말, JCG, 그리고 부인은 NIA (R00AG033176 및 R01AG040081)와 연구실 감독 연구 및 개발, # DE-AC02-05CH11231 에너지 계약의 미국 부서에서 지원됩니다.

1. 조직 가공 소화 <ol><li> 수술 절차의 폐기 소재로 인간의 유방 조직을 얻습니다. 감소 mammoplasties는 정상 또는 양성 세포를 제공 할 수 있습니다, fibroadenomas과 gynecomastias는 양성 세포를 제공, 비 종양이 유방 절제술의 조직은 (주변 장치 또는 종양에 contralateral, 또는 피하) 일반의 포함 microtumors에 양성으로 다양 할 수 있습니다 세포를 제공합니다. 적절한 IRB 승인 전에 폐기 자료를 확보하기 위해 존재 확인하십시오. 모든 자료는 bloodborne 병원균 규정에 따라 처리해야합니다. </li><li> 버퍼 나 미디어를 포함하는 멸균 용기 (예 : 1시 1분 Dulbecco의 수정 된 이글의 매체와 햄의 F-12)에서 개최 재료는 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 5 μg / ML Fungizone, 50U/ml polymyxin B와 보충 4에 연구실로와 10 % 태아 소 혈청 및 전송 ° C. 감소 mammoplasty 조직이 크게 쓰에 영향을주지 않고 72 시간에 대해 4 ° C에 보관하거나 배송 될 수 있습니다bsequent 세포 생존 능력. 비 감소 mammoplasty 조직의 작은 조각 더 프롬프트 처리를 요구할 수 있습니다. </li><li> 멸균 메스, 집게와 가위의 조합을 사용하여 지방 조직, 결합 조직 및 혈관의 stromal 매트릭스에서 상피 영역을 분리합니다. 대형 유리 무균 접시에 가위와 장소가있는 조직의 조각 (예를 들어, 150mm)를 자른다. 부드럽게 필수적인 지방산 물질을 멀리 밀고 자료와 메스를 잡아 포셉을 사용하여 yellower stromal 매트릭스에 포함 된 흰색 가닥으로 표시 상피 영역을, 나가 해부. 소화를 촉진하기 위해 50 ML 테스트 튜브에 반대 메스와 장소를 사용하여 ~ 3-4밀리미터의 작은 조각으로 상피 조직을 잘라. 조직의 대량 처리되는 경우, 신선한 메스 블레이드가 필요 할 수 있습니다. 기관 규정에 따라 폐기 음식에서 지방산 물질을 제거합니다. <ol class="lalpha"><li> 크게 섬유 조직에서 (예를 들어, 피하 매스심한 fibrocystic 질환이있는 tectomies), 더 흰색, 비 상피 재료가있을 것입니다. 여기에는 섬유 매트릭스에서 상피 세포를 해부하기 어려울 수 있습니다. 섬유 소재의 대형 조각이 지역에 ~ 1-3mm 광장 있으며, 별도의 소화 작은 조각으로 절단 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 튜브의 양의 더 큰 것보다 세째을 포함하는 조직을 원추형 원심 분리기 튜브 (50 ML 또는 15 ML)로 해부하는 상피 조직을 배치합니다. 조직 소화 혼합물을 (DME/F-12 또는 동급, 10 μg / ML 인슐린, 위 등의 항생제, 10의 최종 농도 사용하여 회전하는 동안 혼합 할 수 있도록하기 위해 단지 작은 공기 공간을두고 전체 볼륨에 관을 올려 % FCS, 200 U / ML 원유의 collagenase 및 100 U / ML hyaluronidase. </li><li> 장소 HulaMixer 관 회선 근에 튜브 37에서 밤 8 rpm으로 360 °를 회전 ° C. </li><li> 5 분 600 XG에 튜브를 원심 분리기. 폐기 조약 표면에 뜨는 지방과 중간을 삭제 하시겠습니까기관 규정에 들죠. </li><li> 중간에있는 펠릿의 작은 나누어지는을 diluting하여 소화 완료를 확인합니다. 소화는 현미경 검사가 첨부 된 기질 (그림 1A)에서 무료로 부드러운 게재, ductal 폐포, 또는 ductal - 폐포 구조와 세포의 clumps을 (organoids)이 표시되면 완료된 것입니다. 감소 mammoplasty의 조직은 일반적으로 여전히 밤새 소화 한 후 첨부 된 기질을 보여줍니다 및 추가 소화 시간이 필요합니다. <ol class="lalpha"><li> 또 다른 4-12 시간에 37 ° C에서 회전 신선한 조직 소화 혼합하고 다시 배양에서 불완전하게 소화 펠렛을 Resuspend. 단계 1.6 1.7를 반복합니다. 소화가 여전히 불완전한 경우, 다시 37 ° C 하룻밤에 회전 펠렛을 다시 부화 소화 혼합물을 추가합니다. 효소의 농도는 하루 아침에 오버 소화을 방지하기 위해 감소 될 수있다. </li></ol></li><li> 소화가 완료되면 5 분에 600 XG에 튜브를 원심 분리기, 다이제스트를 대기음약 15 ml/50 ML 튜브, 5 ml/15 ML 튜브의 중간 플러스 항생제의 이온 혼합, resuspend 펠렛. </li></ol> 2. 여과 및 소화 물질의 동결 <ol><li> 멸균 50 ML 튜브를 통해 멸균 100 μm의 스트레이너에 resuspended 펠릿의 aliquots을 전송합니다. 