ونود أن نشكر Schippers لورا لكتابة النسخة الأولى من بروتوكول التحميل الخليوي وماركوس دي Goffau وجيلي Zampar لتسجيل الأشكال التضاريسية الميتوكوندريا.

1. إنتاج وإعداد قالب رقاقة السيليكون يتم إنشاء رقائق ميكروفلويديك من قالب رقاقة السيليكون التي تنتجها الطباعة الحجرية الناعمة. هذه الرقائق يمكن إعادة استخدامها مرات عديدة لإنتاج رقائق ميكروفلويديك. فإنه من المستحسن أن يتم تنفيذ إنتاج رقاقة منها من قبل مجموعة متخصصة في على microfluidics 6. يرصد الرقاقة في عملية ضوئيه من خطوتين باستخدام اثنين من طبقات مختلفة من مقاومة للضوء سلبي، SU-8 7. يتم استخدام الطبقة السفلية لتوليد منطقة محاصرة خلية (SU-8 2002؛ ارتفاع 3-4 ميكرون)، في حين يتم إجراء قنوات مع الطبقة العليا (SU-8 لعام 2010؛ ارتفاع 10 ميكرون). انطباع من عملية الإنتاج رقاقة يمكن العثور عليها في هوانغ وآخرون 8. ويمكن الحصول على رسومات من رقائق ميكروفلويديك من المؤلفين وكذلك المشورة بشأن كيفية الحصول على رقاقة منها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم الحصول على رقاقة، وقطع قطعة واحدة من الباحث صعبة-الدلاليةس شرائح رقيقة من حوالي 0.5 مم 3 مم مع مشرط ووضعها بعناية على رقاقة قليلا على الجزء العلوي من هيكل قناة بين القنوات مدخل ومجموعة micropad (الشكل 2A). وهذا سوف يؤدي إلى تشكيل قناة إضافية كبيرة في كل رقاقة، والتي لن تستخدم إلا أثناء التحميل الخلية، ولكن المهم أيضا لتشغيل مستقر للجهاز ميكروفلويديك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية صحن الزجاج بيتري مع طبقة مزدوجة من رقائق الألومنيوم ووضع رقاقة في طبق بيتري. فإن رقائق الألومنيوم منع من الترشح في PDMS بين رقاقة وطبق بيتري. إذا PDMS يفعل زحف في بين رقاقة وطبق بيتري الزجاج، وسوف الرقاقة تصبح ثابتة بشكل دائم في طبق بيتري. على الرغم من أن لا تزال صالحة للاستعمال رقاقة، فإنه لن يكون من الممكن استبدال طبق بتري الزجاج اذا غيرت وسوف تحتاج إلى PDMS إلى قطع بعد ذلك. </li></ol> 2. إنتاج رقائق ميكروفلويديك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البلاستيكية الفارغةالكاس على التوازن والتوازن الفارغة. صب 40 ز PDMS قاعدة في كوب من البلاستيك (لزجاج قطرها سم طبق بتري 12). إضافة PDMS كيل علاج مع ماصة القابل للتصرف في فصيل عبد الواحد / ث نسبة 01:10، أي حوالي 4 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط PDMS وكيل علاج شامل لعدة دقائق. ويمكن أن يتم هذا مع ماصة البلاستيكية التي تم استخدامها لماصة وكيل علاج. فمن المهم أن الخليط يختلط جيدا قبل صب على رأس الرقاقة. سوف الفقراء خلط يسبب جزء من PDMS ليس لبلمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب PDMS على رأس رقاقة في طبق بيتري الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف خلط PDMS مع وكيل علاج يؤدي إلى تشكيل فقاعة في الخليط PDMS. تحتاج هذه الفقاعات إلى إزالتها قبل يبلمر في PDMS. وPDMS يمكن degassed بعد صب على رأس الرقاقة عن طريق وضع طبق بتري في مجفف متصلة مضخة فراغ. مع هذا الإعداد، ويستغرق حوالي 30 دقيقة لإزالة جميع فقاعات من الخليط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلمرة اله PDMS عن طريق وضع طبق بتري مع رقاقة فوق طبق ساخن عند 120 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم في 65 درجة مئوية لمدة ساعة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة رقائق الألومنيوم مع رقاقة وبلمرة PDMS من طبق بيتري الزجاج. تقشر رقائق الألومنيوم وطبقة رقيقة من بلمرة المتبقية PDMS من الجزء الخلفي من الرقاقة. ويمكن بعد ذلك فصل طبقة من PDMS على رأس رقاقة من رقاقة من قبل رفعه لأعلى بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبقة PDMS رأسا على عقب (مع القنوات التي تواجه متابعة) على مقاعد البدلاء وقطع وتصاميم رقاقة واحدة مطبوع على PDMS بعناية مع مشرط. محاولة للاحتفاظ حوالي 3 ملم من PDMS حول حواف القنوات لتحسين مرفق من الشريحة إلى غطاء زجاجي في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقوب لكمة في PDMS في نهايات مدخل، مخرج والجانب قناة (الشكل 2A) عن طريق دفع كعب لور قياس 20 على طول الطريق من خلال PDMS بطريقة مباشرة. </li></ol> تأكد من أن رقاقة PDMSلا يزال الكذب رأسا على عقب على مقاعد البدلاء في حين اللكم الثقوب. هذا يمنع PDMS من الالتصاق إلى داخل القناة، والذي يمكن أن يسبب انسداد في القناة. