של סיבי הקולגן ילידים. עם זאת, בדיקות AFM סיליקון הן הרבה יותר פגיעות לזיהום על ידי דגימות קולגן מבדיקות AFM סיליקון ניטריד וצריכים להחליף בתדירות גבוהה. לכן, אנו שומרים את השימוש בסיליקון בדיקות AFM בעיקר לסיבי הקולגן ילידי הדמיה שבו רזולוציה היא הכרח גדול יותר ואנו פועלים במצב מגע לסירוגין לprolאונג חייהם של שימושיות. </li></ol> אנו ממליצים ראשונית 100 × 2 סריקה 100 מיקרומטר שאמור להראות לפחות כמה מבני הקולגן. משם, בזום כדי לסרוק גדלים של 10 × 10 מיקרומטר 2 ואז 2 × 2 מיקרומטר 2 להתבונן מחזוריות banding של קולגן הטבעי וFLS, או את התכונות העדינות של קולגן SLS. זה גם רעיון טוב לבדוק לפחות בשני אזורים אחרים במדגם קולגן כדי לוודא שהסריקות הראשוניות הן מייצגות.

<ol>
	<li>Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+at+a+glance.">Collagen at a glance.</a> J. Cell Sci. 120, 1955-1958 (2007).</li><li>Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+Collagen+Characterization+for+Bio+Studies.">Guide to Collagen Characterization for Bio Studies.</a> J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).</li><li>Baselt, D. R., Revel, J. -. P., Baldeschwieler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfibrillar+Structure+of+Type+I+Collagen+Observed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Subfibrillar Structure of Type I Collagen Observed by Atomic Force Microscopy.</a> Biophys. J. 65, 2644-2655 (1993).</li><li>Petruska, J. A., Hodge, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subunit+Model+for+Tropocollagen+Macromolecule.">A Subunit Model for Tropocollagen Macromolecule.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51, 871-876 (1964).</li><li>Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Pattern+in+Native+Collagen.">Molecular Pattern in Native Collagen.</a> Nature. 219, 157-158 (1968).</li><li>Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+collagen+from+connective+tissue+by+neutral+salt+solutions.">Extract of collagen from connective tissue by neutral salt solutions.</a> PNAS. 41, 1-7 (1955).</li><li>Gale, M., Pollanen, M. S., Markiewicz, P., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+assembly+of+collagen+revealed+by+atomic+force+microscopy.">Sequential assembly of collagen revealed by atomic force microscopy.</a> Biophys. J. 68, 2124-2128 (1995).</li><li>Wood, G. C., Keech, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+fibrils+from+collagen+solutions.">The formation of fibrils from collagen solutions.</a> Biochem. J. 75, 588-597 (1960).</li><li>Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+Fibril+formation.">Collagen Fibril formation.</a> J. Biol. Chem. 253, 6578-6585 (1978).</li><li>Holmes, D. F., Capaldi, M. J., Chapman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+collagen+fibrils+in+vitro;+the+assembly+process+depends+on+the+initiating+procedure.">Reconstitution of collagen fibrils in vitro; the assembly process depends on the initiating procedure.</a> Int. J. Biol. Macromol. 8, 161-166 (1986).</li><li>Paige, M. F., Rainey, J. K., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrous+long+spacing+collagen+ultrastructure+elucidated+by+atomic+force+microscopy.">Fibrous long spacing collagen ultrastructure elucidated by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 3211-3216 (1998).</li><li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+mucoprotein+with+soluble+collagen;+an+electron+microscope+study.">The interaction of mucoprotein with soluble collagen; an electron microscope study.</a> PNAS. 37, 286-291 (1951).</li><li>Ghadially, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ultrastructural pathology of the cell and matrix. , (1988).</li><li>Paige, M. F., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+and+assembly+of+segmental+long+spacing+collagen+studied+by+atomic+force+microscopy.">Ultrastructure and assembly of segmental long spacing collagen studied by atomic force microscopy.</a> Micron. 74, 355-361 (2001).</li><li>Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+particle+type+in+certain+connective+tissue+extracts.">A new particle type in certain connective tissue extracts.</a> PNAS. 39, 459-470 (1953).</li><li>Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+segment-long-spacing+crystallites:+their+role+in+collagen+fibrillogenesis.">Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis.</a> PNAS. 76, 313-317 (1979).</li><li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+observations+of+certain+fibrous+structures+obtained+from+connective+tissue+extracts.">Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts.</a> JACS. 72, 3321-3322 (1950).</li><li>Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O+prokollagene+kohzi.">O prokollagene kohzi.</a> Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).</li><li>Lin, A. C., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+ultrastructure+of+fibrous+long+spacing+collagen+by+parallel+atomic+force+and+transmission+electron+microscopy.">Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy.</a> Proteins. 49, 378-384 (2002).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

