我们想感谢劳拉写的第一个版本的细胞装入协议和马库斯Goffau的和吉尔Zampar的为得分王线粒体形态Schippers。

1。硅片模具的生产和制备微流控芯片的创建软光刻模具生产的硅片。这些晶片可多次重复使用，以生产微芯片。可取的做法是执行各自的晶片的生产由一组专门在微流控6。 的晶片是由在两个步骤的光刻工艺，使用两种不同的负光致抗蚀剂层，SU-8 7。底部层是用来产生细胞俘获区（SU-8，2002;高度3-4微米），而频道与顶层（SU-8 2010，高度为10μm）。 Huang 等人 8可以发现在晶片生产过程中的印象。微流控芯片的图纸可以从作者的意见如何获得相应的晶片。 <ol><li>一旦获得晶片，切一块艰难的标签诠释ö薄带约0.5毫米，3毫米，用解剖刀，并仔细地将它们放置在晶片上稍微的信道结构的顶部之间的入口通道和micropad的阵列（ 图2A）。这将导致在一个大的附加信道，这将不仅可以用于在细胞装载过程中在每个芯片的形成，但同样重要的是微流体装置的稳定运行。 </li><li>用双层铝箔覆盖玻璃培养皿中，并把晶片的陪替氏培养皿中。铝箔将防止PDMS之间的晶片和陪替氏培养皿中运行。如果PDMS蠕变之间在晶片和玻璃培养皿中，晶片将成为永久地固定在陪替氏培养皿中。虽然晶片仍然是可用的，它不会是可能的，用以代替玻璃培养皿中，如果它打破，将需要被切出之后的PDMS。 </li></ol> 2。微流控芯片的生产<ol><li>将一个空塑料杯放在天平上，天平去皮。倒入40 PDMS克基地到塑料杯（12厘米直径的玻璃培养皿）。 PDMS固化剂添加用一次性吸管AW / W比为1:10， 即约4毫升。 </li><li>彻底的PDMS与固化剂混合几分钟。用一次性塑料移液管，用移液管的固化剂，这是可以做到。重要的是，该混合物充分混合，倒入晶片上之前。可怜的混合会导致不聚合的PDMS的一部分。 </li><li>倒入的PDMS在玻璃培养皿中的晶片的顶部。 </li><li> PDMS与固化剂的混合会导致气泡的形成中的PDMS混合物。这些气泡的PDMS聚合之前，需要被删除。的PDMS可浇注后晶片上的陪替氏培养皿放置在干燥器中连接到真空泵脱气。有了这个设置，它大约需要30分钟，从混合物中除去所有的气泡。 </li><li>聚合个ë键PDMS的陪替氏培养皿放置于120℃的热板的顶部与晶片1小时，然后在65℃下，一个小时。 </li><li>一起在晶片和聚合PDMS从玻璃培养皿中取出铝箔。剥下的铝箔和从晶片背面的薄的残余层的聚合PDMS。的PDMS层的晶片上，然后，可以从晶片上分离，小心地向上提起。 </li><li>将PDMS层倒挂（渠道朝上）在板凳上切出的单芯片设计印PDMS上用手术刀小心。尝试保留约3毫米的硅橡胶的边缘周围的通道，以改善芯片附着到玻璃盖稍后。 </li><li>打孔的PDMS中在Luer式短截线20线规推的PDMS的所有的方式通过在一条直线的方式（ 图2A）的入口，出口和侧流路的端部。 </li></ol>确保PDMS芯片仍然躺在倒在板凳上，而打孔的孔。这可以防止硅橡胶粘的内部的通道，这可能会导致堵塞的通道。 <ol start="9"><li>每孔冲孔后，删除该列的PDMS在鲁尔存根镊子之前再次拉动存根。 PDMS列否则可能会留下，并阻止刚打孔。 </li><li>清洁表面的灰尘颗粒和剩余的PDMS的芯片，通过将透明胶带就可以了，并立即再次取出磁带。同样，该芯片将被清洗的玻璃盖。 </li><li>将下面的UV灯，台式UV-臭氧清洗机的清洗芯片和玻璃盖。需要被粘合在一起的两侧必须面对灯泡。 </li><li>暴露的PDMS和盖玻片6-8分钟的UV光，然后直接把芯片放置在玻璃盖的暴露表面，在彼此的顶部。 </li><li>轻轻敲击左右两侧的芯片到促进附着的PDMS的玻璃盖，以消除任何气泡。不要拍打渠道结构的顶部，因为这可能会导致micropads得到重视，以及玻璃盖。 </li><li>将新制成的微流体设置在100℃的热板上60分钟。测试的PDMS芯片的边缘稍微抬起，玻璃盖​​和PDMS芯片之间的粘接强度。当无法解除从玻璃表面的PDMS嵌段，接合是成功的，该芯片已准备好使用。 </li></ol> 3。准备细胞装载芯片微流体装置的故障有可能导致介质泄漏到显微镜。