MAL, JCG ve MRS NIA (R00AG033176 ve R01AG040081) tarafından ve Laboratuvar Yönlendirilmiş Araştırma ve Geliştirme, # DE-AC02-05CH11231 Enerji sözleşme ABD tarafından desteklenmektedir.

1. Doku İşleme ve Sindirim <ol><li> Cerrahi girişimlerden ıskarta malzeme olarak insan meme dokusu elde edilir. Azaltma mammoplasties normal veya iyi huylu hücreleri sağlayabilir; fibroadenom ve gynecomastias huylu hücreleri sağlamak; tümör olmayan mastektomi dokuları (periferik ya da tümöre kontralateral veya subkutan) normalden içeren microtumors benign kadar değişebilir hücreleri verin. Uygun IRB onayı öncesinde ıskarta malzeme elde bulunduğundan emin olun. Tüm malzeme kan ile taşınan patojen düzenlemeler altında tedavi edilmelidir. </li><li> Ya da tampon ortamı içeren steril kaplar (örneğin 1:01 Dulbecco Modified Eagle Medium ve Ham&#39;ın F-12) içinde yer malzeme 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 5 ug / ml Fungizone, 50U/ml polimiksin B, ile desteklenmiş 4, laboratuar ve% 10 fetal bovin serumu, ve nakil ° C. Azaltma mammoplasty dokusu belirgin pa etkilemeden 72 saat süreyle 4 ° C&#39;de saklanan ya da sevk edilebilirbsequent hücre canlılığı. Olmayan azalma mammoplasty küçük doku parçaları daha hızlı işleme gerektirebilir. </li><li> Steril neşter, forseps ve makas bir arada kullanarak yağ dokusu, bağ dokusu ve kan damarlarının stromal matriks gelen epitelyal alanlarda ayırın. Büyük bir cam steril çanak makas ve yer ile doku parçaları (örneğin, 150 mm) kesin. Yavaşça fena halde yağ malzeme uzakta kazımak için malzeme ve neşteri tutmak için forseps kullanarak, sarımsı stromal matriks içinde gömülü beyaz iplikçikler olarak görünür epitel alanlar üzerinden teşrih. Hazmı kolaylaştırmak için, 50 ml&#39;lik bir deney tüpüne karşıt neşter ve yer kullanarak ~ 3-4 mm küçük parçalar halinde epitel doku kesti. Doku büyük miktarlarda işleniyor ise, taze neşter bıçakları gerekli olabilir. Kurumsal düzenlemelere göre imha için çanak yağlı malzemeyi çıkarın. <ol class="lalpha"><li> Yoğun fibröz doku (örneğin, subkutan masŞiddetli fibrokistik hastalığı olan tectomies), daha katı beyaz, non-epitelyal malzeme olacaktır. Böyle fibröz matrislerinden epitel hücreleri incelemek için zor olabilir. Lifli malzemeden Büyük parçalar alanında ~ 1-3 mm kare ve ayrı sindirilir küçük parçalar halinde kesilebilir. </li></ol></li><li> Tüpün hacmi büyük olmayan bir daha üçüncü ihtiva eden doku ile bir konik santrifüj tüpü (50 ml veya 15 mL) içine parçalanmış, epitel doku yerleştirin. Doku sindirimi bir karışım (DME/F-12 ya da eşdeğer, 10 ug / ml insulin, yukarıdaki gibi antibiyotikler, ve 10, nihai konsantrasyonu kullanılarak, rotasyon esnasında karıştırma için izin vermek için sadece küçük bir hava boşluk bırakarak, dolu hacme tüp getirin % FCS, 200 U / ml ham kolajenaz ve 100 U / ml hiyaluronidaz. </li><li> Place HulaMixer tüp döndürücü üzerindeki tüpler ve 37 geceleme 8 rpm&#39;de 360 ​​° döndürmek ° C. </li><li> 5 dakika boyunca 600 x g tüpler santrifüjleyin. Bertaraf anlaşmasının süpernatant yağ ve orta atınkurumsal düzenlemelere ing. </li><li> Ortam içinde pelet bir küçük kısım seyreltilmesi ile sindirim tamamlanması için kontrol edin. Sindirim mikroskobik inceleme ekli stromada (Şekil 1A) arınmış pürüzsüz görünümlü, duktal alveoler veya duktal-Alveoler yapıların sahip hücreleri kümeleri (organoids) gösterdiğinde tamamlandı. Azaltma mammoplasty dokular genellikle hala bir gecede sindirim sonra ekteki stromada gösterecek ve ek sindirim zaman gerektirecektir. <ol class="lalpha"><li> Başka bir 4-12 saat boyunca 37 ° C &#39;de dönme ile taze doku sindirim ve karışım yeniden inkübe tam olarak sindirilmiş pelet yeniden süspanse edin. Adımları 1.6 ve 1.7 tekrarlayın. Sindirim hala tamamlanmamış ise, yine 37 ° C&#39;da rotasyonu ile pelet ve yeniden inkübe sindirim karışımı ekleyin. Enzim konsantrasyonu üzerinde bir gecede-sindirim önlemek için düşürülebilir. </li></ol></li><li> Sindirim tamamlandığında, 5 dakika boyunca 600 x g santrifüj tüpleri, özet aspireyaklaşık 