Wir möchten uns bei allen die vielen vergangenen Diplomanden, Doktoranden und Post-Doktoranden, die ihre Zeit und Mühe dazu beigetragen haben, die Studie von Kollagen Fibrogenese in unserem Labor danken. The Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada hat sich kontinuierlich Finanzierung für unsere Kollagen Studien.

HINWEIS: Das Wasser in all den verwendeten Protokollen einen spezifischen Widerstand&gt; 18 MΩ.cm. Ein. Nativen Kollagenfibrillen <ol><li> Kombinieren 6 l Wasser, 20 ul 200 mM Na 2 HPO 4 auf pH 7 mit HCl und 10 ul 400 mM KCl in einem Mikrozentrifugenröhrchen und mischen. </li><li> Add 4 ul Kollagen Monomer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und mischen. Die Lösung sollte klar und farblos sein. </li><li> Platzieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Reaktionsgemisch in einem Heizblock, die auf 37 vorgewärmt ° C und lassen für 3 bis 4 Stunden. An diesem Punkt sollte die Lösung leicht trüb und enthalten im Wesentlichen nativen Kollagenfibrillen. </li></ol> 2. Faserigen Lange Spacing Collagen <ol><li> Dialysieren 1 ml Kollagen Monomer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) unter Verwendung von 12 bis 14 kDa MWCO Membran gegen 400 ml Wasser, wobei das Wasser viermal über einen Zeitraum von 24 h bei Raumtemperatur. Die dialysierte collagen Monomer, das nicht verwendet wird sofort bei 4 ° C für die zukünftige Verwendung gelagert werden. </li><li> Kombinieren Sie 20 ul Wasser, 20 ul von 3 mg / ml α1-saures Glykoprotein in Wasser und 20 ul dialysierten Kollagen Monomer in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Die Lösung sollte klar und farblos sein. </li><li> Verlassen das Mikrozentrifugenröhrchen enthaltend die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 30 min. An diesem Punkt sollte die Lösung trüb und enthalten überwiegend FLS Kollagenfibrillen. </li></ol> 3. Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen <ol><li> Kombinieren Sie 67 ul Wasser, 60 ul 100 mM Glycin-HCl-Puffer bei pH 3,3 und 40 ul 10 mg / ml ATP in Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen und mischen. </li><li> Hinzufügen 33 ul Kollagen Monomer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und mischen. Die Lösung sollte klar und farblos sein. </li><li> Verlassen das Mikrozentrifugenröhrchen enthaltend die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 2 Stunden. An diesem Punkt wird die Lösung noch klar erscheinen, sollte aberenthalten meist SLS Kollagen. </li></ol> 4. AFM Charakterisierung <ol><li> Spaltung der Oberfläche eines Stücks von Glimmer, der an einem Substrat durch AFM Abdecken der Glimmeroberfläche mit einem Stück Klebeband und dann Ablösen es weg. Überprüfen Sie das Band dann zu bestätigen, dass eine ganze Schicht von Glimmer gespalten wurde, um Unregelmäßigkeiten auf der Oberfläche zu reduzieren und sicherzustellen, dass die alte Probe entfernt wird, wenn der Glimmer wiederverwendet wird. </li><li> Übernehmen 20 ul der Kollagenfibrillen Lösung der frisch gespaltenen Glimmer-Substrat. Lassen Sie für 5 min. </li><li> Vorsichtig abwaschen Lösung von Kollagenfibrillen mit Wasser. Es ist ratsam, das Wasser nicht direkt auf das Zentrum des Glimmersubstrat aber am Rand anzuwenden und, damit es über die Probe zu fließen. </li><li> Trocknen Sie die Oberfläche unter einem leichten Stickstoffstrom. Es ist ratsam, den Strom am Rand und nicht in der Mitte des Glimmers Substrat zu richten. </li><li> Unter einem optischen Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung,die einheimischen und FLS Kollagen Proben sollten zeigen, Klumpen von Fibrillen. SLS Kollagen wird nicht sichtbar sein. </li><li> Die einzigartigen Eigenschaften der drei verschiedenen Kollagen-Strukturen werden durch AFM beobachtet werden. Generell haben wir Bild nativen Kollagenfibrillen mit einem AFM in Wackelkontakt Modus unter Verwendung von Silizium AFM-Sonden, während FLS und SLS Kollagenfibrillen wir in der Regel Bild mit einem AFM im Kontaktmodus mit Siliziumnitrid AFM-Sonden. Wir machen das wegen der Zeit und Kosten Überlegungen. Silicon AFM-Sonden sind in der Regel schärfer als Siliziumnitrid AFM-Sonden, die sie besonders nützlich für die Abbildung der schmaler Streifen der nativen Kollagenfibrillen zu machen. Jedoch sind Silicium AFM Sonden viel anfälliger gegenüber Verschmutzungen durch Kollagenproben als Siliziumnitrid AFM Sonden und müssen häufig ersetzt. Deshalb behalten wir uns die Verwendung von Silizium AFM-Sonden vor allem für bildgebende nativen Kollagenfibrillen, wo Auflösung eine größere Notwendigkeit und wir arbeiten in Wackelkontakt Modus prolong ihrer Lebenszeit der Nützlichkeit. </li></ol> Wir empfehlen zunächst eine 100 × 100 &amp;mgr; m 2 Scan, wenigstens ein paar Collagen Konstrukte zeigen sollte. Von dort weiter vergrößern zu scannen Größen von 10 x 10 um 2 und dann 2 × 2 um 2, um die Streifenbildung Periodizität von nativen und FLS Collagen oder die feineren Merkmale einer SLS Kollagen zu beobachten. Es ist auch eine gute Idee, mindestens zwei weitere Regionen auf der Kollagenprobe überprüfen, um sicherzustellen, dass die anfänglichen Scans repräsentativ sind.