为了避免这种情况，它是咨询使用的金属支架和/或密封的芯片的侧面的PDMS符合玻璃用指甲油或环氧胶。这可以防止介质泄漏的PDMS芯片的情况下，未结合不够好，玻璃盖。此外，管件连接，可以确保周围的插入点以类似的方式，以避免介质的泄漏。自制的水传感器，关闭注射泵在泄漏的情况下，可以作为一个额外的安全预防措施。附图的金属保持器，特别是设计用于在微流体芯片上，可以得到从作者。 <ol><li>放置在金属保持器的微流体芯片，硅凝胶的芯片和玻璃之间的保持器来创建一个防水密封的金属部分。轻轻拧紧螺母，没有打破玻璃。 </li><li>连接细管（ 约 5-15厘米长）侧通道和出口通道的芯片。镊子的使用，可以更容易地插入管的冲孔。 </li><li>填写一个50毫升的注射器鲁尔乐培养基，去除空气中的注射器，并把它连接顺序注射器过滤器，20号鲁尔存根，短而粗的管（ 约 2厘米长）和细管。确保薄浴缸e是足够长，以跨越注射泵和显微镜载物台之间的距离。 </li><li>将注射器在注射器泵，快进的细管的泵，直到完全充满介质。 </li><li>推到该芯片的入口通道连接到注射器的细管，让介质的流量为10微升/分钟（ 图2B）通过芯片。收集留下的芯片介质（ 例如，在培养皿中）。介质运行因为强韧标签大侧通道和出口通道的阻力之间的差异，通过侧通道。 </li><li>芯片放置在显微镜载物台和设置在焊盘上的焦点显微镜。 </li></ol>使用油浸目标是首选，因为油比水浸泡目标不会干出在试验过程中的时间。 根据显微镜可能会对保持在f的问题OCUS在最初的实验时间。因此，最好离开芯片为一到两小时，在显微镜载物台上装载细胞，在实验开始之前，因此它可以安定下来。 4。酵母细胞加载到微流控芯片<ol><li>连接鲁尔尖端的5毫升注射器20号鲁尔存根和一个粗管（ 约 3厘米）。 </li><li>以被加载到芯片的细胞培养物的样品。 </li></ol>用于加载的首选细胞计数是1-5×10 6个细胞每毫升之间。细胞计数较高的文化与装货前需要稀释。 YPD液体培养基上的培养细胞时，细胞装载效率可以提高许多倍，如果第一洗涤细胞并重新悬浮在基本培养基中含有葡萄糖类似的百分比在加载之前。在操作过程中的芯片，YPD培养基中可以再次被安全地使用。 <ol start="3"><li>约1毫升的细胞悬浮液装入到第ê注射器和删除所有的空气从注射器。 </li><li>注射泵的流率减少到0.5微升/分钟。在加载过程中的注射泵（步骤4.5）中所执行的低和续流将推非贴壁细胞，通过侧流路（ 图2C）。 </li><li>将含有细胞悬浮液的注射器管的出口通道。装入注射器的柱塞上轻轻按细胞。观察细胞和稳定眼下面的micropads的通过，或通过在计算机屏幕。 </li><li>在柱塞上保持压力，直到有足够的细胞下方垫定居。最佳负载是1-3细胞每垫。随着细胞定居下方的垫片随机，它是相当常见的几个垫不包含任何细胞及其他垫完全充满细胞。 </li><li>用于细胞的加载和从薄管出口通道连接到它的厚管上取下注射器，冲洗通道的一侧annel在较高流速（10微升/分钟）为一，两分钟，以除去气泡和/或还没有退出芯片（ 图2B）的细胞。如果细胞不会被删除从侧面通道，他们可以开始增长，侧通道，并与实验后的干扰。 </li><li>将回落到0.5微升/分钟的注射器泵的流量，并通过将其连接到厚的管（ 约 5厘米长），在其端部含有一个导管插件（ 图2D），关闭侧通道。 </li><li>增加至终1-5微升/分钟的流速流动。流速可能取决于介质和酵母菌株。 </li><li>启动一个显微镜和相机设置适合为目标的实验电影。确保显微镜载物台的速度被设置为油可以按照这样的低的速度。对于复制寿命，图像细胞每10分钟测定。保护细胞免受微量的卤素所发出的UV光灯，DIC采集过程中使用的，最好是在光路中放置一个附加的紫外线过滤器。使用荧光显微镜观察时，它是优选的图像较少的细胞（ 例如每20分钟），以避免光毒效应。实验完成时，在实验开始时的所有加载的细胞是死的，在正常条件下是需要长达5天。建议您定期检查的重点在实验过程中的图像，并在必要时调整。 </li></ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