15 ml/50 ml tüp, 5 ml/15 ml tüp yerinde orta artı antibiyotik iyon karışımı, tekrar süspansiyon pelet. </li></ol> 2. Filtrasyon ve Sindirilmiş Malzeme Donma <ol><li> Steril bir 50 ml tüp üzerinde steril bir 100 mikron süzgeçli üzerine yeniden süspanse pelet alikotları aktarın. Tüp içine orta tahliye edelim, sonra orta 2-3 ml üst 1-2x kez organoids rewash. Yeniden süspanse pelet tüm devredilmiştir kadar tekrarlayın. Çok sayıda filtre üzerinde organoids ve orta artık kolayca drene var ise, kalan madde yeni bir filtre (ler) kullanılır. Dikkatlice bir steril tüp üstüne filtre (ler) çevirin ve daha orta tüpüne organoids yıkayın. Bu 100 mikron organoid havuzudur. </li><li> Orijinal 50 ml tüp içine drene materyal atın ve çoğunlukla Alveoler yapıların bulunduğu 40 mikron organoid havuzu, elde etmek, 40 mikron süzgeçli kullanarak 2.1 işlemi tekrarlayın. Inci drene malzemesiE tüpü mezenkimal ve epitel hücrelerin damar küçük parçalar tek / küçük öbekler içeren süzüntü havuzu oluşturmaktadır. </li><li> 5 dakika boyunca 600 xg&#39;de Pelet 100 um, 40 um, ve süzüntü havuzlar. </li><li> Süpernatant, sulandırmak paketlenmiş pelet, 0.1 ml başına CPMII yaklaşık 1 ml kullanılarak CPM II (DME/F-12 ya da% 44 FCS ve% 6 DMSO ile eşdeğer) olarak her bir tüp aspire. 4 ° C&#39;de tutun </li><li> Aşağıda 3.2 gibi damla 35 mm doku kültürü plastik tabak damla içine yeniden süspanse malzeme 0.1 ml koyarak Tohum 2 organoid havuzları için bir test çanak. Süzülen madde havuzu doğrudan fibroblast ortam (10 ug / ml insulin,% 10 FBS ile DME/F-12 ya da eşdeğeri) ile doku kültür plastik üzerine ekildi edilebilir. </li><li> Nunc tip dondurma ampul (1 ml / 2 ml ampul) içine tablet kalan malzeme yeniden süspanse. -80 ° C sıcaklıkta gece boyunca dondurmak ve daha sonra sıvı azot içinde saklama için derhal aktarın. Biz canlılığı herhangi önemli bir kayıp gözlenmiştir değilbizim orijinal ampul saklanan geç 1970 yılından bu yana dondurulmuş. </li></ol> 3. Dondurulmuş Organoids ve İlköğretim Kültürlerin Altkültür Tohum <ol><li> Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde organoids içeren dondurulmuş ampul eritin. Ampul içinde organoids sayısı görsel tahmini bağlı olarak 2-10 (genelde ~ 6) 60 mm tabaklar, ya da 1-3 100 mm tabaklar içine Tohum organoids. 60 mm tabak başına ekilmiş yaklaşık 20-40 organoids uygunudur. </li><li> Çözülmüş organoids özenle yerleştirilir, organoids eşit bir şekilde dağıtımı için 1 ml pipet veya Pasteur pipeti ile çanak yüzeye, damla damla. Organoids birbirine yakın altkültür ya da dondurma için daha az hücre sebebiyet veren, akıbet için sınırlı alana sahip olacaktır yerleştirilir. (Hücreler geçmişte çizilmiş yüzeylere büyümek değil eğilimindedir) çanak yüzeyi çizilmeye kaçının. Organoids takın ve daha sonra yavaşça organoids (örneğin 2-3 ml/60 mm çanak) yerini değiştirmemek önlemek için üreme ortamı eklemek için izin vermek için 1-2 dakika bekleyin. Ben37 ° C nemlendirilmiş CO 2 inkübatör ncubate. Bunlar, primer kültürlerden vardır. Şu anda en sağlam HMEC büyüme (Şekil 2) için M87A + oksitosin (X) orta kullanın. </li><li> 1 gün sonra, organoids takılı olup olmadığını kontrol. Ek orta (ör. 2-3 ml/60 mm çanak) ekleyin. Organoids gelen Hücre göçü tohumlama sonrası 48-72 saat (Şekil 1B, C) ​​24-48 saat ve mitotik akıbet tarafından görünür olmalıdır. Bazen eki özellikle yaşlı kadınlar overdigested organoids veya organoids kaplama varsa, 24 saat sonra kötü, ama en hazırlıklar 72 saat içinde eklenecektir. Damar küçük parçalar eklemek ve fibroblast hücre akıbet (Şekil 1D) yol açabilir. </li><li> Kültürler en az haftada 3 kez besleyin. M87A-tipi medya yetiştirilen hücreler ekim yoğunluğu bağlı olarak 5-8 gün içinde yakınındaki izdiham büyür. </li><li> Esas önemli fibroblast büyüme, Diferansiyel trypsinization (DT), varsayüzey plastik fibroblastlann hızlı ayrılma, fibroblastlar kaldırmak için gereklidir. Epitel yamalar STE (salin,% 0.05 tripsin,% 0.02 EDTA), aspirat büyük, aspirat medya, yıkama çanak (örneğin, 1-2 ml/60 mm çanak) hale geldiğinde, oda sıcaklığında