관에있는 매체 배수하자 다음 매체로부터 2-3 ML로 가기 1 - 배 시간에 organoids을 rewash. resuspended 펠렛의 모든 전송 될 때까지 반복합니다. 너무 많은 필터에 organoids 및 매체가 더 이상 쉽게 배수되지가있는 경우, 나머지 재료 새 필터 (들)을 사용합니다. 조심스럽게 또 다른 멸균 튜브의 상단에있는 필터 (들)을 회전시키면서 더 많은 매체 튜브에 organoids을 씻는다. 이 100 μm의 organoid 풀 수 있습니다. </li><li> 원래 50 ML 튜브로 배수 자료를 가지고 대부분 폐포 구조를 포함 40 μm의 organoid 풀을 얻기 위해, 40 μm의 스트레이너를 사용하여 2.1 프로세스를 반복합니다. 일에 배수 재료전자 튜브 중간 엽과 상피 세포와 vasculature의 작은 조각 / 단일 작은 clumps를 포함하는 여과 풀을 구성합니다. </li><li> 5 분 600 XG의 펠렛은 100 μm, 40 μm, 그리고 여과 풀. </li><li> 표면에 뜨는, reconstitute에게 포장 펠릿 0.1 ML 당 CPMII의 약 1 ML을 사용하여 CPM II (DME/F-12 또는 44% FCS와 6% DMSO와 이에 상응하는 금액)의 각 튜브를 대기음. 4 ° C.에 보관 </li><li> 아래 3.2에서와 같이 드롭하여 35mm 조직 문화 플라스틱 접시 드롭에 resuspended 소재의 0.1 ML를 삽입 시드 2 organoid 수영장위한 테스트 요리를. 여과 풀 직접 섬유 아세포 매체 (10 μg / ML의 인슐린와 10 % FBS와 DME/F-12 또는 동급)를 조직 배양 플라스틱에 놓는 할 수 있습니다. </li><li> Nunc 형 동결 ampoules (1 ML / 2 ML의 앰풀)로 나누어지는이 남아있는 resuspended 자료. -80 ° C에서 밤새 고정 후 액체 질소에 저장 장치에 즉시 전송할 수 있습니다. 우리는 생존의 상당한 손실을 관찰하지 않은오리지널 ampoules에 저장된는 후반 1970 년대부터 고정. </li></ol> 3. 냉동 Organoids과 차 문화의 하위 문화을 퍼 뜨리고 <ol><li> 신속하게 37 ° C의 물을 욕조에 organoids을 포함하는 냉동 앰풀을 해동. 앰풀의 organoids의 수의 시각적 평가에 따라 2-10 (보통 ~ 6) 60mm 요리, 또는 1-3 100mm 요리에 씨 organoids합니다. 60mm 요리 당 놓는 약 20-40 organoids는 최적입니다. </li><li> 해동 organoids는 신중하게 배치되어 organoids의도 배포 1 ML 피펫 또는 파스퇴르 피펫으로 요리 표면에 드롭하여 놓습니다. Organoids 가까운 곳에는 하위 문화 또는 동결에 대한 이하의 셀에 상승을 제공, 가지에 대한 공간이 제한됩니다 놓았다. (세포가 지난 긁힌 표면을 성장하지 않는 경향) 요리 표면을 긁는하지 마십시오. organoids 첨부 한 후 천천히 organoids (예를 들면 2-3 ml/60 mm 요리) dislodging 방지하기 위해 성장 매체를 추가 할 수 있습니다 1-2 분 기다립니다. 나는37 번 ° C humidified CO 2 인큐베이터에서 ncubate. 다음은 주요 문화입니다. 현재 가장 강력한 HMEC 성장 (그림 2)에 대한 M87A + 옥시토신 (X) 매체를 사용합니다. </li><li> 1 일 이내에, organoids가 연결되어 있는지 확인하십시오. 추가 매체 (예 : 2-3 ml/60 mm 요리)를 추가합니다. organoids에서 셀 마이그레이션 심는 후 48-72 시간 (그림 1B, C)으로 24-48 시간, 그리고 mitotic의 가지로 볼 수 있습니다. 때때로 첨부 파일은 특히 나이 많은 여자에서 overdigested organoids 또는 organoids을 도금하는 경우, 24 시간 후에는 가난하지만, 대부분의 준비는 72 시간 내에 첨부합니다. vasculature의 작은 조각은 첨부 섬유 아세포 세포 가지 (그림 1D)에 상승을 줄 수 있습니다. </li><li> 문화에게 최소 3 회 일주일에 먹이. M87A 형 미디어에서 재배 세포가 시딩의 밀도에 따라, 5-8 일 이내에 근처 합류로 성장합니다. </li><li> 에 따라 큰 섬유 아세포 성장, 차동 Trypsinization (DT)는,이있는 경우표면 플라스틱에서 섬유 아세포의 급속한 이탈은 섬유 아세포를 제거하는 필요합니다. 상피 패치 STE (생리, 0.05 % 트립신, 0.02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 기음 대형, 기음 미디어, 세탁 요리 (예, 1-2 ml/60 mm 요리)가되면 실온에서 신선한 0.5 ML의 STE을 추가하고 떠나 연속 현미경 관찰 1 주변 분을위한. 섬유 아세포가 분리하지만 상피 세포가 부드럽게 여전히 자기편이지만 급격히 섬유 아세포를 제거하기 위해 하드 표면에 대한 요리의 측면을 잃었하고 신속하게 기음합니다. PBS로 한 번 씻어, 다시 대기음. 