作者宣称，他们有没有竞争经济利益。

这里所描述的微流体方法是一个重要的新工具，在老龄化的研究，因为它使酵母复制寿命数据相结合的简单和自动化生成连续的高分辨率成像。这些属性是经典的夹层法在实验的可能性的重大改进，但需要加以考虑的方法，该方法也有一些局限性。 请注意，所确定的复制寿命可受保留母细胞：下micropad保存的每一个细胞的效率有一定概率被冲刷掉从芯片（ 例如相邻小?...

芽殖酵母是一种重要的模式生物衰老研究1。直到最近，研究在酵母细胞中复制老龄化是一个艰苦的过程，需要解剖的方法，其中每个芽母细胞2,3手动删除。为了解决这个问题，我们最近提出了一种新的微流体设置能够跟踪个人母细胞在其整个寿命4。 在我们的微流控芯片，酵母细胞被困在软弹性micropads（ 见图1）。的连续流动的介质冲走新形成的女儿细胞，并提供新鲜的养分的细胞。在一次实验中，高达70母细胞可以监测在一个完全自动化的方式在其整个的复制寿命。由于微流体芯片的优异的光学性能，它可以同时监测不同方面的酵母细胞生物学（ 例如 </em&gt;的使用荧光蛋白）。 古典夹层法相比，微流控的设置提供了巨大的优势。它确保了明确和稳定的环境下进行在整个老化实验。它不需要昂贵的专用设备，并可以运行在任何显微镜配备自动对焦和时间推移能力以及温度控制细胞培养。微流控芯片的生产和经营的，可以学到在几天之内。此外，细胞可以被直接加载从指数生长培养，另一个最近发表的微流控方法5，这需要母细胞的生物素化的优点在于比高分辨率成像，在这里描述的方法可以用来测量逐步改变一个结合在酵母细胞形态，蛋白质表达和定位以前所未有的方式老化。能力长期监测单细胞酵母细胞周期的研究也提供了独特的可能性。 最近一个这种方法已经被优化，去除生物素的协议，这是16时发布的这份手稿是在审查。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

我们展示了使用一个简单的微流控设置，单芽殖酵母细胞可以在其整个生命周期跟踪。利用微流控芯片使用数组micropads的母亲和女儿细胞之间的大小差异。在加载时，细胞下面这些micropads，被困的的micropad和盖玻璃之间的距离，因为类似的酵母细胞（3-4微米）的直径。的加载过程后，培养液中连续冲洗通过芯片，它不仅在整个实验中，创建一个常数和定义的环境，但也刷新新兴的子细胞，后者由于其更小的尺寸下面的焊盘不保留。设置如此有效地保留了母细胞，在一次实验中，最多50个单个单元格可以监测在一个完全自动化的方式，连续5天，或者，如有必要，更长。此外，该芯片的优异的光学性能允许高高分辨率成像在整个老化过程的细胞。

在这个协议中，细胞被装入微流控芯片，直接从指数中的文化。被困在微流控芯片的细胞的年龄分布，以确定是否是类似文化装货前，细胞染色小麦凝集素结合FITC（WGA-FITC）可视化芽痕。在图3中可以看出，细胞包封微流体芯片micropads下不偏细胞的目标年龄。 自我复制的寿命可以简单地确定计数芽是由一个单一的母细胞的数量。此数据被变换成的寿命曲线绘制的?...

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Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

在这里，我们描述了一个完整的复制和/或按时间顺序寿命期间的单芽殖酵母细胞允许连续和高分辨率的显微成像的微流体装置的操作。

在芽殖酵母连续高分辨率显微观察复制性衰老

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

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JoVE Journal

Bioengineering

12.8K 次观看.  University of Groningen. 在这里，我们描述了一个完整的复制和/或按时间顺序寿命期间的单芽殖酵母细胞允许连续和高分辨率的显微成像的微流体装置的操作。