taze 0,5 ml STE ekleyin ve bırakın Sürekli mikroskobik gözlem ile yaklaşık 1 dk. Fibroblastlar ayırmak ancak epitel hücreleri nazikçe, hala yapışık ancak keskin fibroblastlar çıkarmak için sert bir yüzeye karşı çanak yan vurmak ve daha sonra hızlı bir şekilde aspire zaman. PBS ile bir kez yıkayın ve tekrar aspire. Ağır fibroblastlar ile kirlenmiş Kültürler, ilave DT gerekebilir. </li><li> Büyük epitel yamalar mevcut primer kültürlerinde altkültür, ama izdiham önce. Organoid tohumlama ve bağlanma yoğunluğu gereken süre de etkiler. Primer kültür korumak için ve zamanla aralıklı birden fazla ikincil kültürlere, üretmek için, biz Kısmi Trypsinizations (PT) gerçekleştirin. </li><li> Aspire medya, çanak 0.5 ml taze STE ekleyin, 1-2 ml STE ile 60 mm çanak yıkayın. Hücre ayırma desteklemek için çanak yumuşak vurma ile, 1-5 dakika için oda sıcaklığında mikroskop altında hücre ayırma dikkate alınmalıdır. Tripsinizasyonla hücrelerinin ~% 50 ayrılmış olduğunda kesilmelidir. Erken PT genellikle hızlı hücre dekolmanı var. Bütün hücrelerin hızla yerinden çıkabilir şekilde daha sonra puan için, hücreler, dikkatli kontrolü ile, daha hızlı ayrılması için 37 ° C &#39;de yerleştirilebilir. </li><li> Çanak serum içeren medya 2 ml ekleyin, repipette yıkayın ve steril bir 15 ml tüp aktarmak. Tüp yıkama ekleyerek, bir başka ~ 1-2 ml medya ile 2x tekrarlayın. Birincil çanağı tekrar çember yükleme ve inkübatör dönmek. Haemocytometer ile tüp hücreleri sayın. Kez pasaj, hücreler no lo vardır; ÖLÇÜMÜ pasaj veya dondurulmuş sekonder (ikinci pasaj hücreler sekonder denir gelen birincil yemekleri ve eşit uzun-vadeli büyüme iyi hücre büyümesi ile 8 yaklaşık 4 kez tekrar edilebilirnger primerler). Bir kez organoid malzeme primer kültürlerinde mevcut artık, pasaj ikinciller uzun vadeli nüfus katlama potansiyeli bir düşüş göstermektedir. </li><li><ol class="lalpha"><li> Ikincilleri altkültür için, tohum hücreleri doğrudan yemekleri içine tüp. Böyle M87A + X gibi bir sağlam orta 1-2 x 10 5 cells/100 mm çanak Tohum 4-7 gün izdiham yol açacaktır. Biz proliferatif potansiyelini artırmak için ikinci pasaj da orta kolera toksin ekleyin; bunu organoids gelen çok katmanlı hücre akıbet yol açar, çünkü kolera toksininin primer kültür çıkarılmıştır. </li><li> Dondurulması için ikincil olarak, pelet, tüp 10 6 hücre / ml &#39;lik bir nihai yoğunluğa sahip CPMII de 5 dakika ve tekrar süspansiyon için 600 x g&#39;da. Tablet, Nunc tipi dondurucu ampul içine hücreleri yeniden süspanse -80 gecede dondurmak ° C ve daha sonra sıvı azot depolama derhal aktarın. </li></ol></li><li> Bu koruma için ilk PT hücreleri dondurmak tavsiye edilir vealtkültür için ikinci PT hücreleri kullanır. Ek ÖLÇÜMÜ ileride kullanılmak üzere dondurulabilir saklanabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Prowse, K. R., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+tissue-specific+regulation+of+mouse+telomerase+and+telomere+length.">Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).</li><li>Gil, J., Peters, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+INK4b-ARF-INK4a+tumour+suppressor+locus:+all+for+one+or+one+for+all.">Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).</li><li>Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Normal+Human+Mammary+Epithelial+Cells+in+Culture.">Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture.</a> In Vitro. 16, 415-425 (1980).</li><li>Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinctions+between+the+stasis+and+telomere+attrition+senescence+barriers+demonstrated+by+long-term+culture+of+normal+human+mammary+epithelial+cells.">Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells.</a> Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).</li><li>Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).</li><li>Stampfer, M. R., Bartley, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transformation+and+continuous+cell+lines+from+normal+human+mammary+epithelial+cells+after+exposure+to+benzo(a)pyrene.">Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).