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد كل ثقب اللكم، وإزالة عمود من PDMS في كعب لور مع ملاقط قبل سحب كعب مرة أخرى. العمود PDMS يمكن أن تبقى مدفونة خلف ومنع ثقب فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف السطوح من رقاقة من جزيئات الغبار وPDMS المتبقية عن طريق وضع لاصق شفاف على ذلك، وإزالة الشريط فورا مرة أخرى. وبالمثل تنظيف الغطاء الزجاجي الذي سيتم إرفاق رقاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة تنظيفها وغطاء زجاجي تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية من الفوق منظف للأشعة فوق البنفسجية الأوزون. يجب على الجانبين التي تحتاج إلى أن يكون الرهينة معا مواجهة مصباح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح PDMS وتغطية الزجاج لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 6-8 دقيقة، وبعد ذلك وضعت مباشرة على رقاقة على الغطاء الزجاجي عن طريق وضع الأسطح المكشوفة على رأس كل منهما الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط بلطف حول جوانب الرقاقةلتعزيز مرفق من PDMS على الزجاج غطاء وإزالة أي فقاعات الهواء. لا تنقر على الجزء العلوي من هيكل قناة لأن هذا قد يتسبب في micropads للحصول على تعلق على غطاء زجاجي كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع أدلى حديثا الإعداد ميكروفلويديك على طبق ساخن عند 100 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. اختبار قوة الترابط بين الغطاء الزجاجي وPDMS رقاقة من خلال محاولة لرفع حواف رقاقة PDMS قليلا. عندما كتلة PDMS لا يمكن رفعها من على سطح الزجاج، والترابط هو ناجح ورقاقة جاهزا للاستخدام. </li></ol> 3. إعداد المعالج لتحميل برنامج الأذان فشل جهاز ميكروفلويديك يمكن أن يسبب تسرب المتوسطة في المجهر. لتجنب هذا، فمن الاستشارية لاستخدام حامل معدني و / أو ختم الجانبين من رقاقة حيث يلتقي PDMS الزجاج مع طلاء الأظافر أو الغراء الايبوكسي. هذا يمنع تسرب المتوسطة في حال عدم المستعبدين رقاقة PDMS جيدا بما يكفي لغطاء زجاجي. أيضا الأنابيبويمكن تأمين الاتصالات حول نقاط الإدراج بطريقة مشابهة لتجنب تسرب من المتوسط. جهاز استشعار المياه الصنع التي تطفئ ضخ حقنة في حالة وجود تسرب يمكن استخدامها كإجراء وقائي سلامة إضافية. ويمكن الحصول على رسومات للحامل معدني مصممة خصيصا للرقاقة ميكروفلويديك من المؤلفين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة ميكروفلويديك في حامل معدني، مع هلام السيليكون بين الزجاج من رقاقة والأجزاء المعدنية للحامل لإنشاء ختم ماء. المسمار المكسرات بلطف، لا لكسر الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط أنابيب رقيقة (حوالي 5-15 سم) إلى جانب قناة وقناة منفذ للرقاقة. استخدام ملاقط يجعل من الاسهل لادخال الأنبوب في ثقبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء 50 مل لور لوك المحاقن مع مستنبت، وإزالة الهواء من الحقنة وتوصيله بشكل تسلسلي لمرشح حقنة، كعب لور قياس 20، أنبوب سميك قصير (حوالي 2 سم) وأنبوب رفيع. تأكد من أن حوض استحمام رقيقةالإلكترونية هي فترة كافية لتغطي المسافة بين ضخ حقنة والمسرح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الحقنة في ضخ حقنة، سريع إلى الأمام المضخة حتى أنبوب رفيع يتم تعبئة تماما مع المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع أنبوب رفيع متصلا حقنة في قناة مدخل للرقاقة، والسماح للتدفق المتوسطة من خلال رقاقة في 10 ميكرولتر / دقيقة (الشكل 2B). جمع المتوسطة مغادرة رقاقة (على سبيل المثال في طبق بتري). سيتم تشغيل المتوسطة خارج عن طريق قناة جانبية بسبب الفرق بين المقاومة جعلت صعبة-الدلالية قناة جانبية كبيرة والقناة منفذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة في المرحلة المجهر وضبط تركيز المجهر على منصات. </li></ol> ويفضل استخدام الغمر أهداف النفط خلال تلك الأهداف الغمر بالماء لأن النفط لن تجف على مراحل الساعة من التجربة. اعتمادا على المجهر قد يكون هناك مشاكل مع الإبقاء على جمعةocus خلال الساعات الأولى من التجربة. ولذلك فمن المستحسن ترك رقاقة ل 1-2 ساعات في المرحلة المجهر لذلك يمكن أن يستقر قبل تحميل الخلايا وبدء التجربة. 