המטוהרים מונומר קולגן הוא יציב ב-pH וטמפרטורה הנמוכים וההיווצרות של סיבי הקולגן ילידים למעשה כרוכה העלאת pH והטמפרטורה של פתרון מונומר קולגן. הליכים לכינון מחדש של סיבי הקולגן מפוספסים ממונומרים קיימים כבר יותר מ 50 שנים. ההליך שהמעבדה שלנו משמשת במחקרים הראשונים שלנו עם קולגן לפני 15 שנה 7 התבססה על נהלים סכם צ&#39;פמן ועמיתים לעבודה בשנת 1986 10. התנאים להיווצרות קולגן ליפון שבעבודה הקודמת היו 0.18 מ&quot;ג / מיליליטר מונומר קולגן בNa 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (אני = 0.2, pH 7.4) חיץ ב34 ° C. החסרון של זה ונהלים אחרים שניסינו הוא שיש תמיד סיבי unbanded נוצרו לצד הסיבים המפוספסים הרצויים. התנאים החדשים שלנו הם ~ 0.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מונומר קולגן בפוספט 100 מ&quot;מימ וKCl 100 מ&quot;מימ בשעת 7 pH השאיר על 37 מעלות צלזיוס למשך שעות 3-4. Proceדורה מתוארת כאן שונה בכל היבט מההליך קודם להכנת סיבי הקולגן ילידים. אבל רוב ניכר, הכפלנו את הכח היוני על ידי העלאת ריכוז החיץ והוסיף KCl mM 100. העלייה בתוצאות חוזק יוניות במבנה אחיד יותר של סיבי הקולגן חברו באופן בלעדי. מניסיוננו, הפעמים היחידות שהליך זה לא מיוצר קולגן סוג היליד הייתה כאשר פתרון מונומר קולגן היה עובר את התאריך המומלץ של יצרן שימוש. כאשר זה קורה, מה שנצפה נע בין סיבים פחות שכולם unbanded לסיבים רבים עדיין נצפו אך ברובה unbanded. שימו לב שמונומר קולגן שפג תוקף יכול לעתים עדיין ניתן להשתמש בהצלחה כדי להפוך את הקולגן טבעי, אבל כאשר הוא נכשל, מונומר קולגן החדש בהחלט צריך לרכוש. FLS זוהה לראשונה על ידי Highberger et al. 17 בהכנות קולגן יזוכה Orekhovich et al. 18. מחקרים נוספים הובילו Highberger ושמיט למסקנה שזה היה גליקופרוטאין α1 חומצה שמקדם את ההיווצרות של 12 FLS. היינו מאוחר מסוגל לשכפל את ההליך להכנת קולגן FLS על ידי שילוב של מונומר קולגן הזמין מסחרי וגליקופרוטאין α1 חומצה ב-pH הנמוך ולאט הרשה pH לעלות ב dialyzing התערובת נגד מים ל24 11 שעות. כעת אנו מציגים שינוי של הליך זה על ידי dialyzing מונומר קולגן נגד מים הראשונים ופשוט משלב את זה עם גליקופרוטאין α1 חומצה במים ליצירה קולגן FLS. התנאים לFLS קולגן הרכבה המתואר כאן הם הרבה פחות זמן רב. מונומר קולגן עדיין צריך להיות טרום דיאליזה נגד מים, אבל אפשר לעשות את זה בכמויות גדולות ואז מאוחסן ב 4 ° C ביציבות עד שימוש בו. תשואות זה נוהל חדשה ברובה Fls סיבי הקולגן מפוספסים. מניסיוננו, α1 החומצה Glycoחלבון עם תכולת חלבון ומים משולבות נמוכה יותר, ועל ידי תכולת סוכר גבוהה היקש, הוא קריטי ליצירת סיבי Fls בהצלחה. אנחנו בדרך כלל לבדוק עם היצרן שהרבה גליקופרוטאין α1 החומצה אנו משתמשים יש% תכולת חלבון ומים משולבות של 82 או פחות. וכמו בנוהל לסינתזת הקולגן טבעית, מונומר קולגן שהיא מבוגר מדי יכול גם לגרום לכישלון לייצר קולגן FLS. בנוסף, את הטוהר של המים המשמשים לדיאליזה הוא קריטי בהליך זה. לדוגמה, דיאליזה של מונומר קולגן נגד אף ~ 8 MΩ.cm במקום&gt; תוצאות מים 18 MΩ.cm בפתרון קולגן שלא יוצר קולגן FLS. מהשלושה סוגי יפון קולגן, הקל ביותר לעשות הוא קולגן SLS. ההכנה המוקדמת SLS תוארה על ידי שמיט ועמיתים לעבודה 15. אנחנו פרסמנו adaption של הליך זה לפני 12 שנים להכנת קולגן SLS באמצעות coll הזמין מסחריAgen 14. ההליך פשוט כרוך בשילוב 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל ATP ו 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מונומר קולגן ב0.05% (v / v) חומצה אצטית ב-pH 3.5, ומשאיר את התערובת בטמפרטורת חדר למשך הלילה. מניסיוננו, ההיבט הקריטי של הרכבת SLS שחייב להיות מבוקרים הוא pH של תמיסת התגובה. SLS התאסף בתנאים יותר בסיסיים (pH ~ 3.6-3.9) תוצאות בגושים מצטברים של crystallites. תנאים יותר חומציים (pH ~ 2.9-3.2) תוצאות בcrystallites הרזה, יותר מאשר אלה מופרדים התאספו בתנאים האידיאליים של pH 3.3-3.5. PHS תגובה מחוץ לטווח זה (&lt;2.8 ו&gt; 4) לא מניב כל קולגן SLS. בעבר, כוונן את ה-pH של תערובת התגובה על ידי התוספת של חומצה אצטית. כדי לפשט את ההליך עוד יותר, בכתב היד הזה שהצגנו חיץ גליצין-HCl לשלוט חומציות. השלושה המבנים השונים נוצרו קולגן מהפרוטוקולים שתוארו לעיל יש אופיתכונות שהתאימו ניתן להבחין רק באמצעות מכשירים לרזולוציה של ננומטר. קולגן יליד וFLS מתאפיין banding periodicities של ~ 67 ננומטר ו ~ 270 ננומטר. הממד הארוך ביותר של קולגן SLS הוא רק ~ 360 ננומטר. יש לנו מתואר במפורש כיצד אנו משתמשים AFM לאפיין שלושה מבני הקולגן השונים. עם זאת, כל הפעלת AFM במגע או במצב קשר רציף עם כל AFM חללית ש&lt; רדיוס 10 ננומטר צריכה גם להיות מסוגלת לתמונת מבני הקולגן אלה. בנוסף, מיקרוסקופי אלקטרונים יכול להיות ונעשה שימוש כדי לאפיין מבני הקולגן אלה 19. היתרון העיקרי של הליכים אלה הוא שהם מייצרים בעיקר קולגן הרצוי לבנות. הצורה האחרת של קולגן רק כי הוא נמצא בתגובות האלה היא מונומר מתחיל, אשר לעתים קרובות נראה ברקע של תמונות AFM. במקרה של קולגן הטבעי וFLS, ניתן להפריד בקלות מרוב unreaמונומר cted ידי צנטריפוגה ושטיפה חוזרות והנשנים של ילידים וכתוצאה או FLS קולגן גלולה עם מים. יש לנו הצגנו נהלים פשוטים ואמינים להכנה, FLS ילידים וקולגן SLS תוך שימוש בחומרים מתקדמים, זמינים מסחרי החל. מונומר הקולגן משמש בכל הליכים אלה זמין מסחריים בצורה מטוהרת. גליקופרוטאין α1 חומצה ו-ATP גם שניהם זמינים באופן מסחרי.