</li><li>Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p16+expression+with+first+senescence+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+and+extended+growth+capacity+with+inactivation.">Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation.</a> Oncogene. 17, 199-205 (1998).</li><li>Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf-1-induced+growth+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+is+p16-independent+and+is+overcome+in+immortal+cells+during+conversion.">Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion.</a> Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).</li><li>Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+p53+function+accelerates+acquisition+of+telomerase+activity+in+indefinite+lifespan+human+mammary+epithelial+cell+lines.">Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines.</a> Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).</li><li>Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -. L., Ljung, B. -. M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+genome+instability+in+breast+cancer.">In situ analysis of genome instability in breast cancer.</a> Nat Gene. 36, 984-988 (2004).</li><li>Li, Y., Pan, J., Li, J. -. L., Lee, J. -. H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+associated+with+breast+cancer+occur+as+normal+human+mammary+epithelial+cells+overcome+senescence+barriers+and+become+immortalized.">Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized.</a> Mol. Cancer. 6, (2007).</li><li>Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+function+in+cultured+human+mammary+epithelial+cells+turns+the+telomere-length+dependent+senescence+barrier+from+agonescence+into+crisis.">Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis.</a> Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).</li><li>Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-wise+DNA+methylation+changes+are+linked+to+escape+from+defined+proliferation+barriers+and+mammary+epithelial+cell+immortalization.">Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization.</a> Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).</li><li>Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+normal+human+mammary+cell+type+specific+miRNAs.">Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs.</a> Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).</li><li>LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments.">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).</li><li>Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+multipotent+progenitors+with+a+basal+differentiation+bias+during+aging+of+human+mammary+epithelia.">Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia.</a> Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan insan meme dokusu işleme yöntemi insan meme hücre tiplerinin heterojen karışımı saf meme epitel hücreleri elde sağlar. Sabit büyüklükte gözenekler aracılığıyla Filtrasyon sindirilmiş stromal matriks gelen meme bezinin çeşitli fraksiyonları (örneğin, duktal ve duktal-alveoler vs alveol) ayrılması sağlar. İzogenik meme fibroblastlar epitel hücreleri maç için elde edilebilir. Dondurulmuş sindirilen malzemenin 30 yıl boyunca iyi bir canlılık korudu. Bu yöntem, tüm ama çok fibröz meme dokuları üzerinde başarıyla çalışmış ve gerçekleştirmek için basit gelmiştir. Meme dokusu işleme Diğer varyasyonları olarak uygulanabilir, temiz veya ayrılmış olan epitelyal kesirler vermeyin var. Böyle M87A gibi düşük stres yaratıcı medya kültürü işlenmiş organoids Yerleştirme birden soy belirteçleri ile HMEC uzun vadeli büyüme sağlar. Plastik kültüre oylandı HMEC hala cins yeteneğini korumakvivo benzeri soy ilişkileri normal te 3D yapılar. Bu HMEC kültürler Normal HMEC davranış ve yaşlanması ve dönüşüm itmek veya inhibe edebilir faktörlerinin yüksek verimlilik dahil olmak üzere kapsamlı deneysel incelenmesi, için uygundur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Cam Petri kabı 