Nos gustaría dar las gracias a todos los pasado muchos estudiantes de pregrado, postgrado y postdoctorado que han contribuido con su tiempo y esfuerzo al estudio de la fibrogénesis colágeno en nuestro laboratorio. Las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá ha proporcionado fondos para continuamente nuestros estudios de colágeno.

NOTA: El agua usada en todos los protocolos tiene una resistividad&gt; 18 MΩ.cm. 1. Las fibrillas de colágeno nativo <ol><li> Combinar 6 l de agua, 20 l de 200 mM Na 2 HPO 4 ajustó a pH 7 con HCl y 10 l de 400 mM de KCl en un tubo de microcentrífuga y se mezcla. </li><li> Añadir 4 l de colágeno monómero (~ 3 mg / ml en HCl 0,01 N) para el tubo de microfuga y se mezcla. La solución debe ser transparente e incolora. </li><li> Colocar el tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla de reacción en un bloque de calor que ha sido precalentada a 37 ° C y se deja durante 3 a 4 horas. En este punto, la solución debe ser ligeramente turbia y contiene principalmente fibras de colágeno nativas. </li></ol> 2. El colágeno fibroso Espaciamiento Long <ol><li> Dializar 1 ml de colágeno monómero (~ 3 mg / ml en HCl 0,01 N) utilizando 12-14 kDa membrana MWCO contra 400 ml de agua, cambiando el agua cuatro veces durante un período de 24 horas a temperatura ambiente. El dializado collagmonómero en que no se utiliza de inmediato se puede almacenar a 4 ° C para su uso futuro. </li><li> Combinar 20 l de agua, 20 l de 3 mg / ml α1-glicoproteína ácida en agua y 20 l de monómero de colágeno dializado en un tubo de microcentrífuga. La solución debe ser transparente e incolora. </li><li> Deje el tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 min. En este punto, la solución debe ser turbia y contienen fibrillas de colágeno predominantemente de FLS. </li></ol> 3. El colágeno segmentaria Espaciamiento Long <ol><li> Combinar 67 l de agua, 60 l de 100 mM de glicina-HCl a pH 3,3 y 40 l de 10 mg / ml ATP en agua en un tubo de microcentrífuga y se mezcla. </li><li> Añadir 33 l de colágeno monómero (~ 3 mg / ml en HCl 0,01 N) para el tubo de microfuga y se mezcla. La solución debe ser transparente e incolora. </li><li> Deje el tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 h. En este punto, la solución todavía tiene un aspecto transparente, pero deberíacontienen colágeno principalmente SLS. </li></ol> 4. Caracterización AFM <ol><li> Cleave la superficie de una pieza de mica unido a un sustrato AFM cubriendo la superficie de la mica con un trozo de cinta adhesiva y luego retirándola. Compruebe la cinta después para confirmar que toda la capa de mica se escindió con el fin de reducir las irregularidades en la superficie y asegurar que la muestra se retira el viejo si la mica está siendo reutilizada. </li><li> Aplicar 20 ml de la solución de colágeno fibrilar al sustrato de mica recién cortado. Dejar durante 5 min. </li><li> Enjuague suavemente de solución de colágeno fibrilar con agua. Es aconsejable no aplicar el agua directamente sobre el centro del sustrato de mica pero en el borde y para permitir que fluya a través de la muestra. </li><li> Secar la superficie con una ligera corriente de nitrógeno gas. Es aconsejable para dirigir la corriente en el borde y no en el centro del sustrato de mica. </li><li> Bajo un microscopio óptico con un aumento de × 200,las muestras de colágeno nativo y FLS debe mostrar grupos de fibrillas. Colágeno SLS no será visible. </li><li> Las características únicas de los tres diferentes estructuras de colágeno son observables por AFM. Por lo general, las fibrillas de colágeno de imágenes nativas con un AFM en modo de contacto intermitente con sondas de AFM de silicio, mientras FLS y el colágeno SLS fibrillas solemos imagen con un AFM en modo de contacto con nitruro de silicio sondas de AFM. Lo hacemos por falta de tiempo y coste. Sondas de AFM de silicio son generalmente más nítida que de nitruro de silicio sondas de AFM, que los hacen particularmente útiles para la formación de imágenes de la estructura de bandas estrechas de las fibrillas de colágeno nativo. Sin embargo, las sondas de AFM de silicio son mucho más propensos a la contaminación por las muestras de colágeno de nitruro de silicio sondas de AFM y necesitan sustituirse con frecuencia. Por lo tanto, nos reservamos el uso de sondas de AFM de silicio principalmente por fibrillas de colágeno de imágenes nativas donde la resolución es una necesidad mayor y operamos en el modo de contacto intermitente a prolOng su vida de utilidad. </li></ol> Se recomienda una inicial de 100 × 100 m 2 scan que debe mostrar al menos unos pocos construcciones de colágeno. A partir de ahí, acercar a escanear tamaños de 10 × 10 micras 2 y luego 2 x 2 m 2 para observar la periodicidad de bandas de colágeno nativo y FLS, o sus más finos de un colágeno SLS. También es una buena idea para comprobar al menos otras dos regiones en la muestra de colágeno para verificar que las exploraciones iniciales son representativos.

