MAL, JCG, y MRS son apoyados por el NIA (R00AG033176 y R01AG040081) y por el Laboratorio de Investigación y Desarrollo Dirigido, EE.UU. Departamento de Energía # contrato DE-AC02-05CH11231.

1. Tejido de procesamiento y digestión <ol><li> Obtener tejido mamario humano como material de descarte de los procedimientos quirúrgicos. Mamoplastias de reducción puede proporcionar células normales o benignos; fibroadenomas y ginecomastias proporcionar células benignas; tejidos no tumorales (periféricos o mastectomía contralateral a un tumor, o subcutánea) proporcionar células que pueden variar desde normal a benigno a microtumores contienen. Asegúrese de que la aprobación del IRB con la debida anterioridad a la obtención del material de descarte. Todo el material debe ser tratado de acuerdo con los reglamentos contenidos en la sangre patógenos. </li><li> Coloque el material en recipientes estériles que contienen tampón o medio (medio modificado de Dulbecco por ejemplo, 1:1 de Eagle y Ham F-12) suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 5 ug / ml de Fungizone, 50U/ml polimixina B, y 10% de suero fetal bovino, y el transporte al laboratorio a 4 º C. Tejido mamoplastia de reducción puede almacenarse o transportarse a 4 º C durante 72 horas sin afectar significativamente Sula viabilidad celular bsequent. Pequeños trozos de tejido mamoplastia de reducción puede no requerir un procesamiento más rápido. </li><li> Separar las zonas epiteliales de la matriz de estroma de tejido adiposo, el tejido conjuntivo y los vasos sanguíneos utilizando una combinación de fórceps estériles de bisturí, y una tijera. Corte las piezas de tejido con tijeras y colocar en un plato de cristal estéril grande (por ejemplo, 150 mm). Suavemente diseccionar las áreas epiteliales, que aparecen como hebras blancas incrustadas en la matriz estromal más amarillo, usando las pinzas para sujetar el material y el bisturí para raspar el material groseramente graso. Para facilitar la digestión, cortar el tejido epitelial en pequeños trozos de 3-4 mm ~ utilizando escalpelos opuestas y colocarlo en un tubo de ensayo de 50 ml. Si grandes cantidades de tejido están siendo procesados, frescos hojas de bisturí pueden ser necesarios. Retire el material graso del plato para su eliminación de acuerdo con las regulaciones institucionales. <ol class="lalpha"><li> En los tejidos fibrosos en gran medida (por ejemplo, subcutánea mastectomies con enfermedad fibroquística severa), no habrá más sólido blanco, no epiteliales material. Puede ser difícil para diseccionar las células epiteliales de matrices fibrosas tales. Los pedazos grandes de material fibroso se puede cortar en piezas más pequeñas que son cuadrados ~ 1-3 mm de área y se digirió por separado. </li></ol></li><li> Coloque el tejido diseccionado epitelial en un tubo cónico de centrífuga (50 ml o 15 ml) con el tejido que comprende no más de un tercio del volumen del tubo. Llevar el tubo hasta el volumen completo, dejando solamente un pequeño espacio de aire para permitir la mezcla durante la rotación, usando una mezcla de digestión de los tejidos (DME/F-12 o equivalente, 10 mg / ml de insulina, antibióticos como anteriormente, y la concentración final de 10 % de FCS, 200 U / ml de colagenasa crudo y 100 hialuronidasa U / ml. </li><li> Colocar los tubos en un tubo rotatorio HulaMixer y giran 360 º a 8 rpm durante la noche a 37 ° C. </li><li> Centrifugar los tubos a 600 xg durante 5 min. Deseche la grasa sobrenadante y medio plazo para acuerdo de enajenaciónING a las regulaciones institucionales. </li><li> Entrada para la terminación de la digestión mediante la dilución de una pequeña alícuota del sedimento en medio. La digestión es completa cuando el examen microscópico muestra grupos de células (organoides) con estructuras de apariencia lisa ductales, alveolar, o ductal alveolar libres de estroma adjunto (Figura 1A). Tejidos mamoplastia de reducción generalmente siguen mostrando estroma adjunto después de una digestión durante la noche y requerirá tiempo de digestión adicional. <ol class="lalpha"><li> Resuspender el pellet no digeridos en mezcla fresca digestión de los tejidos y re-incuba con rotación a 37 º C durante otra hora 4-12. Repita los pasos 1,6 y 1,7. Si la digestión es todavía incompleta, de nuevo añadir mezcla de digestión a la pella y re-incubar con rotación a 37 ° C durante la noche. La concentración de las enzimas puede reducirse para evitar la sobre-digestión durante la noche. </li></ol></li><li> Cuando la digestión es completa, centrifugar los tubos a 600 xg durante 5 min, aspirar el digestoion mezcla, resuspender el pellet en medio de más antibióticos en el tubo de aproximadamente 15 ml ml/50, 5 ml/15 ml tubo. </li></ol> 2. La filtración y la congelación de los materiales digeridos <ol><li> Transferir alícuotas de la sedimento resuspendido en un filtro estéril de 100 micras sobre un tubo estéril de 50 ml. Deje que caiga el medio en el tubo, a continuación, lavar nuevamente los organoides en mejores 1-2x veces con 2-3 ml de medio. Repetir hasta que todo el sedimento resuspendido se ha transferido. Si hay demasiados organoides en el filtro y el medio ya no drena fácilmente, utilizar un filtro nuevo (s) para el material restante. Con cuidado, darle la vuelta al filtro (s) en la parte superior de otro tubo estéril y lavar los organoides en el tubo con más medio. Esta es la piscina de 100 m organoide. </li><li> Tome el material que drena en el tubo original 50 ml y repetir el proceso de 2,1 micras utilizando un colador 40, para obtener de la piscina 40 micras organoide, que contiene principalmente estructuras alveolares. El material que se vierte en thtubo electrónico constituye el filtrado de la piscina, que contiene grupos individuales / pequeños de células mesenquimales y epiteliales y pequeños trozos de la vasculatura. </li><li> Pellet las 100 micras, 40 micras y piscinas filtrado a 600 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante reconstituir, cada tubo en CPM II (DME/F-12 o equivalente con 44% de FCS y 6% de DMSO) con aproximadamente 1 ml de CPMII por 0,1 ml del paquete de pellet. Conservar a 4 ° C. </li><li> Semilla un plato de prueba para las 2 piscinas organoides colocando 0,1 ml de material resuspendido en una gota de cultivo de tejidos de 35 mm plato de plástico a gota como en 