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Makas 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Forseps 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Atılabilir Neşterler </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidaz </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Ensülin </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / Streptomisin </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polimiksin B sülfat </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Yaşam Teknolojileri</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> % 0.05 tripsin 100 ml </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Hücre süzgeç 100 mikron </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Hücre süzgeç 40 mikron </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Tüpler 15 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Tüpler 50 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC yemekler 10 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC yemekleri 6 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Kriyojenik şişeleri </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser Bilimsel </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf modeli </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

Deneysel normal insan meme epitel hücresi (HMEC) davranış incelenmesi ve nasıl normal hücrelerin anormal mülk edinme, in vitro kültür sistemleri ile sağlanabilir in vivo, biyoloji daha doğru modeli. Hücre farklılaşması incelemek için insan kaynaklı malzemenin kullanımı, yaşlanma, yaşlanma, ve ölümsüzleşme 1-2 insan ve yaygın olarak kullanılan, kemirgen hücreler arasındaki bu özellikler de çok önemli moleküler farklılıklar nedeniyle özellikle avantajlıdır. Normal ve anormal dokular büyük miktarda azalma mammoplasty ve mastektomi ameliyatları frekansa bağlı bulunması nedeniyle meme hücreleri uygun bir model sistem sunuyoruz. Meme bezi çok sayıda farklı hücre türleri, örneğin, epitel, yağ, mezenkimal, endotelyal karmaşık bir karışım oluşur. Epitel hücreleri, laktasyon farklılaşmış meme fonksiyonu sorumludurve aynı zamanda insan meme kanserlerinin büyük çoğunluğunun kökeni vardır. Biz saf epitel bileşenleri içine yanı sıra mezenkimal hücreler 3 meme bezinin cerrahi ıskarta dokuları işlemek için yöntemler geliştirmişlerdir. Işlenmiş materyal süresiz dondurularak veya primer kültürü içine başlatılabilir. Cerrahi ıskarta malzeme laboratuara getirilerek elle epitel içeren dokuların için zenginleştirmek için disseke edilir. Disseke doku sonraki sindirim bazal membran epithelia gelen kollajenaz ve hyaluronidaz şeritler stromal malzeme kullanarak. Epitelyal ağacının çıkan küçük parçalar (organoids) sabit gözenek boyutu membranları üzerinde ardışık süzme ile sindirilmiş stroma ayrılabilir. Gözenek büyüklüğüne bağlı olarak, daha büyük bir fraksiyonu alveolar / duktal parçaları, daha küçük boşluklu kümeleri ya da stromal hücrelerin oluşan elde edilebilir. Kültürler dis gibi yerine organoids olarak başlatılan zaman biz üstün bir büyüme gözlemlediksociated tek hücre. Düşük stres indükleyici medya kullanarak kültür organoids Yerleştirme birden soy türleri (myoepitelyal luminal, progenitör) 4-5 belirteçleri normal HMEC uzun vadeli büyüme destekler. Hücrelerin yeterli sayıda yüksek üretim yöntemleri kullanılarak standart hücre gruplar, hem de sorgulama kullanılarak geniş deneysel inceleme izin verecek şekilde bir bireyin dokusundan elde edilebilir. Kültürlü HMEC büyüme, farklılaşma, yaşlanma ve yaşlanma, ve nasıl bu normal süreçler ölümsüz ve malign transformasyon 4-15,16 sırasında değişmiş yöneten normal süreçleri araştıran çalışmaların geniş bir yelpazede istihdam edilmiştir. Ekstrasellüler matris malzemesi, diğer hücre tipleri ve / veya 3D kültür varlığında büyüme etkileri plastik 5,15 üzerinde büyüme ile mukayese edilebilir. Kültürlü HMEC, normal hücreler ile başlayarak, bu faktörleri incelemek için bir deneysel olarak çözülebilir bir sistem sağlamakinsan yaşlanması ve karsinogenez itmek veya önleyebilir.