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No hay conflictos de interés declarado.

Purificó monómero de colágeno es estable a pH bajo y la temperatura y la formación de fibrillas de colágeno nativas esencialmente consiste en elevar el pH y la temperatura de la solución de monómero de colágeno. Procedimientos para la reconstitución de las fibrillas de colágeno en bandas a partir de monómeros han existido durante más de 50 años. El procedimiento que nuestro laboratorio utilizado en nuestros primeros estudios con colágeno hace 15 años 7 se basa en los procedimientos resumidos por Chapman y colaboradores en 1986 10. Las condiciones para la formación de fibrillas de colágeno en ese trabajo anterior fueron 0,18 mg / ml de monómero de colágeno en Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) a 34 ° C. El inconveniente de este y otros procedimientos que hemos tratado es que hay fibrillas siempre sin anillo formados junto a las fibrillas deseadas en bandas. Nuestras nuevas condiciones son ~ 0,3 mg / ml de colágeno en monómero de fosfato 100 mM y KCl 100 mM a pH 7 a la izquierda en 37 ° C durante 3-4 horas. El procedimiento descrito en este documento difiere en cada aspecto del procedimiento anterior para la fabricación de fibrillas de colágeno nativas. Pero más notablemente, hemos duplicado la fuerza iónica mediante el aumento de la concentración de tampón y la adición de 100 mM KCl. El incremento en los resultados de la fuerza iónica en la formación más consistente de las fibrillas de colágeno exclusivamente en bandas. En nuestra experiencia, las únicas veces que este procedimiento no ha producido colágeno tipo nativo fue cuando la solución de monómero de colágeno ya había pasado la fecha recomendada por el fabricante de su uso. Cuando ocurre esto, lo que se observa a partir de los rangos menos fibrillas que están anillados a fibrillas muchos todavía observados pero sin anillo predominantemente. Tenga en cuenta que el monómero de colágeno caducada puede a menudo todavía se utiliza con éxito para producir colágeno nativo, pero cuando falla, monómero de nuevo colágeno sin duda debe ser comprado. FLS fue identificado por primera vez por Highberger et al. 17 en preparaciones de colágeno acreditado a Orekhovich et al. 18. Otros estudios llevó Highberger y Schmitt a la conclusión de que era α1-glicoproteína ácida que promueve la formación de FLS 12. Nos fueron posteriormente capaz de replicar el procedimiento para la fabricación de colágeno FLS mediante la combinación de monómero de colágeno comercialmente disponibles y α1-glicoproteína ácida a pH bajo y lentamente permitiendo que el pH suba por diálisis de la mezcla frente a agua durante 24 hr 11. Presentamos ahora una modificación de dicho procedimiento por diálisis del colágeno contra monómero de agua primero y simplemente se combina con α1-glicoproteína ácida en agua para formar colágeno FLS. Las condiciones para FLS colágeno conjunto descrito aquí son mucho menos tiempo. El monómero de colágeno todavía tiene que ser pre-dializada contra agua, pero se puede hacer en grandes cantidades y después se almacenó a 4 ° C de forma estable hasta que se usa. Este nuevo procedimiento se produce predominantemente FLS fibrillas de colágeno en bandas. Desde nuestra experiencia, α1-glucoproteína ácidaproteína con un menor contenido combinado de proteínas y agua, y por inferencia más alto contenido de azúcar, es crítico para el éxito de toma de fibrillas de