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F., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+segment-long-spacing+crystallites:+their+role+in+collagen+fibrillogenesis.">Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis.</a> PNAS. 76, 313-317 (1979).</li><li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+observations+of+certain+fibrous+structures+obtained+from+connective+tissue+extracts.">Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts.</a> JACS. 72, 3321-3322 (1950).</li><li>Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O+prokollagene+kohzi.">O prokollagene kohzi.</a> Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).</li><li>Lin, A. C., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+ultrastructure+of+fibrous+long+spacing+collagen+by+parallel+atomic+force+and+transmission+electron+microscopy.">Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy.</a> Proteins. 49, 378-384 (2002).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Gereinigtes Kollagen Monomer bei niedrigem pH und Temperatur stabil ist und die Bildung von nativen Kollagenfibrillen im Wesentlichen um die Erhöhung des pH und der Temperatur des Kollagen Monomerlösung. Verfahren für die Wiederherstellung der banded Kollagenfibrillen aus Monomeren sind seit mehr als 50 Jahren. Das Verfahren, das unserem Labor in unserem ersten Studien mit Kollagen verwendet 15 Jahren 7 auf Verfahren beruhte zusammengefasst von Chapman und Mitarbeiter in 1986 10. Die Bedingungen für Kollagen Fibrillenbildung in dieser früheren Arbeit waren 0,18 mg / ml Kollagen Monomer in Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4)-Puffer bei 34 ° C. Der Nachteil dieser und anderer Verfahren, die wir versucht haben, ist, dass es immer ungebändert Fibrillen neben den gewünschten banded Fibrillen gebildet. Unsere neuen Bedingungen ~ 0,3 mg / ml Kollagen Monomer in 100 mM Phosphat und 100 mM KCl bei pH 7 bei 37 ° C für 3-4 Stunden gelassen. Das VerfahDure hierin beschriebenen unterscheidet sich in jeder Hinsicht aus dem früheren Verfahren zur Herstellung von nativen Kollagenfibrillen. Aber am deutlichsten, haben wir die Ionenstärke durch Anheben der Pufferkonzentration und der Zugabe von 100 mM KCl verdoppelt. Die Erhöhung der Ionenstärke Ergebnisse in konsistenter Bildung ausschließlich banderoliert Kollagenfibrillen. In unserer Erfahrung war das einzige Mal, dass dieses Verfahren nicht systemeigenen Typ Kollagen produziert, wenn das Kollagen Monomerlösung vorbei war der vom Hersteller empfohlenen Zeitpunkt der Verwendung. Wenn dies auftritt, ist das, was im Bereich von weniger Fibrillen, die alle zu vielen Fibrillen noch beobachtet werden aber vorwiegend ungebändert ungebändert beobachtet. Beachten Sie, dass abgelaufene Kollagen Monomer kann oft noch erfolgreich eingesetzt werden, um native Kollagen zu machen, aber wenn es scheitert, neues Kollagen Monomer sollte auf jeden Fall gekauft werden. FLS wurde zuerst von Highberger et al. 17 in Kollagenzubereitungen gutgeschrieben Orekhovich et al. 18. Weitere Studien führten Highberger und Schmitt zu schließen, dass es α1-Säure-Glykoprotein, das die Bildung von FLS 12 fördert war. Wir konnten später das Verfahren für die FLS Kollagen durch die Kombination von kommerziell erhältlichen Kollagen Monomer und α1-saures Glykoprotein bei niedrigem pH und langsam so dass der pH-Wert durch Dialyse der Mischung gegen Wasser für 24 Stunden 11 steigen replizieren. Wir präsentieren nun eine Modifikation dieses Verfahrens durch Dialysieren des Collagens gegen Wasser Monomer ersten und einfach die Kombination mit α1-Säureglycoprotein in Wasser zu FLS Kollagen bilden. Die Bedingungen für FLS Kollagen beschriebenen Anordnung sind hier viel weniger zeitaufwändig. Das