Uygun organoids ile sindirilir ve kültür içinde yerleştirilmiş doku için Örnek Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Eksik sindirilmiş doku malzemesi yine bu yapıların dışında bağlı, ve büyük olasılıkla DT kaldırmak gerektiren, primer kültür bazı fibroblastik hücre büyümesi olacak gösterecektir. Overdigested dokusu daha az düzgün dış sınırlar gösterecek, ve primer kültür takmak için uzun sürebilir. Epitel akıbet 48-72 saat (1B, C) ​​içerisinde başlamalıdır. Damar (1D) küçük parçaları mezenkimal hücre akıbet bir kaynak olabilir. Epitel çıkıntılar myoepitelyal, progenitör ve lümen soylar (1E, 3C-E) ile ilişkili marker ile hücrelerin karışımlar içerir proliferatif nüfusa sahip, morfolojik heterojen popülasyonlarının göstermektedir. Kolera toksini ve oksitosin ile desteklenmiş gibi M87A gibi düşük stres ortamında büyüme nitelikli uzun vadeli destek verecekNormal ön durağanlığı HMEC büyüme önceki ortam formülasyonu (Şekil 2) ile karşılaştırıldı. Bundan sonra, çoğu hücreler sadece myoepitelyal soy işaretleri göstermek; M87A-tipi medya da 4-8 (Şekil 3C-E, 4) pasajlar aracılığıyla luminal ve progenitör hücrelerin büyümeyi destekleyecek. Plastik kültüre HMEC myoepithelial hücreleri (Şekil 4A, B) iç lümen hücreleri ile, micropatterned 3D mikro öz-örgütlenme uygun 3D oluşturmak için yeteneklerini koruyabilir ve Matrigel (4C, D) kaplama yaparken organize yapılar oluştururlar. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. HMEC organoids ve birincil kültür. (A) organoid sindirim ve filtrasyondan sonra duktal-alveolar yapısını göstermektedir. (B, C) 2 gün primer kültür yerleştirme sonrası duktal ve alveolar yapısını gösteren Organoids; başlangıç ​​hücresi outgr unutmayınowth (beyaz oklar). (D) Küçük damar ve B, C gibi aynı kültürden fibroblast akıbet başlangıç ​​ile ekli 4 gün sonra primer kültür organoid (E) Epitelyal hücre sonucudur. Soy K14 (kırmızı) ve K19 (yeşil) karşı antikorlar ile boyanarak tanımlanır; çekirdeklerin DAPI (mavi) ile boyandı. Luminal (K14-/K19 +, yeşil), myoepitelyal (K14 + / K19-, kırmızı), ve progenitör (K14 + / K19 + sarı) hücreleri görülebilir. Boyanmamış hücrelerinin eksik antikor nüfuz dolayı organoid çekirdek görülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Tek bir kişi, örnek 184, elde edilen farklı medya formülasyonlarda HMEC kültürlerin Büyüme. Organoids farklı medya formülasyonları kullanılarak primer kültür başlanmıştır. En iyi uzun vadeli büyüme bizim en son formülasyon, M87A + oksitosin (X) 4 kullanılarak elde edilmektedir. Bu besiyeri de desteklerBirden HMEC soy büyüme (Şekil. 1E bakın). Bir önceki medya formülasyon, 3 MM az güçlü büyüme sağlanan sırasında serum serbest medya MCDB170 (ticari MEGM) hızlı siklin kinaz inhibitörü p16 INK4A indüksiyonu ve 7,11,13 anormal hücrelerin seçimi için 17 ipucu. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Şekil 3,. (A) ve EpCAM CD49f/alpha 6 integrin ifadesi, ve (B) CD227/Muc1 için bir kültürsüz, enzimatik olarak ayrışmış organoid 4 inci geçiş. (A, B) FACS analizi de kültürsüz organoids ve kültürlü HMEC içinde soy çeşitlilik karşılaştırılması ve CD10/CALLA. (C, D) FACS (C) EpCAM ve CD49f/alpha 6 integrin ekspresyonu için 4 inci geçiş öncesi durağanlığı HMEC analizi, ve (D) CD227/Muc1 ve CD10/CALLA. Tanımlanabilir populations LEP (lümen belirteçleri EPCAM veya CD227 eksprese), MEP (myoepitelyal belirteçleri CD49f veya CD10 eksprese eden), veya PROG (CD49f + / EPCAM + nüfus zenginleştirilmiş) olarak etiketlenir. EpCAM ve CD49f değişiklikler kültürü yönetmeliğe uyum sürecinde kültürsüz organoids kıyasla unutmayın. (E) Unsorted HMEC ve 4. paragraflarını FACS zenginleştirilmiş LEP ve MEP soy kimlik doğrulamak için keratin K14 (MEP belirteci) ve K19 (LEP belirteci) immünofloresan analiz için boyandı. DAPI ile Çekirdekler lekeli mavi görünür. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Şekil 4. Kültürlü HMEC uygun mikro yerleştirilir vivo gibi soy ilişkileri ile organize yapılar oluşturma yeteneğine sahiptirler. (A) Pre-durağanlığı 4. pasaj HMEC FACS-zenginleştirilmiş i olmuşturnto lümen LEP ve myoepitelyal MEP soyları (şekilde gösterilmemiştir) ve K14 K19 ekspresyonu tarafından doğrulanması, bu soyların birlikte, CD10 ve CD227 için belirteçleri kullanarak. (B) micropatterned mikro birlikte karıştırıldığında, kültür hücreleri dışında ve LEP iç üzerine MEP ile Bilayerlar içine öz-örgütlenme yeteneğine sahip idi [Chanson ark uyarlanmıştır. 5]. Floresan etiketli LEP (yeşil) ve MEP (kırmızı) mikro (üst) ek sonra bir konfokal 0 saatte mikroskop, 24 saat ve 48 saat ile görüntülendi. Kontrol HMEC keyfi kırmızı veya yeşil floresan etiket (alt) ile işaretlendi. (C) FACS zenginleştirilmiş progenitör hücrelerin Aydınlık alan görüntüsü (cKit +) 3D (Matrigel) kültür kaplama ve 18 gün boyunca büyüdü. Ortaya çıkan yapılar alveoler morfolojilerinden sergileyebilmektedir. (D) Yapıları Matrigel çıkarılan ve K14 ve K19 tespit etmek boyandı; çekirdeklerin DAPI ile zıt edildi. Immünofloresan analiz doğru lümen ve bazal pola ile organize yapılar gösterirLineerite.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture at JoVE.com

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Insan meme cerrahi ıskarta malzeme işlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Organoids şeklinde işlenmiş doku, süresiz olarak dondurulmuş ya da uzun süreli büyüme için kültür içinde yerleştirilmiş saklanabilir. Bu yöntem deneysel normal insan epitel hücre biyolojisi incelenmesi ve eksojen pertürbasyonların etkileri sağlar.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

processing-human-reduction-mammoplasty-mastectomy-tissues-for-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K Görüntüleme.  Lawrence Berkeley National Laboratory. Insan meme cerrahi ıskarta malzeme işlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Organoids şeklinde işlenmiş doku, süresiz olarak dondurulmuş ya da uzun süreli büyüme için kültür içinde yerleştirilmiş saklanabilir. Bu yöntem deneysel normal insan epitel hücre biyolojisi incelenmesi ve eksojen pertürbasyonların etkileri sağlar.