크게 섬유 아세포로 오염 된 문화는 추가 DT가 필요할 수 있습니다. </li><li> 대형 상피 패치가 존재 차 문화를 하위 문화 있지만, 합류하기 전에. organoid 심는 및 첨부 파일의 밀도는 필요한 시간에 영향을 미칠 것입니다. 주 문화를 유지하고 시간이 지남에 따라 간격을두고 여러 차 문화를 생성하기 위해 일부 Trypsinizations (PT)을 수행합니다. </li><li> 기음 미디어는 요리에 0.5 ML 신선한 STE을 추가, 1-2 ML의 STE와 60mm 요리를 씻는다. 셀 부대를 홍보 할 수있는 요리의 부드럽게 두드리는 소리와 함께 1-5 분 동안 실온에서 현미경으로 세포 부대를 관찰. Trypsinization은 세포 ~ 50 %가 분리했을 때 중지해야합니다. 조기 포인트는 일반적으로 빠른 세포 손상이 있습니다. 모든 세포가 빨리 내려 올 수 있으므로 나중에 포인트를 들어, 세포는, 조심 모니터링, 빠른 분리를 위해 37 ° C에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 접시에 혈청 함유 미디어의 2 ML을 추가 repipette는 세척 및 살균 15 ML 튜브로 전송합니다. 관에 빨래를 추가, 다른 ~ 1-2 ML 미디어와 함께 배를 반복합니다. 기본 요리를 Refeed와 보육로 돌아갑니다. 혈구와 튜브에 세포를 계산합니다. 한 번 subcultured, 세포 모르겠지만이없고, 포인트는 subcultured 또는 냉동 예비 (제 2 통로 세포가 예비라고의 기본 요리와 이에 상응하는 장기적인 성장의 좋은 세포 regrowth을 8-4 주위에 번 반복 할 수 있습니다nger의 예비 선거). 일단 organoid 물질이 차 문화에 존재는 더 이상 없다 subcultured 예비 장기 인구 복제 가능성의 감소를 보여줍니다. </li><li><ol class="lalpha"><li> 예비으로 하위 문화를 들면, 종자 세포에 직접 요리에 관에서. 이러한 M87A + X와 같은 강력한 매체에 1-2 × 10 5 cells/100 mm 요리를 심는 것은 4~7일에 합류 될 것입니다. 우리는 proliferative 가능성을 높이기 위해 제 2 통로에있는 매체에 콜레라 독소를 추가, 그것은 organoids에서 multilayered 세포 가지로 연결하기 때문에 콜레라 독소는 차 문화에 생략됩니다. </li><li> 냉동의 경우 예비로, 펠릿 관 10 6 세포 / ML의 최종 밀도 CPMII에서 5 분, 그리고 resuspend 600 XG에서. 나누어지는이 Nunc 형 동결 ampoules에 세포를 resuspended -80시 야간 고정 ° C 한 후 액체 질소에 저장 장치에 즉시 전송할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 그것은 보관에 대한 첫 번째 태평양 표준시에서 세포를 고정하는 것이 좋습니다, 그리고 수 있습니다하위 문화에 대한 두 번째 태평양 표준시의 세포를 사용합니다. 추가 포인트는 나중에 사용하기 위해 냉동 보관하실 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Prowse, K. R., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+tissue-specific+regulation+of+mouse+telomerase+and+telomere+length.">Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).</li><li>Gil, J., Peters, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+INK4b-ARF-INK4a+tumour+suppressor+locus:+all+for+one+or+one+for+all.">Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).</li><li>Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Normal+Human+Mammary+Epithelial+Cells+in+Culture.">Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture.</a> In Vitro. 16, 415-425 (1980).</li><li>Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinctions+between+the+stasis+and+telomere+attrition+senescence+barriers+demonstrated+by+long-term+culture+of+normal+human+mammary+epithelial+cells.">Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells.</a> Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).</li><li>Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).