FLS. Por lo general consulte con el fabricante de que el lote glicoproteína α1-ácido que utilizamos tiene un% combinada contenido de proteína y agua de 82 o menos. Y, como con el procedimiento para la síntesis de colágeno nativo, el monómero de colágeno que es demasiado viejo también puede resultar en la falta de producir colágeno FLS. Además, la pureza del agua utilizada para la diálisis es crítica en este procedimiento. Por ejemplo, la diálisis de monómero de colágeno incluso en contra de ~ 8 MΩ.cm en lugar de&gt; 18 resultados MΩ.cm agua en una solución de colágeno que no se formará colágeno FLS. De los tres tipos de colágeno fibrilar, lo más fácil de hacer es el colágeno SLS. La primera preparación de SLS fue descrito por Schmitt y colaboradores-15. Hemos publicado una adaptación de este procedimiento hace 12 años para la fabricación de colágeno SLS utilizando coll disponible en el mercadoAgen 14. El procedimiento consistía simplemente en la combinación de 2 mg / ml ATP y 0,5 mg / ml de monómero de colágeno en 0,05% (v / v) de ácido acético a pH 3,5, y dejando la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. En nuestra experiencia, el aspecto crítico del conjunto de SLS que debe ser controlado es el pH de la solución de reacción. SLS montada en condiciones más básicas (pH ~ 3.6 a 3.9) resulta en grupos agregados de cristalitos. Condiciones ácidas (pH 2.9 a 3.2 ~) resulta en cristales más finos, más separados que los reunidos en las condiciones ideales de pH 3.3-3.5. PH de reacción fuera de este rango (&lt;2,8 y&gt; 4) no producen ningún colágeno SLS. En el pasado, se ajustó el pH de la mezcla de reacción mediante la adición de ácido acético. Para simplificar el procedimiento aún más, en este manuscrito se introduce un tampón de glicina-HCl para controlar el pH. Las tres estructuras diferentes de colágeno formadas a partir de los protocolos descritos anteriormente tienen caráctercaracterísticas realistas que sólo se puede discernir por instrumentos capaces de resolución nanométrica. Colágeno nativo y FLS se caracterizan por bandas periodicidades de ~ 67 nm y ~ 270 nm. La dimensión más larga de colágeno SLS es sólo ~ 360 nm. Hemos descrito específicamente cómo utilizar un AFM para caracterizar las tres estructuras diferentes de colágeno. Sin embargo, cualquier operación AFM en modo de contacto o contacto intermitente con cualquier sonda AFM que tiene &lt;10 nm radio también debe ser capaz de imagen de estas estructuras de colágeno. Además, la microscopía electrónica puede ser y ha sido utilizado para caracterizar estas estructuras de colágeno 19. La principal ventaja de estos procedimientos es que producen predominantemente el colágeno deseado construir. La única otra forma de colágeno que se encuentra en estas reacciones es el monómero de partida, que es a menudo visible en el fondo de las imágenes de AFM. En el caso del colágeno nativo y FLS, que puede ser fácilmente separada de la mayor parte de la unreamonómero CTED por centrifugación repetida y lavado de la nativo resultante o FLS colágeno precipitado con agua. Hemos presentado procedimientos simples y fiables para la fabricación de FLS nativos, y el colágeno SLS utilizando materiales avanzados, la partida comercialmente disponibles. El monómero de colágeno utilizado en todos estos procedimientos se encuentra comercialmente disponible en una forma purificada. α1-glicoproteína ácida y ATP también son ambos disponibles comercialmente.