4. التحميل من خلايا الخميرة في رقاقة ميكروفلويديك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتوصيل 5 مل لور طرف الحقنة إلى كعب لور قياس 20 وأنبوب سميك (حوالي 3 سم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ عينة من ثقافة الخلية المراد تحميلها في رقاقة. </li></ol> العد الخلية المفضل للتحميل بين 1-5 × 10 6 خلايا لكل مل. الثقافات مع عدد الخلايا العالي تحتاج إلى أن تضعف قبل التحميل. عندما زراعة الخلايا على YPD والكفاءة التحميل الخلية يمكن تحسين مرات عديدة إذا تم غسلها الخلايا الأولى مع ومعلق في الحد الأدنى من المتوسط ​​يحتوي على نسبة الجلوكوز مماثلة قبل التحميل. خلال عملية للرقاقة، ويمكن مرة أخرى YPD المتوسطة استخدامها بأمان. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ما يقرب من 1 مل من تعليق الخلية في اله حقنة وإزالة كل الهواء من الحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض معدل تدفق ضخ حقنة إلى 0.5 ميكرولتر / دقيقة. فإن انخفاض تدفق واستمرار القسري بواسطة مضخة محقنة أثناء التحميل (في الخطوة 4.5) دفع الخلايا غير المرفقة خارج عن طريق قناة جانبية (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط حقنة تحتوي على تعليق خلية في أنبوب للقناة منفذ. تحميل الخلايا عن طريق الضغط على المكبس من المحاقن بلطف. مراقبة الخلايا القادمة في وتسوية تحت micropads عن طريق العين أو عن طريق شاشة الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الضغط على المكبس حتى خلايا كافية تسوية تحت منصات. الحمل الأمثل هو 1-3 خلايا لكل لوحة. كخلايا تسوية تحت منصات عشوائيا، فمن الشائع جدا أن عدد قليل من منصات لا تحتوي على أي تمتلئ الخلايا ومنصات أخرى تماما مع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الحقنة المستخدمة لتحميل الخلية وأنبوب سميك لأنها مرتبطة من أنابيب رقيقة من قناة مخرج، تدفق CH الجانبannel لبضع دقائق في معدلات التدفق العالي (10 ميكرولتر / دقيقة) لإزالة فقاعات الهواء و / أو الخلايا التي لم بعد الخروج من رقاقة (الشكل 2B). إذا لم تتم إزالة الخلايا من قناة الجانب، فإنها يمكن أن تبدأ في النمو في القناة الجانبية وتتداخل مع التجربة في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع تدفق ضخ حقنة يتراجع إلى 0.5 ميكرولتر / دقيقة وإغلاق قناة الجانب قبالة عن طريق توصيله إلى أنبوب سميك (حوالي 5 سم) تحتوي على المكونات القسطرة في نهايته (الشكل 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة تدفق إلى معدل التدفق النهائي من 1-5 ميكرولتر / دقيقة. قد تختلف الأسعار اعتمادا على تدفق المتوسطة وسلالة الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الفيلم مع إعدادات المجهر والكاميرا مناسبة لتحقيق الهدف من التجربة. تأكد من أن يتم تعيين سرعة من المرحلة المجهر لمثل هذه السرعة المنخفضة أن النفط يمكن أن يتبع. لتحديد عمر تنسخي، والخلايا صورة كل 10 دقيقة. لحماية الخلايا من كميات ضئيلة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية المنبعثة من الهالوجينمصباح، والذي يستخدم خلال اكتساب مدينة دبي للإنترنت، فإنه من المستحسن أن تضع فلتر الأشعة فوق البنفسجية إضافية في مسار الضوء. عندما باستخدام المجهر مضان، ويفضل أن صورة الخلايا أقل في كثير من الأحيان (مثل كل 20 دقيقة) لتجنب التأثيرات الضوئية. اكتمال التجربة عندما تكون جميع الخلايا تحميلها في بداية التجربة قد لقوا حتفهم، والتي في ظل الظروف العادية يستغرق فترة تصل إلى 5 أيام. فمن المستحسن للتحقق بانتظام والتركيز على الصور أثناء التجربة وإذا لزم الأمر تعديله. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth.">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast.">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures.">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cancer+stem+cell+migration+using+compartmentalizing+microfluidic+devices+and+live+cell+imaging.">Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+determining+yeast+replicative+life+span+in+a+long-lived+genetic+background.">Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).</li><li>Scheckhuber, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models.">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li><li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells.">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIR2/3/4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms.">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li><li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding.">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li><li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