</li><li>Stampfer, M. R., Bartley, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transformation+and+continuous+cell+lines+from+normal+human+mammary+epithelial+cells+after+exposure+to+benzo(a)pyrene.">Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).</li><li>Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p16+expression+with+first+senescence+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+and+extended+growth+capacity+with+inactivation.">Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation.</a> Oncogene. 17, 199-205 (1998).</li><li>Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf-1-induced+growth+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+is+p16-independent+and+is+overcome+in+immortal+cells+during+conversion.">Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion.</a> Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).</li><li>Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+p53+function+accelerates+acquisition+of+telomerase+activity+in+indefinite+lifespan+human+mammary+epithelial+cell+lines.">Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines.</a> Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).</li><li>Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -. L., Ljung, B. -. M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+genome+instability+in+breast+cancer.">In situ analysis of genome instability in breast cancer.</a> Nat Gene. 36, 984-988 (2004).</li><li>Li, Y., Pan, J., Li, J. -. L., Lee, J. -. H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+associated+with+breast+cancer+occur+as+normal+human+mammary+epithelial+cells+overcome+senescence+barriers+and+become+immortalized.">Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized.</a> Mol. Cancer. 6, (2007).</li><li>Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+function+in+cultured+human+mammary+epithelial+cells+turns+the+telomere-length+dependent+senescence+barrier+from+agonescence+into+crisis.">Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis.</a> Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).</li><li>Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-wise+DNA+methylation+changes+are+linked+to+escape+from+defined+proliferation+barriers+and+mammary+epithelial+cell+immortalization.">Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization.</a> Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).</li><li>Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+normal+human+mammary+cell+type+specific+miRNAs.">Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs.</a> Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).</li><li>LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments.">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).</li><li>Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+multipotent+progenitors+with+a+basal+differentiation+bias+during+aging+of+human+mammary+epithelia.">Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia.</a> Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 인간의 유방 조직 처리 방법은 인간의 가슴속에 세포 유형의 이기종 혼합물에서 순수한 유방 상피 세포를 획득 할 수 있습니다. 고정 크기의 구멍을 통해 여과 소화 stromal 매트릭스에서 유선의 다른 분수 (예를 들어, ductal 및 ductal - 폐포 대 폐포)의 분리 할 수 있습니다. Isogenic 유방 섬유 아세포는 상피 세포와 일치하도록 얻을 수 있습니다. 냉동 소화 물질은 30 년 좋은 생존은 그대로 남아 있습니다. 이 방법은 모든하지만 매우 섬유 유방 조직에 성공적으로 일을하고, 수행 할 수 간단했다. 유방 조직 처리의 다른 변형은 가능한 깨끗하고, 또는 분리 된 상피 분수를 제공하지 않는 존재합니다. 같은 M87A의 낮은 스트레스를 유도하는 매체와 문화에 처리 organoids의 위치는 여러 계보 (Lineage) 마커와 HMEC의 장기 성장을 할 수 있습니다. 플라스틱 배양 된 HMEC는 여전히 장군에게 능력을 보유생체 같은 혈통 관계의 정상적인있는 테 3D 구조. 이 HMEC 문화는 정상적인 HMEC 행동과 노화와 변화를 추진하거나 억제 할 수 있습니다 요인의 높은 처리량을 포함한 광범위한 실험 조사, 적합합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 유리 페트리 접시 15cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> 가위 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> 집게 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> 일회용 메스 </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> 시그마 </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 시그마 </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / 스트렙토 마이신 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> 생명 기술 </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polymixin B 황산 </td><td> 생명 기술 </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 생명 기술</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> 트립신 0.05 % 100 ML </td><td> 생명 기술 </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 생명 기술 </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> 생명 기술 </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 100 μm </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 40 μm </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 튜브 15 ML </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> 튜브 50 ML </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC 요리 10cm </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC 요리 6cm </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> 극저온 튜브 </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> 하우저 과학 </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf 모델 </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