Kollagen Monomer muss noch pre-dialysierte gegen Wasser, aber es kann in Substanz durchgeführt werden und dann bei 4 ° C stabil, bis sie verwendet wird. Dieses neue Verfahren liefert überwiegend FLS banded Kollagenfibrillen. Aus unserer Erfahrung, α1-Säure-GlykoproteinProtein mit einem niedrigeren kombinierten Protein-und Wassergehalt und durch Folgerung höheren Zuckergehalt, ist entscheidend für die erfolgreiche Herstellung FLS Fibrillen. Wir in der Regel mit dem Hersteller zu überprüfen, dass die α1-saures Glykoprotein viel nutzen wir ein kombiniertes% Protein und Wasser von 82 oder weniger hat. Und wie bei dem Verfahren für native Kollagen-Synthese, Kollagen Monomer, die zu alt ist, kann auch zum Ausfall an FLS Kollagen produzieren führen. Außerdem ist die Reinheit des Wassers für die Dialyse verwendet kritischen in diesem Verfahren. Beispielsweise Kollagens Dialyse von Monomer selbst gegen ~ 8 MΩ.cm anstatt&gt; 18 MΩ.cm Wasser ergibt eine Kollagenlösung, die nicht bilden wird FLS Kollagen. Von den drei Kollagenfibrille Typen ist die am einfachsten zu machen SLS Kollagen. Die früheste Vorbereitung der SLS wurde von Schmitt und Mitarbeiter 15 beschrieben. Wir veröffentlichten eine Anpassung des Verfahrens vor 12 Jahren für die Herstellung SLS Kollagen mit handelsüblichen collagen 14. Die Prozedur einfach brachte die Kombination von 2 mg / ml ATP und 0,5 mg / ml Kollagen Monomer in 0,05% (v / v) Essigsäure bei pH 3,5, und Verlassen der Mischung bei Raumtemperatur über Nacht. Nach unserer Erfahrung ist der kritische Aspekt SLS Anordnung, die kontrolliert werden müssen der pH der Reaktionslösung. SLS in mehr basischen Bedingungen (pH ~ 3.6-3.9) Ergebnisse in aggregierter Klumpen von Kristalliten zusammengesetzt. Mehr sauren Bedingungen (pH ~ 2,9-3,2) Ergebnisse in dünner, getrennt Kristallite als diejenigen unter den idealen Bedingungen von pH 3,3-3,5 montiert. Reaction pHs außerhalb dieses Bereichs (&lt;2,8 und&gt; 4) ergeben keine beliebige SLS Kollagen. In der Vergangenheit eingestellt wir den pH der Reaktionsmischung durch Zugabe von Essigsäure. Um das Verfahren noch weiter zu vereinfachen, in diesem Manuskript haben wir eine Glycin-HCl-Puffer, um den pH-Wert zu kontrollieren. Die drei verschiedenen Kollagen-Strukturen aus den Protokollen oben beschrieben gebildet haben Charakteristisch Funktionen, die nur durch Instrumente, die Nanometer-Auflösung erkennen. Native und FLS Kollagen durch Streifenbildung Periodizitäten von ~ 67 nm und ~ 270 nm aus. Die längste Dimension der SLS Kollagen ist nur ~ 360 nm. Wir haben speziell, wie wir eine AFM verwenden, um die drei verschiedenen Kollagen-Strukturen charakterisieren, beschrieben. Allerdings sollte ein AFM Betriebssystem in Kontakt oder Wackelkontakt Modus mit einem AFM-Sonde mit &lt;10 nm Radius auch in der Lage sein Bild diese Kollagen-Strukturen. Zusätzlich kann Elektronenmikroskop und wurde zur Charakterisierung dieser Kollagentypen Strukturen 19. Der große Vorteil dieser Verfahren ist, dass sie überwiegend die gewünschte Kollagen zu bauen. Die einzige andere Form von Kollagen, das in diesen Reaktionen gefunden wird, ist das Ausgangsmonomer, die oft im Hintergrund sichtbar der AFM-Bilder. Im Falle von nativem Kollagen und FLS, können sie leicht vom größten Teil des unrea getrennt werdenCTED Monomer durch wiederholte Zentrifugation und Waschen des entstehenden nativen oder FLS Kollagen Pellet mit Wasser. Wir haben eine einfache und sichere Verfahren für die native, FLS und SLS Kollagen mit Hilfe modernster, kommerziell erhältlichen Ausgangsmaterialien vorgestellt. Das Kollagen Monomers in all diesen Verfahren verwendet wird, ist kommerziell in gereinigter Form. α1-saures Glykoprotein und ATP sind auch beide im Handel erhältlich.