El colágeno es una clase de proteínas estructurales que tienen una estructura de triple hélice formada a partir de tres cadenas polipeptídicas. Estos monómeros helicoidales triples además montar en un modo jerárquico para formar estructuras cada vez más grandes. Existen al menos 28 tipos de colágeno genéticamente distintos que se han identificado 1. Combinados, los colágenos representan el 30% de la proteína total que se encuentra en los animales, con el tipo I de la contabilidad forma predominante de hasta el 90% del total de 2 proteínas de colágeno. El colágeno tipo I se encuentra como estructuras fibrillous en piel, ligamentos, tendones y huesos. Microscopio de fuerza atómica (AFM) y microscopía electrónica (EM) imágenes de tipo I, fibras de colágeno nativo típicamente muestran bandas con un período característico de ~ 67 nm (a menudo denominado D-bandas) 3-5. Monómero de colágeno de tipo I es una triple helicoidal heterotrímero que consta de dos α1 idénticos (I) y un cadenas α2 (I) de la cadena, cada uno de más de unmiles de aminoácidos de longitud. Es largo y delgado, con dimensiones de 300 nm de longitud y 1,4 nm de diámetro. Monómero de colágeno de tipo I se pueden obtener fácilmente por descomponerse naturalmente formadas estructuras de orden superior 6. Nos 7 y 8-10 muchos otros han demostrado que estos bloques de construcción de monómeros solubles entonces se puede utilizar para reconstruir D-banded fibrillas in vitro (Figura 1). Además de las fibrillas de colágeno nativas, otras dos estructuras de mayor orden de colágeno se han encontrado para formar in vitro usando el bloque de monómero mismo edificio. Las dos estructuras están espaciando fibroso largo (FLS) y el espaciamiento segmentaria largo (SLS) de colágeno (Figura 1). FLS colágeno es una construcción fibrillous como el colágeno nativo, pero se caracteriza por una mayor periodicidad de bandas de colágeno nativo 11. In vitro, el colágeno FLS se forma cuando el monómero de colágeno se combina con glicoproteína α1-ácido <sup&gt; 12. Colágeno FLS se ha observado in vivo también, aunque raramente 13. Colágeno SLS se describe como cristalitos porque los monómeros están alineadas en el registro como en una red cristalina 14. SLS colágeno se forma cuando el monómero de colágeno se combina con el trifosfato de adenosina (ATP) 15. Colágeno de origen natural SLS se ha observado en el medio de cultivo de los fibroblastos, pero no en muestras de tejido extraídas, probablemente debido a su pequeño tamaño y falta de características topográficas distinguibles 16. El objetivo de este manuscrito es presentar procedimientos detallados para la fabricación de fibrillas de colágeno nativas como FLS así SLS y el colágeno que incluso el investigador más inexperto puede reproducir. El uso de materiales avanzados disponibles en el mercado de partida, hemos tratado de hacer que los protocolos tan simples como sea posible y todavía les funciona correctamente. También detalle cómo utilizar un AFM para caracterizar la estructura de colágeno diferentes que se hacen. Este trabajo será beneficioso para los investigadores que deseen estudiar una o más de estas estructuras de colágeno de orden superior y / o los usan como precursores en otras aplicaciones, pero en la actualidad carecen de la experiencia o simplemente no desean trabajar con muestras de tejido.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Monómero de colágeno tipo I (~ 3 mg / ml en HCl 0,01 N) </td><td> Inamed Advanced Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> Lote 1261443 (2,9 mg / ml, pH 2,1) Lote 1629346 (3,2 mg / ml, pH 2,1) Lote 6006 (3,2 mg / ml, pH 2,1) </td></tr><tr><td> ATP </td><td> Bioquímicos internacionales de investigación </td><td> A-141 </td><td> Lote FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1-glicoproteína ácida a partir de plasma bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3643 </td><td> Lote 051K7440 (89,8%) Lote 011K7410 (82%) Lote 065K7405 (71,2%) Lote 063K7495 (71,9%) Lote 117K7535 (75,9%) (Proteína + contenido de agua) </td></tr><tr><td> A1-ácido glycoprOtein partir de plasma humano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9885 </td><td> Lote 128H7606 (70,9%) Lote 049K7565V (68%) (Proteína + contenido de agua) </td></tr><tr><td> mica </td><td> Ted Pella </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - Silicon SPM-Sensor </td><td> Nanomundo </td><td> NHC </td><td> Sonda de AFM de silicio que se utiliza para el modo de contacto intermitente </td></tr><tr><td> Veeco Consejos Nanoprobe </td><td> Veeco (Ahora Bruker sondas de AFM) </td><td> NP-S </td><td> El nitruro de silicio Sonda de AFM que utilizamos para el modo de contacto </td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen

Las fibrillas de colágeno están presentes en la matriz extracelular del tejido animal para proporcionar andamiaje estructural y resistencia mecánica. Estas fibrillas de colágeno nativas tienen una periodicidad característica de bandas de ~ 67 nm y se forman in vivo a través del conjunto jerárquico de monómeros de colágeno de tipo I, que son 300 nm de longitud y 1,4 nm de diámetro. In vitro, mediante la variación de las condiciones a las que el bloques monoméricos de construcción están expuestos, estructuras únicas en escalas de longitud que van hasta 50 micrómetros pueden ser construidos, incluyendo no sólo las fibrillas de tipo nativo, pero también espaciamiento largo y fibroso de colágeno segmentaria espaciamiento largo. Aquí, se presenta procedimientos para la formación de las tres estructuras diferentes de colágeno a partir de un monómero de colágeno disponible en el mercado común. Utilizando los protocolos que nosotros y otros han publicado en el pasado para hacer estos tres tipos conducen típicamente a mezclas de estructuras. En particular, las fibrillas anillados eran comúnmente found la hora de tomar colágeno nativo, y fibrillas nativas eran a menudo presentes al tomar colágeno fibroso espacio largo. Estos nuevos procedimientos tienen la ventaja de producir el tipo de fibrillas de colágeno deseado casi exclusivamente. La formación de las estructuras deseadas se verifica mediante formación de imágenes utilizando un microscopio de fuerza atómica.

Colágeno nativo La mezcla de reacción de 0,3 ~ monómero de colágeno mg / ml en fosfato 100 mM y KCl 100 mM a pH 7 a la izquierda en 37 ° C durante 3-4 horas dará lugar a una solución que contiene fibrillas de colágeno de tipo nativas con clara ~ 67 nm D-bandas, sin fibrillas anillados. Bajo un microscopio óptico con un aumento de × 200, los montones de fibrillas de varios puede ser normalmente se ve en el sustrato de mica en particular cuando se ven por contraste de interferencia diferencial (DIC) microscopía (Figura 2). En un ejemplo típico, una aleatoria 100 × 100 micras 2 exploración por AFM mostrará generalmente al menos unas pocas fibrillas que son 5-50 micras de largo (Figuras 3A-C). Individual, fibrillas separadas de colágeno pueden ser fácilmente identificados en esta etapa. Con un 512 × 512 scan píxel de la imagen 2, el zoom en un 10 × 10 micras tamaño de escaneo 2 muestra que todas las fibrillas son anillados (Figuras 3d-f </strong&gt;). Con el fin de medir con precisión la periodicidad de bandas, lo mejor es acercarse a un 2 × 2 m 2 Tamaño de escaneado (figuras 3g-i). Banding periodicidad puede ser determinado midiendo simplemente y promediando la distancia longitudinal entre varios picos o valles. Alternativamente, si el software AFM permite, una Fourier unidimensional transformar a lo largo de una sección transversal longitudinal también se puede utilizar. Figura 4 muestra una imagen de AFM de una altura de fibrillas y una correspondiente sección transversal longitudinal. FLS colágeno La mezcla de reacción de 1 mg / ml μ1-glicoproteína ácida y ~ 1 mg / ml de monómero de colágeno en agua se dejó a temperatura ambiente durante 30 min producirá una solución de fibrillas de colágeno FLS. Los grupos de fibrillas, de manera similar a lo que se observa en el caso del colágeno nativo, se puede ver fácilmente en el sustrato de mica con un microscopio óptico a 200 × magnification. En un ejemplo típico, un azar de 100 × 100 m 2 análisis por AFM suele mostrar por lo menos unas pocas fibrillas. Con un 512 × 512 píxeles 2 tamaño de imagen de exploración, la periodicidad de bandas se puede medir por el zoom en un 10 × 10 m 2 exploración (Figura 5a) o más exactamente con una 5c 2 × 2 m 2 exploración (Figura 5b). Figura muestra una sección transversal longitudinal de una fibrilla FLS. SLS colágeno La mezcla de reacción de 2 mg / ml y ATP ~ 0,5 mg / ml de monómero de colágeno en 100 mM de glicina-HCl a pH 3,3 se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas producirá una solución de colágeno SLS. Típicamente, los cristalitos de SLS no serán visibles bajo un microscopio óptico. Un AFM se requiere para confirmar la presencia de cristalitos de SLS. En un ejemplo típico, un azar de 100 × 100 m 2 análisis por AFM por lo general muestran muchospuntos. Ampliación en un 10 × 10 m 2 scan usualmente mostrarán varios cristalitos SLS (Figura 6a). Y un 2 × 2 m 2 análisis (Figura 6b) muestra la estructura más fina de un cristalito SLS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> Figura 1. Las tres formas estructuralmente diferentes de las fibrillas de colágeno que se pueden formar in vitro a partir de monómero de colágeno. AFM imágenes que representan monómero de colágeno y los tres mayores estructuras de colágeno orden todo en la escala del mismo tamaño (2 x 2 m 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> Figura 2. Imagen digital en ~ 200 × magnificación por microscopía óptica DIC de fibrillas de colágeno nativas en mica (a) sin tocar y (b) thresholded y afilado to resaltar las fibrillas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> Figura 3. AFM imágenes de fibrillas de colágeno nativo sobre mica. AFM de modo de contacto intermitente imágenes de amplitud se muestra. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> Figura 4. (A) 0,5 × 1 m 2 el modo de contacto intermitente AFM imagen de altura (escala vertical = 100 nm) y (b) sección transversal longitudinal de una fibrilla de colágeno nativo. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> Figura 5. Imágenes de AFM de fibrillas de colágeno FLS sobre mica. (A) 10 × 10 m 2 Contacto con el modo de imagen desviación AFM, (b) 2 × 2 m 2 Contacto con el modo de imagen AFM y desviación longitudinal (c)sección transversal de una fibrilla de colágeno FLS. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> Figura 6. Imágenes de AFM de colágeno SLS sobre mica. AFM de modo de contacto intermitente imágenes de amplitud se muestra.