3.2. La piscina de filtrado se puede sembrar directamente sobre plástico de cultivo de tejidos con medio de fibroblastos (DME/F-12 o equivalente con 10 ug / ml de insulina y 10% de FBS). </li><li> Alícuota del material restante resuspendido en ampollas de tipo Nunc congelador (1 ml / ampolla de 2 ml). Congelar durante la noche a -80 ° C y luego se transfieren rápidamente a almacenamiento en nitrógeno líquido. No se ha observado ninguna pérdida significativa de viabilidaden nuestras ampollas originales almacenadas congeladas desde finales de los años 1970. </li></ol> 3. Siembra Organoides congelados y subcultura de cultivos primarios <ol><li> Descongelar rápidamente la ampolla congelado que contiene los organoides en un baño de agua a 37 ° C. Seed los organoides en 2 a 10 (normalmente ~ 6) 60 mm platos, o 1-3 placas de 100 mm, dependiendo de la estimación visual de la cantidad de organoides en la ampolla. Organoides aproximadamente 20-40 sembradas por placa de 60 mm es óptimo. </li><li> Organoides descongeladas se colocan cuidadosamente, gota a gota, sobre la superficie del plato con una pipeta de 1 ml o pipeta Pasteur para una distribución uniforme de organoides. Organoides colocados juntos se tiene un espacio limitado para la excrecencia, dando lugar a un menor número de células para el subcultivo o congelación. Evite rayar la superficie del plato (células tienden a no crecer más allá de las superficies rayadas). Espere 1-2 minutos para permitir que los organoides para unir y luego, lentamente, se añade medio de crecimiento para evitar que se desprenda los organoides (por ejemplo, 2-3 ml/60 plato mm). Yoncubate a 37 ° C en CO 2 humidificado incubadora. Estos son los cultivos primarios. Actualmente usamos M87A + oxitocina (X) medio para el crecimiento HMEC más robusta (Figura 2). </li><li> Después de 1 día, compruebe que los organoides se adjuntan. Añadir medio adicional (por ejemplo 2-3 ml/60 plato mm). La migración celular a partir de los organoides debe ser visible por 24-48 horas, y el crecimiento externo mitótico por 48-72 horas después de la siembra (Figura 1B, C). A veces, el apego es pobre después de 24 horas, sobre todo si enchapado organoides overdigested o organoides de las mujeres mayores, pero la mayoría de las preparaciones se fijará un plazo de 72 horas. Pequeñas piezas de la vasculatura puede conectar y dar lugar a consecuencia celular de fibroblastos (Figura 1D). </li><li> Alimentar cultivos al menos 3 veces por semana. Las células cultivadas en medios de comunicación de tipo M87A crecer hasta cerca de la confluencia en 5-8 días, dependiendo de la densidad de siembra. </li><li> Si no hay crecimiento de fibroblastos significativa, tripsinización diferencial (DT), basado en eldesmontaje rápido de los fibroblastos de la superficie de plástico, se necesita para eliminar los fibroblastos. Cuando los parches epiteliales convertido en grandes medios de comunicación, del aspirado, plato de lavado (por ejemplo, 1-2 ml/60 plato mm) con STE (solución salina, 0,05% de tripsina, 0,02% de EDTA), aspirado, agregar fresco 0,5 STE ml y dejar a temperatura ambiente por alrededor de 1 minuto con la observación microscópica continua. Cuando los fibroblastos separar las células epiteliales, pero son todavía adherente, suavemente pero bruscamente golpear el lado del plato contra una superficie dura para desalojar los fibroblastos y luego aspirar rápidamente. Lavar una vez con PBS, y aspirar de nuevo. Culturas altamente contaminados con fibroblastos pueden necesitar un DT adicional. </li><li> Subcultivar cultivos primarios cuando grandes manchas epiteliales están presentes, pero antes de su confluencia. La densidad de siembra organoide y la unión influirá en el tiempo requerido. Para conservar el cultivo primario y generar múltiples cultivos secundarios, espaciados en el tiempo, realizamos Trypsinizations parciales (PT). </li><li> Medios de comunicación Aspirar, lavar un plato de 60 mm con 1-2 STE ml, agregar 0,5 ml de STE fresco al plato. Observar desprendimiento de células bajo el microscopio a temperatura ambiente durante 1-5 min, con golpeteo suave de la cápsula para promover la separación de células. La tripsinización se detuvo cuando ~ 50% de las células se han desprendido. A principios PT suelen tener desprendimiento celular rápida. Para más tarde TT, las células se pueden colocar a 37 º C para acelerar la separación, con un cuidadoso control, como todas las células se podría salir rápidamente. </li><li> Añadir 2 ml de medio que contiene suero al plato, repipette para lavar, y transferir a un tubo estéril de 15 ml. Repetir 2x con otra ~ 1-2 ml de medio, añadiendo el lavado en el tubo. Vuelva a introducir el plato principal y el retorno a la incubadora. Contar las células en el tubo con el hemocitómetro. PT puede repetirse alrededor de 4 a 8 veces con la regeneración celular bueno en los platos principales y el crecimiento a largo plazo equivalente de los secundarios subcultured o congelados (células segundo paso se llaman secundarias, una vez subcultivo, las células no son longer primarias). Una vez que el material organoide ya no está presente en los cultivos primarios, secundarios subcultured muestran una disminución a largo plazo el potencial de duplicación de la población. </li><li><ol class="lalpha"><li> Para subcultivo a las secundarias, células de semillas directamente desde el tubo en platos. La siembra de 2.1 x 10 5 mm plato células/100 en un medio sólido, como M87A + X dará lugar a la confluencia en 4-7 días. Añadimos la toxina del cólera al medio a paso para aumentar segundo potencial proliferativo; toxina del cólera se omite en cultivo primario ya que conduce a excrecencia celular de múltiples capas de los organoides. </li><li> Para la congelación como secundarios, tubo pellet en 600 xg durante 5 min, y se resuspende en CPMII con una densidad final de 10 6 células / ml. Alícuota se resuspendieron las células en ampollas Nunc tipo de congelación, congelar durante la noche a -80 ° C y luego se transfieren rápidamente a almacenamiento en nitrógeno líquido. </li></ol></li><li> Se recomienda para congelar las células de la PT primero para su custodia, yutilizar células de la PT segunda subcultura. PTs adicional se puede almacenar congelado para uso futuro. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