실험 정상적인 인간의 유방 상피 세포 (HMEC) 행동의 검사 방법과 정상 세포 이상 속성을 취득은 체외 문화 시스템에 의해 촉진 될 수 생체 생물학에 더 정확하게 모델입니다. 세포 차별화를 공부 인간의 유래 물질의 사용은 노화, 노화, 그리고 불멸화 1-2 인간과 일반적으로 활용 쥐 세포 사이의 이러한 속성에서 많은 중요한 분자의 차이 주어진 특히 바람직하다. 정상과 비정상 조직의 대량는 감소 mammoplasty과 유방 절제술의 수술의 주파수로 인해 사용할 수 있기 때문에 유방 세포는 편리한 모델 시스템을 제시한다. 유선은 많은 서로 다른 세포 유형, 예를 들어, 상피, 지방, 중간 엽, 내피의 복잡한 혼합물로 구성되어 있습니다. 상피 세포는 젖 분비의 차별화 된 유방 기능을 할 책임이 있습니다또한 인간 유방암의 대부분의 출처입니다. 우리는 순수한 상피 구성 요소로뿐만 아니라 중간 엽 세포에게 3 유선 수술 폐기 조직을 처리하는 방법을 개발했습니다. 처리 자료는 무한정 냉동 보관 또는 기본 문화에 시작 할 수 있습니다. 외과 폐기 자료는 실험실로 이송하고 수동 상피 포함하는 조직에 풍부하게 해부하고 있습니다. 해부 조직의 후속 소화은 지하 막에있는 상피 조직에서 collagenase와 hyaluronidase 스트립 stromal 자료를 사용합니다. 상피 나무의 결과 작은 조각 (organoids)는 고정 기공 크기의 멤브레인에 연속 여과하여 소화 기질로부터 분리 될 수있다. 기공 크기에 따라 분수가 큰 폐포 / ductal 조각, 작은 폐포 클러스터, 또는 stromal 세포로 구성된 얻을 수 있습니다. 문화는 비밀입니다으로보다는 organoids로 시작하는 경우 우리는 뛰어난 성장을 관찰 한sociated 단일 세포. 낮은 스트레스를 유발 미디어를 사용 문화에 organoids의 위치는 여러 계보 (Lineage) 유형 (myoepithelial, luminal, 전구) 4-5의 마커와 일반 HMEC의 장기적인 성장을 지원합니다. 세포의 충분한 숫자는 높은 처리량 modalities를 사용하여 표준화 된 셀 배치뿐만 아니라 심문을 사용하여 다양한 실험 시험을 허용 한 개인의 조직에서 얻을 수 있습니다. 양식 HMEC는 성장, 분화, 노화, 그리고 노화, 어떻게 이러한 일반적인 프로세스가 불멸과 악성 변화 4-15,16 동안 변경 아르에 관한 일반적인 과정을 조사 연구 다양한 고용되었습니다. 세포 외 기질 재료, 다른 세포 유형, 및 / 또는 3D 문화의 존재 성장의 효과는 플라스틱 5,15의 성장과 비교 될 수있다. 양식 HMEC는 정상 세포로 시작, 그 요인을 검토하는 실험적으로 다루기 쉬운 시스템을 제공인간의 노화와 발암을 추진하거나 방지 할 수 있습니다.