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In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Los procedimientos simples y reproducibles se describen para hacer tres conjuntos de colágeno estructuralmente distintos de un tipo común disponible en el mercado que monómero de colágeno. Tipo nativo, el espaciamiento fibroso largo o colágeno segmentaria espaciamiento largo puede ser construido mediante la variación de las condiciones a las que los 300 nm de longitud y 1,4 nm de diámetro monómero bloque de construcción está expuesto.

La síntesis in vitro de Espaciado nativo, y colágeno fibroso Long Long segmentaria Espaciado

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

13.6K vistas.  University of Toronto. Los procedimientos simples y reproducibles se describen para hacer tres conjuntos de colágeno estructuralmente distintos de un tipo común disponible en el mercado que monómero de colágeno. Tipo nativo, el espaciamiento fibroso largo o colágeno segmentaria espaciamiento largo puede ser construido mediante la variación de las condiciones a las que los 300 nm de longitud y 1,4 nm de diámetro monómero bloque de construcción está expuesto.

Video: In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-capa electrospinning que imita la arquitectura nativa arterial con policaprolactona, elastina, colágeno y: un estudio preliminar

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Investigación

Bioingeniería

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung3. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke4. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke14. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine8. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively11,13

Spin-trapping ESR spectroscopy was used to study the effect of plant antioxidants lycopene, pycnogenol and grape seed extract on scavenging gas-phase free radicals in cigarette smoke.

Un protocolo para la detección y borrado en fase gaseosa radicales libres en el humo del cigarrillo Mainstream

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

In situ carga de compresión y de imágenes no invasiva correlativa del hueso-ligamento periodontal de dientes fibroso Conjunta

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

Utilización de microescala silicio voladizos para evaluar la función contráctil celular<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Dispositivo de proyección de imagen de vivo a largo plazo para mejor manipulación Experimental de larvas de pez cebra

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Muy largo leer la secuencia para el análisis de la DNA de Genomic entero

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...