La humana método de procesado de tejido mamario que aquí se presenta permite la obtención de células epiteliales mamarias puros de la mezcla heterogénea de tipos de células en el pecho humano. La filtración a través de poros de tamaño fijo permite la separación de las diferentes fracciones de la glándula mamaria (por ejemplo, ductal y alveolar ductal-vs alveolar) de la matriz estromal digerido. Isogénicas fibroblastos mamarias se puede obtener para que coincida con las células epiteliales. El material congelado digerido ha conservado buena viabilidad durante más de 30 años. Este método ha funcionado con éxito en todos los tejidos mamarios pero muy fibrosas, y es simple de realizar. Otras variaciones de procesamiento de tejido mamario que existen no proporcionan fracciones epiteliales que son tan viables, limpio, o separados. La colocación de organoides procesados ​​en cultivo con bajos estresantes medios como M87A permite crecimiento a largo plazo de HMEC con marcadores de linaje múltiple. HMEC que han sido cultivadas en plástico todavía conservan la capacidad de génerosdel te 3D estructuras con normalidad en las relaciones de linaje vivo-como. Estos cultivos HMEC son adecuados para una amplia investigación experimental, incluyendo un alto rendimiento, de comportamiento normal HMEC y factores que pueden impulsar o inhibir senescencia y transformación.