קולגן הוא קבוצה של חלבונים מבניים שמבנה סליל משולש שנוצר משלוש רשתות פוליפפטיד. מונומרים סליל משולשים אלה נוספות להרכיב באופן היררכי בצורת מבנים הולכים וגדל. יש לפחות 28 סוגי קולגן שונים גנטי שזוהו 1. שילוב, collagens לפצות 30% מהחלבון הכולל למצוא חיות, עם סוג I חשבונאי צורה הבולטת לעד 90% מכלל חלבוני קולגן 2. קולגן אני מקליד נמצא כמבני fibrillous בעור, רצועות, גידים ועצמות. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM) תמונות של סוג I סיבי קולגן ילידים בדרך כלל מראה banding עם תקופה אופיינית ~ 67 ננומטר (המכונה לעתים קרובות D-banding) 3-5. הקלד אני מונומר קולגן הוא heterotrimer משולש סליל מורכב מα1 2 זהים (I) שרשרות ו1 α2 (אני) שרשרת, כל אחד יותר מאלף חומצות אמינו ארוך. הוא ארוך ודק עם ממדים של 300 ננומטר באורך 1.4 ננומטרים בקוטר. הקלד אני מונומר קולגן ניתן להשיג בקלות על ידי פירוק מבנים גבוהים יותר סדר שנוצרו באופן טבעי 6. אנחנו 7 ורבים 8-10 אחרים הראינו כי אובניים בניין מונומר המסיס אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לשחזר סיבי D-מפוספסים במבחנה (איור 1). בנוסף לסיבי הקולגן ילידים, שני מבני הקולגן אחרים גבוהים יותר סדר נמצאו כדי ליצור במבחנה באמצעות אותה אבן בניין מונומר. שני המבנים הם מרווח סיבי ארוך (FLS) וריווח ארוך מגזרי (SLS) קולגן (איור 1). FLS קולגן הוא מבנה fibrillous כמו קולגן הטבעי, אך מאופיין במחזוריות banding גדולה יותר קולגן יליד 11. במבחנה, קולגן FLS נוצר, כאשר מונומר קולגן הוא בשילוב עם חומצת גליקופרוטאין α1 <suעמ &#39;&gt; 12. קולגן FLS נצפה בחי, כמו גם, אם כי לעתים רחוקות 13. קולגן SLS מתואר כcrystallites כי מונומרים מיושרים בקופה כמו בסריג הגבישי 14. קולגן SLS נוצר, כאשר מונומר הקולגן משולב עם אדנוזין טריפוספט (ATP) 15. קולגן SLS טבעי נצפה במדיום התרבות של fibroblasts אך לא בדגימות רקמה שחולצה, ככל הנראה בשל הגודל והמחסור בתכונות הנבדלות טופוגרפיות 16 קטנים. המטרה של כתב יד זה היא להציג נהלים מפורטים להכנת סיבי הקולגן יליד כFLS גם וקולגן SLS שגם החוקר המנוסה ביותר יכול להתרבות. שימוש בחומרים מתקדמים החל מסחרי זמינים, יש לנו ניסינו לעשות את הפרוטוקולים פשוט ככל האפשר, ועדיין יש להם לעבוד באופן מהימן. אנחנו גם פירוט כיצד להשתמש AFM כדי לאפיין את מבנה קולגן השונהזה שהם עשו. עבודה זו תהיה מועילה לחוקרים שרוצים ללמוד אחד או יותר ממבנים מסדר הגבוהים יותר קולגן אלה ו / או להשתמש בם כמבשרים ביישומים אחרים, אבל כרגע חוסר של המומחיות או פשוט לא רוצה לעבוד עם דגימות רקמה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר / מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> הקלד אני מונומר קולגן (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) </td><td> Inamed המתקדם Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> הרבה 1261443 (2.9 מ&quot;ג / מ&quot;ל, pH 2.1) הרבה 1629346 (3.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 2.1 pH) הרבה 6006 (3.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 2.1 pH) </td></tr><tr><td> ה-ATP </td><td> Biochemicals המחקר הבינלאומי </td><td> -141 </td><td> הרבה FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1 החומצה גליקופרוטאין מפלזמת שור </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G3643 </td><td> הרבה 051K7440 (89.8%) הרבה 011K7410 (82%) הרבה 065K7405 (71.2%) הרבה 063K7495 (71.9%) הרבה 117K7535 (75.9%) (+ תכולת מי חלבון) </td></tr><tr><td> glycopr A1 חומצהotein מפלזמה האנושית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G9885 </td><td> הרבה 128H7606 (70.9%) הרבה 049K7565V (68%) (+ תכולת מי חלבון) </td></tr><tr><td> תציץ </td><td> טד פלה </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - הסיליקון SPM-חיישן </td><td> Nanoworld </td><td> NHC </td><td> הסיליקון AFM בדיקה שאנו משתמשים למצב מגע לסירוגין </td></tr><tr><td> טיפי Nanoprobe Veeco </td><td> Veeco (עכשיו בדיקות Bruker AFM) </td><td> NP-S </td><td> חללית AFM סיליקון ניטריד שאנו משתמשים למצב קשר </td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen

סיבי הקולגן קיימים במטריקס מרקמות בעלי חיים כדי לספק פיגומים מבניים וחוזק מכאני. סיבי הקולגן ילידים אלה יש מחזוריות פסים אופיינית ל~ 67 ננומטר ונוצרים בגוף חי באמצעות ההרכבה ההיררכית של I מונומרים קולגן סוג, שהם 300 ננומטר באורך 1.4 ננומטרים בקוטר. במבחנה, על ידי שינוי התנאי של אובניים בניין מונומר חשוף, מבנים ייחודיים הנעים בסולמות באורך של עד 50 מיקרון ניתן לבנות, הכוללים לא רק סיבים מסוג מקומיים, אבל מרווח זמן גם סיבי קולגן וריווח הארוך המגזרי. בזאת, אנו מציגים הליכים להקמת השלושה מבני הקולגן השונים ממונומר קולגן הזמין מסחרי נפוץ. שימוש בפרוטוקולים שאנחנו ואחרים שפורסמו בעבר כדי להפוך את שלושת הסוגים האלה בדרך כלל להוביל לתערובות של מבנים. בפרט, סיבי unbanded היו נפוץ found עת ביצוע קולגן הטבעי, וסיבי ילידים נכחו לעתים קרובות בעת ביצוע קולגן מרווח הארוך סיבי. הנהלים החדשים אלה יש את היתרון של ייצור קולגן הסוג הרצוי יפון כמעט באופן בלעדי. ההיווצרות של המבנים המבוקשים מאומתת על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