Kollagen ist eine Klasse von Proteinen, die eine strukturelle tripelhelicale Struktur aus drei Polypeptidketten gebildet haben. Diese Tripelhelix Monomere weiterhin versammeln sich in einer hierarchischen Weise schrittweise größere Strukturen zu bilden. Es gibt mindestens 28 genetisch verschiedenen Kollagentypen, die 1 identifiziert wurden. Kombiniert sind Kollagene bis 30% des gesamten Proteins bei Tieren gefunden, mit Typ I die vorherrschende Form Bilanzierung von bis zu 90% aller Kollagen-Proteine ​​2. Kollagen Typ I als fibrillous Strukturen in der Haut, Bänder, Sehnen und Knochen gefunden. Rasterkraftmikroskop (AFM) und elektronenmikroskopische (EM)-Bilder des Typs I nativen Kollagenfasern zeigen typischerweise Streifenbildung mit einer charakteristischen Periode von ~ 67 nm 3-5 (oft auch als D-Banding bezeichnet). Typ I Kollagen-Monomer eine Dreifachhelix Heterotrimer, bestehend aus zwei identischen α1 (I)-Ketten und ein α2 (I)-Kette, die jeweils mehr als a isttausend Aminosäuren lang. Es ist lang und dünn mit Abmessungen von 300 nm in der Länge und 1,4 nm im Durchmesser. Typ-I-Kollagen-Monomer kann leicht durch den Abbau natürlich geformten Strukturen höherer Ordnung 6 erhalten werden. Wir 7 und viele andere 8-10 haben gezeigt, dass diese löslichen Monomerbausteine ​​kann dann verwendet werden, um D-banded Fibrillen in vitro (Abb. 1) zu rekonstruieren. Neben nativen Kollagenfibrillen sind zwei andere höherer Ordnung Kollagenstrukturen gefunden, in vitro zu bilden unter Verwendung der gleichen Monomer-Baustein. Die beiden Strukturen sind faserige langen Abstand (FLS) und segmentale langen Abstand (SLS) Kollagen (Abbildung 1). FLS Kollagen ein fibrillous Konstrukt wie native Kollagen, wird aber von einer größeren Periodizität als Streifenbildung native Kollagen 11. In vitro dadurch bildet, wenn der FLS Kollagen Kollagen Monomer mit α1-Säure-Glykoprotein kombiniert wird <sup&gt; 12. FLS Kollagen wurde in vivo als auch beobachtet, wenn auch selten 13. SLS Kollagen als Kristallite bezeichnet, weil die Monomere in Register sind wie in einem Kristallgitter 14 ausgerichtet. SLS Kollagen bildet, wenn das Collagen Monomer mit Adenosintriphosphat (ATP) 15 kombiniert wird. Natürlich vorkommende SLS Kollagen in dem Kulturmedium von Fibroblasten beobachtet, nicht aber in extrahierten Gewebeproben, wahrscheinlich aufgrund seiner geringen Größe und der Mangel von unterscheidbaren topographische Merkmale 16. Das Ziel dieses Manuskriptes ist es, detaillierte Verfahren für die nativen Kollagenfibrillen sowie FLS und SLS Kollagen, dass auch unerfahrene Forscher reproduzieren können präsentieren. Verwendung von kommerziell erhältlichen erweiterten Ausgangsmaterialien, haben wir versucht, die Protokolle so einfach wie möglich zu machen und dennoch haben sie zuverlässig arbeiten. Wir beschreiben, wie eine AFM verwenden, um die verschiedenen Collagen-Struktur zu charakterisierens, die gemacht werden. Diese Arbeit wird sich positiv auf Forscher, die ein oder mehrere dieser höheren Ordnung Kollagen-Strukturen zu untersuchen und / oder nutzen sie als Vorstufen in anderen Anwendungen nutzen möchten, aber derzeit fehlt das Know-how oder einfach nicht wollen mit Gewebeproben zu arbeiten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Typ I Kollagen-Monomer (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) </td><td> Inamed Erweiterte Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> Lot 1261443 (2,9 mg / ml, pH 2,1) Lot 1629346 (3,2 mg / ml, pH 2,1) Lot 6006 (3,2 mg / ml, pH 2,1) </td></tr><tr><td> ATP </td><td> Research Biochemicals International </td><td> A-141 </td><td> Lot FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1-saures Glykoprotein aus Rinderplasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3643 </td><td> Lot 051K7440 (89,8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71,2%) Lot 063K7495 (71,9%) Lot 117K7535 (75,9%) (Protein + Wassergehalt) </td></tr><tr><td> a1-Säure glycoprotein aus menschlichem Plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9885 </td><td> Lot 128H7606 (70,9%) Lot 049K7565V (68%) (Protein + Wassergehalt) </td></tr><tr><td> Glimmer </td><td> Ted Pella </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - Silicon SPM-Sensor </td><td> Nanowelt </td><td> NHC </td><td> Silicon AFM-Sonde, die wir für Wackelkontakt-Modus </td></tr><tr><td> Veeco Nanoprobe Tipps </td><td> Veeco (Jetzt Bruker AFM-Sonden) </td><td> NP-S </td><td> Siliziumnitrid AFM-Sonde, die wir für Kontakt-Modus </td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen

Kollagenfibrillen sind in der extrazellulären Matrix von tierischem Gewebe, um strukturelle Gerüst und mechanische Festigkeit zu verleihen. Diese nativen Kollagenfibrillen eine charakteristische Periodizität von Streifenbildung ~ 67 nm und sind in vivo durch die hierarchische Anordnung von Typ I-Kollagen-Monomeren, die 300 nm in der Länge und 1,4 nm im Durchmesser sind, gebildet. In vitro durch Variieren der Bedingungen, denen das Monomer-Bausteine ​​ausgesetzt sind, können einzigartige Strukturen mit einer Länge skaliert auf bis zu 50 Mikrometer gebaut, darunter nicht nur native Fibrillen, sondern auch faserige langen Abstand und segmentale langen Abstand Kollagen. Hier präsentieren wir Verfahren zur Bildung der drei verschiedene Kollagen-Strukturen von einem gemeinsamen Handel erhältlich Kollagen Monomer. Mit den Protokollen, dass wir und andere haben in der Vergangenheit veröffentlichten diese drei Typen machen in der Regel Mischungen von Strukturen führen. Insbesondere waren ungebänderte Fibrillen allgemein found Bei der nativen Kollagens und native Fibrillen waren oft vor, wenn was faserigen langen Abstand Kollagen. Diese neuen Verfahren haben den Vorteil, die gewünschte Kollagenfibrille Aktivität fast ausschließlich. Die Bildung der gewünschten Strukturen durch Abbilden unter Verwendung eines Rasterkraftmikroskops verifiziert.