<table border="1"><tbody><tr><td> Vidrio plato Petri 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Tijeras 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Pinzas 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Escalpelos desechables </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> La colagenasa </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hialuronidasa </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / estreptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polimixina B sulfato </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> La tripsina 0,05% 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Filtro de células 100 micras </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Filtro de células 40 micras </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Tubos de 15 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Tubos de 50 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC platos de 10 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC platos 6 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Viales criogénicos </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser Científico </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Centrífugo </td><td> Eppendorf modelo </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

Experimental examen de lo normal de células epiteliales mamarias humanas (HMEC) el comportamiento, y cómo las células normales adquieren propiedades anormales, puede ser facilitado por en sistemas de cultivo in vitro que más exactamente modelo en biología vivo. El uso de material humano obtenidos para el estudio de la diferenciación celular, el envejecimiento, la senescencia y la inmortalización es particularmente ventajosa teniendo en cuenta las muchas diferencias significativas en estas propiedades moleculares entre las células de roedores y humanos utilizados comúnmente 1-2. Células mamarias presentan un sistema de modelo conveniente porque grandes cantidades de tejidos normales y anormales se encuentran disponibles debido a la frecuencia de mamoplastia de reducción y cirugías de mastectomía. La glándula mamaria se compone de una mezcla compleja de muchos tipos de células diferentes, por ejemplo, adiposo epiteliales, endoteliales, mesenquimal,. Las células epiteliales son responsables de la función diferenciada mamaria de la lactancia,y también son el origen de la gran mayoría de los cánceres de mama humanos. Hemos desarrollado métodos para procesar tejidos de la glándula mamaria quirúrgicos de descarte en puras componentes epiteliales así como las células mesenquimales 3. El material procesado puede almacenar congelada indefinidamente, o iniciados en cultivo primario. Material de descarte quirúrgico se transporta al laboratorio y se disecaron manualmente para enriquecer en tejido epitelial que contiene. Digestión subsiguiente del tejido diseccionado utilizando colagenasa y hialuronidasa material de tiras de estroma de los epitelios en la membrana basal. Las piezas resultantes pequeñas del árbol epitelial (organoides) se puede separar de la estroma digerido por filtración secuencial en las membranas de tamaño de poro fijo. Dependiendo del tamaño de poro, las fracciones se puede conseguir que consiste de grandes ductales / alveolar, piezas pequeñas agrupaciones alveolares, o células estromales. Hemos observado un crecimiento superior cuando las culturas se inician como organoides y no como disasociada células individuales. La colocación de organoides en la cultura, baja fatiga medios inductores de apoyo a largo plazo el crecimiento de HMEC normal con marcadores de linaje tipos múltiples (mioepiteliales, progenitor luminal) 4-5. Un número suficiente de células pueden ser obtenidas a partir de tejido de un individuo para permitir el examen extenso experimental utilizando lotes estandarizados de células, así como de interrogación utilizando las modalidades de alto rendimiento. HMEC Cultured se han empleado en una amplia variedad de estudios que examinan los procesos normales que regulan el crecimiento, la diferenciación, el envejecimiento y la senescencia, y cómo estos procesos normales se alteran durante la transformación maligna inmortal y 4-15,16. Los efectos de crecimiento en la presencia de material de matriz extracelular, otros tipos de células, y / o cultivo 3D puede ser comparado con el crecimiento en el plástico 5,15. HMEC Cultivadas, comenzando con las células normales, proporcionar un sistema experimentalmente tratable para examinar los factores que lospuede impulsar o impedir el envejecimiento humano y la carcinogénesis.