طريقة ميكروفلويديك الموصوفة هنا هو أداة هامة في رواية الشيخوخة البحوث، لأنها تتيح الجيل بسيطة ومؤتمتة من الخميرة تنسخي البيانات العمر في تركيبة مع استمرار ارتفاع القرار التصوير. هذه الصفات هي تحسينات كبيرة على مدى الإمكانات التجريبية للطريقة تشريح الكلاسيكية، ولك...

تبرعم الخميرة هو كائن نموذجا هاما للشيخوخة البحوث 1. حتى دراسة مؤخرا تنسخي الشيخوخة في خلايا الخميرة كانت عملية شاقة تتطلب طريقة تشريح، في كل برعم التي تم إزالتها يدويا من الخلية الأم 2،3. لحل هذه المشكلة، قدمنا ​​مؤخرا إعداد ميكروفلويديك رواية قادرة على تتبع الخلايا الأم الفرد طوال حياتهم بأكملها عمر 4. في رقاقة لدينا ميكروفلويديك، محاصرون خلايا الخميرة تحت لينة micropads القائمة على المطاط الصناعي (انظر الشكل 1). استمرار تدفق المتوسطة يغسل بعيدا الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا وتوفر الخلايا مع المواد المغذية الطازجة. في تجربة واحدة، وتصل إلى 50 خلية الأم يمكن رصدها بطريقة مؤتمتة بالكامل طوال حياتهم بأكملها تنسخي العمر. ويرجع ذلك إلى الخصائص البصرية ممتازة للرقاقة ميكروفلويديك، فمن الممكن لرصد الجوانب المختلفة في وقت واحد من بيولوجيا الخلايا الخميرة (على سبيل المثال </EM&gt; باستخدام البروتينات الفلورية). مقارنة لطريقة تشريح الكلاسيكية، والإعداد ميكروفلويديك يوفر مزايا كبيرة. فإنه يضمن بيئة محددة وثابتة خلال التجربة الشيخوخة كله. لا يتطلب أي معدات متخصصة مكلفة ويمكن تشغيلها على أي المجهر مجهزة التركيز الآلي وقدراتهم الوقت الفاصل بين وكذلك درجة الحرارة للسيطرة على زراعة الخلية. يمكن تعلم إنتاج وتشغيل رقائق ميكروفلويديك في غضون بضعة أيام. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا يمكن تحميلها مباشرة من تنامي ثقافة أضعافا مضاعفة، ميزة على طريقة أخرى نشرت مؤخرا ميكروفلويديك 5، الأمر الذي يتطلب biotinylation من الخلايا الأم. مجتمعة مع عالية الدقة والتصوير، والأسلوب هو موضح هنا يمكن أن تستخدم لقياس التغيرات التدريجية في التشكل الخلوي، بروتين تعبير والتوطين خلال الخميرة الشيخوخة على نحو غير مسبوق. القدرة علىيوفر الرصد على المدى الطويل من الخلايا واحد أيضا إمكانيات فريدة من نوعها للدراسات دورة الخلية الخميرة. وقد تم تحسين هذه الطريقة مؤخرا على لإزالة biotinylation من البروتوكول 16، والتي نشرت في حين كان هذا المخطوط في الاستعراض.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