קולגן Native תגובת התערובת של מונומר ~ 0.3 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן בפוספט 100 מ&quot;מימ וKCl 100 מ&quot;מימ ב-pH 7 השאיר על 37 מעלות צלזיוס למשך שעות 3-4 יניב פתרון המכיל סיבי הקולגן סוג ילידים עם ננומטר banding D-ברורים ~ 67, ללא סיבי unbanded. תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלת × 200, גושים של כמה סיבים ניתן בדרך כלל לראות במצע יציץ במיוחד כאשר נצפים על ידי ניגוד פער התערבות (DIC) מיקרוסקופי (איור 2). במדגם טיפוסי, 100 × 2 סריקה אקראית 100 מיקרומטר ידי AFM ניתן בדרך כלל לראות לפחות כמה סיבים שמיקרון ארוך 5-50 (איורי 3 א, ג). פרט, סיבי הקולגן מופרדים ניתן לזהות בקלות בשלב זה. עם 512 × 512 פיקסלים סריקת תמונה 2, התקרבות אל גודל 10 × 10 מיקרומטר סריקה 2 מראה שכל סיבי לימוד המאוחד (תרשימי 3d-f </strong&gt;). כדי למדוד במדויק מחזוריות banding, עדיף לזום של 2 × 2 2 גודל סריקת מיקרומטר (תרשימי 3G-i). Banding מחזוריות ניתן לקבוע על ידי מדידה פשוט וממוצע המרחק האורכי בין כמה פסגות או עמקים. לחלופין, אם התוכנה מאפשרת AFM, אחד פורה ממדי להפוך יחד חתך אורכים יכולים לשמש גם. איור 4 מראה תמונת גובה AFM של יפון וחתך אורכים מקביל. FLS קולגן תגובת התערובת של מ&quot;ג / מיליליטר גליקופרוטאין 1 μ1 חומצה ו~ מונומר 1 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן במים שנשארו בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות תניב פתרון של סיבי הקולגן Fls. גושים של סיבים, בדומה למה שרואה במקרה של קולגן הטבעי, ניתן לראות בקלות על פני המצע יציץ תחת מיקרוסקופ אופטי ב 200 מ &#39;×agnification. במדגם טיפוסי, אקראית 100 × 2 סריקה 100 מיקרומטר ידי AFM ניתן בדרך כלל לראות לפחות כמה סיבים. בגודל 512 × 512 סריקת פיקסל 2 תמונה, מחזוריות banding ניתן למדוד על ידי התקרבות ל10 × 10 מיקרומטר 2 סריקה (הציור 5a) או לייתר דיוק עם 2 × 2 מיקרומטר 2 סריקה (5 איור). האיור 5c תערוכות אורך חתך של FLS יפון. SLS קולגן תערובת התגובה של 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל ATP ו ~ 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מונומר קולגן במאגר 100 מ&quot;מימ גליצין-HCl ב-pH 3.3 השאיר בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות יניב פתרון של קולגן SLS. בדרך כלל, crystallites SLS לא יהיה גלוי תחת מיקרוסקופ אופטי. AFM נדרש לאשר את קיומו של crystallites SLS. במדגם טיפוסי, אקראית 100 × 2 סריקה 100 מיקרומטר ידי AFM ניתן בדרך כלל לראות רביםנקודות. ההתקרבות אל 10 × 2 סריקת מיקרומטר 10 יהיה בדרך כלל להראות כמה crystallites SLS (איור 6 א). ו2 × 2 מיקרומטר 2 סריקה (איור 6 ב) מציגה את המבנה העדין של גביש SLS. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> איור 1. השלוש הצורות מבניות השונות של סיבי הקולגן שיכול להיוצר במבחנה ממונומר קולגן. AFM תמונות המתארות מונומר קולגן ושלושה מבני קולגן מהסדר הגבוהים יותר כולם באותו הגודל בקנה המידה (2 × 2 מיקרומטר 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> איור 2. תמונה דיגיטלית ב ~ גדלת 200 × ידי מיקרוסקופיה אופטית דסק סיבי הקולגן ילידים ביציצו (א) לא נגע ו( ב) thresholded וחדד to להדגיש את הסיבים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> איור 3. AFM תמונות של סיבי הקולגן טבעיים ביציצו. תמונות לסירוגין מגע מצב AFM משרעת מוצגות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> איור 4. () 0.5 × 1 תמונה 2 מיקרומטר לסירוגין מגע מצב AFM גובה (בקנה מידה אנכי = 100 ננומטר) וכן (ב)-חתך אורך של קולגן ליפון ילידים. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> איור 5. AFM תמונות של סיבי הקולגן בFls יציץ. (א) 10 × 10 2 תמונת מצב מיקרומטר קשר AFM סטייה, (ב) 2 × 2 מיקרומטר 2 תמונת סטיית AFM מצב קשר ו( ג) אורכיםחתך של FLS קולגן ליפון. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> איור 6. AFM תמונות של קולגן SLS ביציץ. תמונות לסירוגין מגע מצב AFM משרעת מוצגות.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen at JoVE.com