Figuras representativas de los tejidos digeridos apropiadamente a organoides y colocan en cultivo se muestra en la figura 1. Tejido no digeridos se muestran material todavía unido a la parte exterior de estas estructuras, y probablemente tendrá un cierto crecimiento celular fibroblástica en cultivo primario, requiriendo DT de eliminar. Tejido Overdigested mostrará las fronteras exteriores menos suaves, y puede tomar más tiempo para fijar en cultivo primario. Excrecencia epitelial debe comenzar dentro de 48-72 hr (1B, C). Pequeños trozos de vasculatura (1D) puede ser una fuente de la excrecencia de las células mesenquimales. Excrecencias epiteliales muestran poblaciones morfológicamente heterogéneas, con poblaciones proliferativas que contienen las mezclas de células con marcadores asociados con el progenitor mioepiteliales, y linajes luminales (1E, 3C-E). El crecimiento en medios bajos de estrés tales como M87A suplementadas con la toxina del cólera y la oxitocina apoyará superior a largo plazocrecimiento de normal pre-estasis HMEC en comparación con formulaciones de medios anteriores (Figura 2). M87A de tipo medios de comunicación también apoyar el crecimiento de las células luminales y progenitoras a través de pasos 4-8 (Figuras 3C-E, 4); después de eso, la mayoría de las células muestran marcadores de linaje sólo mioepiteliales. HMEC cultivadas en plástico pueden retener su capacidad para formar 3D adecuado auto-organización en micropatterned 3D micropocillos, con células luminales interiores a las células mioepiteliales (Figura 4A, B), y para formar estructuras organizadas cuando chapada en Matrigel (4C, D). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Organoides HMEC y la cultura primaria. (A) organoide muestran ductal-alveolar estructura después de la digestión y la filtración. (B, C) que muestran Organoides estructura ductal y alveolar 2 días después de la colocación en cultivo primario; nota de la célula outgr principioowth (flechas blancas). (D) los vasos sanguíneos pequeños fijados y con el inicio de los cultivos de fibroblastos consecuencia mismos como B, C. (E) derivación de células epiteliales de la cultura organoide primario después de 4 días. Linajes se identifican mediante tinción con anticuerpos a K14 (rojo) y K19 (verde); núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Luminal (K14-/K19 +, verde), mioepiteliales (K14 + /-K19, rojo), y progenitor (K14 + / K19 +, amarillo), las células son visibles. Células no teñidas se observan en el núcleo organoide debido a la penetración anticuerpo incompleto. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Organoides crecimiento de cultivos HMEC en formulaciones diferentes medios de comunicación. Obtenidas de un individuo, la muestra de 184, se iniciaron en cultivo primario utilizando formulaciones diferentes medios de comunicación. Mejor crecimiento a largo plazo se obtiene utilizando nuestra formulación más reciente, M87A + oxitocina (X) 4. Este medio también soportael crecimiento de múltiples linajes HMEC (véase la fig. 1E). Un anterior formulación de medios, MM 3 proporcionado crecimiento menos robusto, mientras que un medio libre de suero, MCDB170 (comercial MEGM) 17 conduce a la inducción rápida de la ciclina quinasa inhibidor de p16 INK4a y la selección de células aberrantes 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Figura 3. Comparación de la diversidad linaje en organoides uncultured y HMEC cultivaron a 4 º paso. (A, B) análisis FACS de un organoide uncultured, disociado enzimáticamente para (A) expresión de EpCAM y CD49f/alpha 6 integrina, y CD227/Muc1 (B) y CD10/CALLA. (C, D) Análisis FACS de 4 º paso pre-estasis HMEC para la expresión de (C) y la integrina EpCAM CD49f/alpha 6, y (D) y CD227/Muc1 CD10/CALLA. P identificableopulations se etiquetan como LEP (luminal expresar EpCAM o marcadores CD227), MEP (que expresan marcadores mioepiteliales CD49f o CD10) o PROG (enriquecido en el CD49f + / EpCAM población +). Tenga en cuenta que durante la adaptación a la regulación de los cambios de cultura EpCAM y CD49f comparación con organoides uncultured. (E) Unsorted HMEC FACS y enriquecida con LEP y diputado en el paso 4 ª tiñeron para análisis de inmunofluorescencia de la queratina K14 (MEP marcador) y K19 (LEP marcador) para verificar la identificación de linaje. Núcleos teñidos con DAPI aparecen de color azul. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Figura 4. HMEC cultivadas son capaces de formar estructuras organizadas con relaciones de linaje en vivo-como cuando se colocan en microentornos adecuados. (A) Pre-estasis 4 º paso HMEC fueron FACS enriquecido into luminal LEP y linajes MEP utilizando marcadores mioepiteliales para CD227 y CD10, con estos linajes verificados por la expresión de K14 y K19 (no se muestra). (B) Cuando se mezclan en micropatterned pocillos, las células cultivadas fueron capaces de auto-organización en bicapas con MEP en el exterior e interior LEP [Adaptado de Chanson et al. 5]. Marcada con fluorescencia LEP (verde) y MEP (rojo) se obtuvieron imágenes con un microscopio confocal a 0 h, 24 h, y 48 h después de la adición a los micropocillos (superior). Control de HMEC fueron etiquetados arbitrariamente con marcadores fluorescentes de color rojo o verde (inferior). (C) Imagen de campo brillante de las células progenitoras enriquecidas con FACS (cKit +) sembraron en 3D (Matrigel) cultivo y se cultivaron durante 18 días. Estructuras resultantes pueden exhibir morfogénesis alveolar. (D) Las estructuras fueron extraídos de Matrigel y se tiñeron para detectar K14 y K19; núcleos se contratiñeron con DAPI. Análisis de inmunofluorescencia muestra las estructuras organizadas con pola correcta luminal y basaldad.