적절하게 organoids에 소화와 문화에 배치 조직에 ​​대한 대표 수치는 그림 1에 표시됩니다. 불완전하게 소화 조직 물질이 이러한 구조의 외부에 부착하고, 가능성이 DT 제거 요구, 기본 문화에 fibroblastic 세포 성장을해야합니다 표시됩니다. Overdigested 조직 적은 부드러운 외부 경계를 표시하고, 기본 문화에 첨부하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 상피 가지가 48-72 시간 (1B, C)에서 시작해야합니다. vasculature (1D)의 작은 조각은 중간 엽 세포 가지의 소스가 될 수 있습니다. 상피 outgrowths는 myoepithelial, 전구, 그리고 luminal lineages (1E, 3C-E)와 관련된 마커와 세포의 혼합물을 포함 proliferative 인구, morphologically 이기종 인구를 보여줍니다. 콜레라 독소와 옥시토신과 보충 등 M87A의 낮은 스트레스 미디어의 성장은 우수한 장기를 지원합니다일반 사전 스테이 시스 HMEC의 성장은 이전 미디어 공법 (그림 2)에 비교했다. 이후, 대부분의 세포는 myoepithelial 계보 (Lineage) 마커를 표시, M87A 타입의 미디어도 4-8 (그림 3C-E, 4) 통로를 통해 luminal 및 전구 세포의 성장을 지원합니다. 플라스틱 배양 HMEC는 myoepithelial 세포 (그림 4A, B)에 내부 luminal 셀과 micropatterned 3D microwells에 자기 조직 적절한 3D를 형성하는 능력을 유지 할 수 있으며, Matrigel (4C, D)에 도금 할 때 조직 구조를 형성 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. HMEC organoids 및 기본 문화. (A) Organoid은 소화하고 여과 한 후 ductal - 폐포 구조를 보여주고 있습니다. (B, C) 이일 차 문화에 배치 한 후 ductal와 폐포 구조를 나타낸 Organoids는, 시작 셀 outgr에 유의owth (흰색 화살표). (D) 작은 혈관이와 B, C.와 동일한 문화에서 섬유 아세포 가지를 시작으로 첨부 사일 후 기본 organoid 문화에서 (E) 상피 세포 가지. Lineages는 K14 (빨간색)와 K19 (녹색)에 항체와 얼룩에 의해 식별되며, 핵은 DAPI (파란색) 물들되었습니다. Luminal (K14-/K19 +, 녹색), myoepithelial (K14 + / K19-, 빨강) 및 전구 (K14 + / K19 +, 노란색) 세포 볼 수 있습니다. 흠없는 세포는 불완전 항체 침투로 인해 organoid 코어에서 관찰됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 한 사람, 표본 184에서 얻은 다양한 미디어 공법에 HMEC 문화의 성장. Organoids는 다른 미디어 공법을 사용하여 기본 문화에 시작되었다. 최고의 장기적인 성장은 우리의 가장 최근의 수립, M87A + 옥시토신 (X) 4를 사용하여 얻어진다. 이 매체는 또한 지원여러 HMEC lineages의 성장 (그림. 1E 참조). 이전 미디어 수립, MM 3 적은 강력한 성장을 제공하는 동안 혈청이없는 미디어, MCDB170 (상업용 MEGM) 신속한 cyclin 키나제 억제제 p16 INK4A의 유도와 7,11,13 비정상 세포에 대한 선택에서 17 리드. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> 그림 3. (A) EpCAM와 CD49f/alpha 6 인테그린의 표현, 그리고 (B) CD227/Muc1에 대한 교양, 효소 dissociated organoid 4 일 통과. (A, B) FACS 분석에서 교양 organoids과 교양 HMEC의 계보 (Lineage) 다양성의 비교 그리고 CD10/CALLA. (C, D) FACS의 (C) EpCAM 및 CD49f/alpha 6 인테그린의 표현을위한 제 4 회 통로 사전 스테이 시스 HMEC의 분석, 그리고 (D) CD227/Muc1 및 CD10/CALLA. 신상 Populations는 LEP (luminal 마커 EPCAM 또는 CD227을 표현), MEP (myoepithelial 마커 CD49f 또는 CD10을 표현) 또는 음식물 (CD49f + / EPCAM + 인구 풍부)로 표시됩니다. EpCAM 및 CD49f 변경의 문화 규제에 적응하는 동안 교양 organoids에 비해합니다. (E) 정렬되지 않은 HMEC과 4 번째 통로에서 FACS 강화 LEP 및 MEP는 혈통 식별을 확인하기 위해 각질 K14 (MEP 마커)와 K19 (LEP 마커)의 immunofluorescence 분석 얼룩이. DAPI로 핵의 스테인드 파란색 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> 4 그림. 양식 HMEC 적절한 microenvironments에 배치 생체 같은 혈통 관계에서와 조직 구조를 형성 할 수 있습니다. (A) 사전 스테이 시스 4 일 통과 HMEC는 FACS 강화 나였다n 인물 luminal LEP 및 myoepithelial MEP의 lineages은 (표시되지 않음) K14와 K19의 표현에 의해 확인이 lineages과 CD227과 CD10에 대한 마커를 사용합니다. (B) micropatterned microwells에서 함께 혼합하면, 배양 세포는 외부와 LEP 내부에 MEP와 bilayers에 자기 조직 할 수 있었다 [샹송 외에서 적응. 5]. 휘황 표시 LEP (녹색)와 MEP는 (빨간색) microwells (위쪽)에 추가 한 후 공 촛점 0 시간에 현미경, 24 시간, 48 시간으로 이미징했다. 제어 HMEC은 임의로 빨간색 또는 녹색 형광 라벨 (아래)으로 분류되었다. (C) FACS 강화 전구 세포의 시야 이미지 (cKit +) 3D (Matrigel) 문화에 도금 18 일 성장. 결과 구조는 폐포 morphogenesis을 전시 할 수 있습니다. (D) 구조는 Matrigel에서 추출되어 K14 및 K19를 감지 할 수 물들 된, 핵은 DAPI로 counterstained했다. Immunofluorescent 분석은 올바른 luminal 및 기초 폴라와 조직 구조를 보여줍니다rity.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture at JoVE.com