Nativen Kollagens Die Reaktionsmischung von ~ 0,3 mg / ml Kollagen Monomer in 100 mM Phosphat und 100 mM KCl bei pH 7 bei 37 ° C für 3-4 Stunden werden eine Lösung enthaltend natives Typ Kollagenfibrillen mit klaren ~ 67 nm D-Streifenbildung zu ergeben, ohne ungebänderte Fibrillen. Unter einem optischen Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung kann Klumpen von mehreren Fibrillen normalerweise auf dem Glimmer-Substrat gesehen werden, vor allem, wenn sie von Differential-Interferenz-Kontrast (DIC)-Mikroskopie (Abbildung 2) angesehen. In einer typischen Probe, eine zufällige 100 × 100 &amp;mgr; m 2 Scan von AFM wird in der Regel zeigen, wenigstens ein paar Fibrillen, 5-50 Mikrometer lang sind (Abb. 3a-c). Individuelle, getrennt Kollagenfibrillen sich zum jetzigen Zeitpunkt identifiziert werden. Mit einem 512 × 512 Pixel 2 image Scan Zoomen in einer 10 × 10 &amp;mgr; m 2 Scangröße zeigt, dass alle Fibrillen beringt werden (Abb. 3d-f </strong&gt;). Um genau zu messen die Streifenbildung Periodizität, ist es am besten in einer 2 × 2 um 2 Scangröße (Abb. 3g-i) zu vergrößern. Banderoliermaschine Periodizität kann einfach durch Messen und Mitteln der Längsabstand zwischen mehreren Gipfeln oder Tälern bestimmt werden. Alternativ, wenn der AFM-Software ermöglicht, eine eindimensionale Fourier entlang einer Längsquerschnitt transformieren können ebenfalls verwendet werden. Abbildung 4 zeigt ein AFM Höhenbilddaten einer Fibrillen und einer entsprechenden Längsschnitt. FLS Kollagen Die Reaktionsmischung von 1 mg / ml μ1-Säure-Glykoprotein und ~ 1 mg / ml Kollagen Monomer in Wasser bei Raumtemperatur 30 min belassen erbringt eine Lösung von FLS Kollagenfibrillen. Klumpen von Fibrillen, ähnlich wie im Falle von nativem Kollagen beobachtet, kann leicht auf dem Glimmer Substrat werden unter einem optischen Mikroskop bei 200-facher m gesehenagnification. In einer typischen Probe, wird ein zufälliger 100 × 100 &amp;mgr; m 2 Scan durch AFM zeigen in der Regel mindestens ein paar Fibrillen. Mit einem 512 × 512 Pixel 2 image Scangröße kann die Streifenbildung Periodizität durch Zoomen in einer 10 × 10 &amp;mgr; m 2 Scan (Abbildung 5a) oder genauer mit einem 2 × 2 um 2 Scan (Abbildung 5b). 5c gemessen werden zeigt einen Längsschnitt eines FLS Fibrillen. SLS Kollagen Das Reaktionsgemisch von 2 mg / ml ATP und ~ 0,5 mg / ml Kollagen Monomer in 100 mM Glycin-HCl-Puffer bei pH 3,3 bei Raumtemperatur 2 Stunden gelassen erbringt eine Lösung von SLS Kollagen. Typischerweise wird SLS Kristallite nicht unter einem optischen Mikroskop sichtbar. Ein AFM ist erforderlich, um die Anwesenheit von SLS Kristallite bestätigen. In einer typischen Probe, wird ein zufälliger 100 × 100 &amp;mgr; m 2 Scan durch AFM zeigen in der Regel vieleDots. Zoomen in einen 10 × 10 &amp;mgr; m 2 Scan wird in der Regel zeigen mehrere SLS Kristallite (Abb. 6a). Und ein 2 × 2 um 2 Scan (6b) zeigt die feinere Struktur eines SLS Kristallitgröße. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die drei strukturell unterschiedlichen Formen von Kollagenfibrillen, die in vitro aus Kollagen Monomer gebildet werden können. AFM-Bilder darstellen Kollagen Monomer und die drei höherwertigen Kollagenstrukturen alle auf derselben Größenskala (2 × 2 um 2). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> Abbildung 2. Digitales Bild bei ~ 200-facher Vergrößerung durch optische Mikroskopie von DIC nativen Kollagenfibrillen auf Glimmer (a) unberührt und (b) Schwellenwertvergleich und t geschärfteo markieren Sie die Fibrillen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> Abbildung 3. AFM-Aufnahmen von nativen Kollagenfibrillen auf Glimmer. Wackelkontakt mode AFM Amplituden Bilder angezeigt werden. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> Abbildung 4. (A) 0,5 × 1 um 2 intermittierenden Kontaktmodus AFM Höhenbild (vertikale Skala = 100 nm) und (b) Längsquerschnitt eines nativen Kollagenfibrillen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> Abbildung 5. AFM-Aufnahmen von FLS Kollagenfibrillen auf Glimmer. (A) 10 × 10 &amp;mgr; m 2 contact mode AFM Ablenkung Bild, (b) 2 × 2 um 2 contact mode AFM Ablenkung Bild und (c) Längs-Querschnitt eines FLS Kollagenfibrille. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> Abbildung 6. AFM-Aufnahmen von SLS Kollagen auf Glimmer. Wackelkontakt mode AFM Amplituden Bilder angezeigt werden.