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Un método para procesar humano material de descarte mamaria quirúrgica se describe. Tejido procesado, en forma de organoides, se pueden almacenar indefinidamente congelados o ponen en cultivo para crecimiento a largo plazo. Este método permite el examen experimental de la normalidad biología celular epitelial humana, y los efectos de las perturbaciones exógenas.

Procesamiento de mamoplastia de reducción y tejidos humanos Mastectomía para el cultivo celular

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K vistas.  Lawrence Berkeley National Laboratory. Un método para procesar humano material de descarte mamaria quirúrgica se describe. Tejido procesado, en forma de organoides, se pueden almacenar indefinidamente congelados o ponen en cultivo para crecimiento a largo plazo. Este método permite el examen experimental de la normalidad biología celular epitelial humana, y los efectos de las perturbaciones exógenas.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Procesamiento de tejido primario Tumor cerebral para ensayos con células madre y flujo de Ordenación

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Investigación

Medicina

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

El aislamiento, la cultura, y de imágenes de Human Fetal pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Cultivo primario de Human vestibular schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Humano Dupuytren<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para el Estudio de miofibroblastos y matriz extracelular Interacciones

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere Ensayo Formación de cáncer de mama humano tejidos y líneas celulares

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Trabajar con Tejidos Humanos para la Investigación del Cáncer Traslacional

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Un Modelo de Cultura de Rebanadas Organotípicas de Glioblastoma Humano para el Estudio de la Migración de las Células Tumorales y los Efectos Específicos para el Paciente de los Medicamentos Anti-Invasivos

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensional de alginato-grano Cultura de células humanas del adenoma pituitario

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodología para la inducción de esputo y el procesamiento de laboratorio

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...