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

인간의 유방 수술 폐기 자료를 처리하는 방법이 설명되어 있습니다. organoids의 형태로 처리 조직은, 무기한 정지 또는 장기 성장 문화에 배치 저장할 수 있습니다. 이 방법은 실험 정상적인 인간 내피 세포 생물학의 심사 및 외인성 섭동의 효과를 수 있습니다.

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

processing-human-reduction-mammoplasty-mastectomy-tissues-for-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K 조회수.  Lawrence Berkeley National Laboratory. 인간의 유방 수술 폐기 자료를 처리하는 방법이 설명되어 있습니다. organoids의 형태로 처리 조직은, 무기한 정지 또는 장기 성장 문화에 배치 저장할 수 있습니다. 이 방법은 실험 정상적인 인간 내피 세포 생물학의 심사 및 외인성 섭동의 효과를 수 있습니다.

비디오: Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

C57BL/6J 마우스의 Stromal 셀 및 암종 세포 이식 내유

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

연구

의학

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

암 연구학

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

생체공학

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of cancer cell populations typically generate a single endpoint measurement that does not distinguish between cancer cell subpopulations with different invasive potential. Also, the tumor microenvironment consists of different resident stromal and immune cells that alter and participate in the invasive behavior of cancer cells. Invasion into tissues also plays a role in immune cell subpopulations fending off microorganisms or eliminating diseased cells from the parenchyma and endothelial cells during tissue remodeling and angiogenesis. Real-Time Cellular Analysis (RTCA) that utilizes impedance biosensors to monitor cell invasion was a major step forward beyond endpoint measurement of invasion: this provides continuous measurements over time and thus can reveal differences in invasion rates that are lost in the endpoint assay. Using current RTCA technology, we expanded dual-chamber arrays by adding a further chamber that can contain stromal and/or immune cells and allows measuring the rate of invasion under the influence of secreted factors from co-cultured stromal or immune cells over time. Beyond this, the unique design allows for detaching chambers at any time and isolating of the most invasive cancer cell, or other cell subpopulations that are present in heterogeneous mixes of tumor isolates tested. These most invasive cancer cells and other cell subpopulations drive malignant progression to metastatic disease, and their molecular characteristics are important for in-depth mechanistic studies, the development of diagnostic probes for their detection, and the assessment of vulnerabilities. Thus, the inclusion of small- or large-molecule drugs can be used to test the potential of therapies that target cancer and/or stromal cell subpopulations with the goal of inhibiting (e.g., cancer cells) or enhancing (e.g., immune cells) invasive behavior.

We describe an approach to detect and capture invasive cell subpopulations in real-time. The experimental design uses Real-Time Cellular Analysis by monitoring changes in the electric impedance of cells. Invasive cancer, immune, endothelial or stromal cells in complex tissues can be captured, and the impact of co-cultures can be assessed.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after propagation from primary tissue or stem cells. This method of organoid generation forgoes single-cell differentiation through multiple passages and instead uses differential centrifugation to isolate mammary epithelial organoids from mechanically and enzymatically dissociated tissues. This protocol provides a streamlined technique for rapidly producing small and large epithelial organoids from both mouse and human mammary tissue in addition to techniques for organoid embedding in collagen and basement extracellular matrix. Furthermore, instructions for in-gel fixation and immunofluorescent staining are provided for the purpose of visualizing organoid morphology and density. These methodologies are suitable for myriad downstream analyses, such as co-culturing with immune cells and ex vivo metastasis modeling via collagen invasion assay. These analyses serve to better elucidate cell-cell behavior and create a more complete understanding of interactions within the tumor microenvironment.

This protocol discusses an approach for generating epithelial organoids from primary normal and tumor mammary tissue through differential centrifugation. Furthermore, instructions are included for three-dimensional culturing as well as immunofluorescent imaging of embedded organoids.

계대증 없이 정상 및 종양 유방 조직에서 마우스 및 인간 상피 오가노이드 생성 및 이미징

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

미세유체역학(Microfluidics) 기반 혈관화된 인간 미세종양 모델 준비

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

저자 스포트라이트: Creating Human Vascularized Micro-Tumors as Models for Translational Cancer Research (중개 암 연구를 위한 모델로서의 인간 혈관 미세 종양 생성) 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

C57BL/6J 마우스의 Stromal 셀 및 암종 세포 이식 내유

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

계대증 없이 정상 및 종양 유방 조직에서 마우스 및 인간 상피 오가노이드 생성 및 이미징

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립