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

נהלים פשוטים ולשעתק מתוארים לביצוע 3 אסיפות קולגן מבני מובחנות מסוג זמין מסחרי נפוץ אני מונומר קולגן. סוג ילידים, מרווח זמן סיבי קולגן או ריווח הארוך המגזרי ניתן לבנות על ידי שינוי התנאי שאת 300 ננומטר ארוך ובלוק 1.4 ננומטר קוטר מונומר בניין חשוף.

בסינתזת מבחנה של ריווח ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח המגזרי

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

in-vitro-synthesis-native-fibrous-long-spacing-segmental-long-spacing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

13.6K Views.  University of Toronto. נהלים פשוטים ולשעתק מתוארים לביצוע 3 אסיפות קולגן מבני מובחנות מסוג זמין מסחרי נפוץ אני מונומר קולגן. סוג ילידים, מרווח זמן סיבי קולגן או ריווח הארוך המגזרי ניתן לבנות על ידי שינוי התנאי שאת 300 ננומטר ארוך ובלוק 1.4 ננומטר קוטר מונומר בניין חשוף.

Video: In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-שכבתית Electrospinning לחקות ארכיטקטורה העורקים באמצעות שפת Polycaprolactone, אלסטין, קולגן ו: מחקר ראשוני

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung3. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke4. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke14. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine8. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively11,13

Spin-trapping ESR spectroscopy was used to study the effect of plant antioxidants lycopene, pycnogenol and grape seed extract on scavenging gas-phase free radicals in cigarette smoke.

פרוטוקול לאיתור גז הדחה בשלב רדיקלים חופשיים עשן סיגריות רגילה

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

באתר טוען לחיצה והדמיה לא פולשנית המצטרף של רצועת שן עצם חניכיים סיבית המשותפת

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

ניצול של זיזי סיליקון המיקרוסקופים כדי להעריך את התפקוד נייד התכווצות<em&gt; במבחנה</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

ייצור של מעבר צבע Nanopattern על ידי טכניקת Nanoimprinting תרמית והקרנת התגובה של תאים אנושיים המושבה יוצרי אנדותל

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...