ونحن لشرح استخدام برنامج الإعداد ميكروفلويديك بسيطة، التي يمكن من خلالها تعقب خلايا الخميرة في مهدها واحدة طوال حياتها بأكملها. رقاقة ميكروفلويديك يستغل الفرق بين حجم الخلايا الأم وابنتها باستخدام مجموعة من micropads. عند تحميل، محاصرون الخلايا تحت هذه micropads، لأن المسافة بين micropad وغطاء زجاجي يشبه القطر من خلية الخميرة (3-4 ميكرون). بعد إجراء التحميل، يتم مسح مستنبت بشكل مستمر من خلال رقاقة، مما يخلق ليس فقط بيئة ثابتة ومحددة في كافة مراحل التجربة برمتها، ولكن أيضا الإحمرار خارج الخلايا الوليدة الناشئة، التي لا يتم الاحتفاظ تحت منصات نظرا لحجم أصغر بهم. الإعداد يحتفظ الخلايا الأم بكفاءة حتى أنه في تجربة واحدة تصل إلى 50 الخلايا الفردية يمكن رصدها بطريقة مؤتمتة بالكامل لمدة 5 أيام، إذا لزم الأمر، أو لفترة أطول. وبالإضافة إلى ذلك، الخصائص البصرية ممتازة للرقاقة تسمح عاليةالدقة التصوير من الخلايا أثناء عملية الشيخوخة بأكمله.

في هذا البروتوكول، يتم تحميل الخلايا في رقاقة ميكروفلويديك مباشرة من ثقافة منتصف الأسي. للتأكد ما إذا كان التوزيع العمري للخلايا المحاصرين في رقاقة ميكروفلويديك هي مماثلة لتلك الثقافة قبل التحميل، وكانت ملطخة الخلايا مع راصة القمح مترافق إلى FITC (WGA-FITC) لتصور ندوب بر?...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast at JoVE.com

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

نحن هنا وصف العملية من جهاز ميكروفلويديك الذي يسمح المستمر وعالية الدقة التصوير المجهري لخلايا الخميرة في مهدها واحد خلال تنسخي كاملة و / أو العمر الزمني.

المستمر الملاحظة المجهرية عالية الدقة من تنسخي الشيخوخة في الخميرة الناشيء.

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K Views.  University of Groningen. نحن هنا وصف العملية من جهاز ميكروفلويديك الذي يسمح المستمر وعالية الدقة التصوير المجهري لخلايا الخميرة في مهدها واحد خلال تنسخي كاملة و / أو العمر الزمني.

Video: Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

عالية الدقة 3D تصوير السابقين فيفو العينات البيولوجية بواسطة CT مايكرو

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

إعداد ميكا المدعومة الدهون طبقات ثنائية لارتفاع القرار المجهر الضوئي التصوير

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

تحديد المواقع المناسبة وضبط النفس من أطرافهم هند الفئران لتصوير مركزة عالية الدقة للعظام باستخدام الهندسة المعمارية الدقيقة في فيفو المحسوبة الدقيقة التصوير المقطعي

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

التصوير عالية الدقة 3D الشبكة العصبية الجزر البنكرياس البشري

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning tool. EHD printing uses a fluidic supplier to maintain the extruded meniscus by pushing the ink out of the nozzle tip. The electric field is then used to pull the meniscus down to the substrate to produce high-resolution patterns. Two modes of EHD printing have been used for fine patterning: continuous near-field electrospinning (NFES) and dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing. According to the printing modes, the requirements for the printing equipment and ink viscosity will differ. Even though two different modes can be implemented with a single EHD printer, the realization methods significantly differ in terms of ink, fluidic system, and driving voltage. Consequently, without a proper understanding of the jetting requirements and limitations, it is difficult to obtain the desired results. The purpose of this paper is to present a guideline so that inexperienced researchers can reduce the trial and error efforts to use the EHD jet for their specific research and development purposes. To demonstrate the fine-patterning implementation, we use Ag nanoparticle ink for the conductive patterning in the protocol. In addition, we also present the generalized printing guidelines that can be used for other types of ink for various fine-patterning applications.

Here, we present a protocol to produce high-resolution conductive patterns using electrohydrodynamic (EHD) jet printing. The protocol includes two modes of EHD jet printing: the continuous near-field electrospinning (NFES) and the dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing.

عالي الاستبانة الزخرفة باستخدام وسائط اثنين من جت اليكتروهيدروديناميك: انخفاض في الطلب والقريبة من حقل اليكتروسبينينج

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

عالي الاستبانة "منقوشة استخدام الترسيب بيوفيلم" بدون-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

تصوير عالي الدقة لديناميكيات نوويه في الخلايا الحية تحت ضغط الشد المحوري

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...