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In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Einfache und reproduzierbare Verfahren werden für die Herstellung drei strukturell unterschiedliche Kollagen Baugruppen aus einer gemeinsamen kommerziell erhältlichen Typ I-Kollagen-Monomer beschrieben. Systemeigenen Typ, können faserige langen Abstand oder segmentale langen Abstand Kollagen durch Variation der Bedingungen, denen die 300 nm lang und 1,4 nm Durchmesser Monomer-Baustein ausgesetzt gebaut werden.

In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

13.6K Aufrufe.  University of Toronto. Einfache und reproduzierbare Verfahren werden für die Herstellung drei strukturell unterschiedliche Kollagen Baugruppen aus einer gemeinsamen kommerziell erhältlichen Typ I-Kollagen-Monomer beschrieben. Systemeigenen Typ, können faserige langen Abstand oder segmentale langen Abstand Kollagen durch Variation der Bedingungen, denen die 300 nm lang und 1,4 nm Durchmesser Monomer-Baustein ausgesetzt gebaut werden.

Serie: In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-geschichteten Elektrospinnen zu Native Arterielle Architektur mit Polycaprolacton, Elastin und Collagen Mimic: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Forschung

Biotechnik

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung3. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke4. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke14. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine8. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively11,13

Spin-trapping ESR spectroscopy was used to study the effect of plant antioxidants lycopene, pycnogenol and grape seed extract on scavenging gas-phase free radicals in cigarette smoke.

Ein Protokoll zur Erkennung und Scavenging Gas-Phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

In-situ-Druckbelastung und Correlative Nichtinvasive Bildgebung des Knochen parodontalen Ligament-Zahn-Faser-Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen<em&gt; In-vitro-</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Ultra-lange lesen Sequenzierung für ganze genomische DNA-Analysen

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...