وأيد هذا العمل من خلال منحة لعضو الكنيست وبانكوك من مؤسسة طبية إليسون. عضو الكنيست هو باحث طبي جديد اليسون مؤسسة في الشيخوخة. نود أن نشكر Soumya Kotireddy للحصول على المساعدة أثناء التصوير.

الجزء 1 : إعداد لوحات لسلالات والتحليل مدى الحياة تنسخي هذا المقطع يصف إعداد لوحات لYEPD صلبة لاستخدامها في فترة التجربة تنسخي الحياة وإعداد خلايا الخميرة لتحليل مدى الحياة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تقنية معقمة المناسبة ، وإعداد لوحات أجار YEPD (1 خلاصة الخميرة ٪ و 2 ٪ bacto - ببتون ، أغار 2 ٪ ، السكر بنسبة 2 ٪) التي سيتم استخدامها لزراعة خلايا الخميرة والتحليل مدى الحياة تنسخي. يجب عليك إعداد ما لا يقل عن 2 لوحات لكل سلالات 4-5 ليتم تحليلها في الحياة تجربة تمتد. وينبغي إعداد لوحات على الأقل 2 قبل أيام من حياة تمتد التجربة ، وسمح لتجف قبل البدء في فحص مدى الحياة. إذا لن تكون التجربة التي بدأت داخل 4-5 أيام من صب لوحات ، ينبغي وضعها في حاضنة مبردة وملفوفة في parafilm أو البلاستيك لمنع أصاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة سلالات الخميرة من المخزونات المجمدة ومتواصلة من أجل المستعمرات واحد على لوحات أجار YEPD. يمكن بسهولة حتى 6 سلالات أن يشوبه على لوحة للYEPD نفس التقسيم في لوحة على شكل دائري أسافين الحجم على حد سواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا على 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا من الخلايا الحاضنة والتصحيح من مستعمرة واحدة على صحن YEPD الطازجة. وينبغي أن يكون إنشاء اثنين من بقع اثنين من المستعمرات المختلفة لكل سلالة. في هذا الوقت ، ينبغي ترميز سلالات لتحليلها للتأكد من أداء عمر التجربة تنسخي &quot;العمياء&quot; ، حيث dissectors لا نعرف هوية من السلالات الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصححة لاحتضان ، وخلايا ترميز عند 30 درجة مئوية حتى مساء اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا والخلايا التصحيح طفيفة من كل سلالة ترميز لوحات YEPD العذبة ، والذي سيكون بمثابة لوحات تجريبية تستخدم لتحليل مدى تنسخي الحياة. وينبغي تصحيحها الخلايا على طول الخط العمودي على الجانب الأيسر من لوحة YEPD (الشكل 1). حوالي 3-5 تصحيحات في اللوحة هو الأمثل ، على افتراض تنسخي تحليل مدى الحياة في 20 من كل الخلايا التصحيح. ليس من الضروري (ولا مرغوب فيه) لنقل عدد كبير من الخلايا لوحة للYEPD جديدة ، لأن هذا سوف يسبب الخلايا لتنمو بشكل كثيف خلال الحضانة بين عشية وضحاها ، والتي قد تحد من حياتهم اللاحقة تنسخي تمتد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات مصححة حديثا بين عشية وضحاها على رأس مقاعد البدلاء. </li></ol> الجزء 2 : الخلايا المركز للحياة تنسخي التحليل مدى. في هذا القسم ونحن تصف كيفية وضع خلايا الخميرة على لوحة وكيفية الحصول على خلايا الابنة البكر للحياة تنسخي التحليل مدى. من هذه النقطة ، ينبغي parafilmed جميع لوحات ، إلا عندما تمر التشريح ، وذلك لمنع أصاب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر مزودة جهاز microdissection مناسبة للخميرة ، ونقل ما يقرب من 50 سلالة من الخلايا مصححة أولا إلى موقف وحشي على لوحة للخلايا مصححة. إذا كان لديك مجهر مرحلة متدرجة ، ويمكن استخدام هذه تدرجات لضمان الخلايا سوف يكون من السهل العثور خلال التكرار اللاحقة. على Axioscope زايس 40 ، يمكن وضع الخلايا من سلالة مصححة الأولى في إحداثيات 90 × 10 و المحتشدة عموديا من هناك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف إبرة من الخلايا عن طريق لمس سطح أغار مرارا ، ثم خلق ثقب في آغار من خلال اجبار الإبرة من خلال سطح آغار. وسوف تخدم هذه الحفرة كعلامة لتوجيه لكم على طبق من خلال التكرار اللاحقة تشريح وابنته إزالة الخلايا. يجب الحرص على عدم الحصول على خلايا الخميرة في الحفرة ، أو أنهم سوف تنمو وتشكل مستعمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة فوق الحفرة ، محاذاة عموديا خلايا الخميرة الفردية إلى 20 وظيفة موزعة بالتساوي ، بأقطار الإبرة 1-3 (~ 100 ميكرومتر) بين موقف كل خلية (الشكل 1). كل خلايا قليلة ، مكان خليتين المجاورة لبعضها البعض في نفس الموضع في السطر بدلا من واحدة. وهذا يسمح لابنته البكر التكرار خلال تحديد الخلية ، إذا كان واحد من الخلايا تفشل في نقل الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين ال 10 و ال 11 في مواقف الخط ، إنشاء سلسلة أفقية من 7-8 ثقوب في أجار. هذا سوف يكون بمثابة علامة على توجيه لكم على طبق من خلال التكرار اللاحقة تشريح وابنته إزالة الخلايا. يجب الحرص على عدم الحصول على خلايا الخميرة في الثقوب ، أو أنها سوف تنمو وتشكل مستعمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،1-2،4 لكل التصحيح على لوحة ، والاستمرار في مجموعة الخلايا عموديا على طول المحور نفسه. عن الخطوة 2.2 ، يجب أن يكون عدد الثقوب خلق تتوافق مع عدد التصحيح (فتحة واحدة لتصحيح الأولى ، فتحتين للمرة الثانية ، الخ.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد المحتشدة الخلايا لكل التصحيح ، parafilm لوحة واحتضان حتى 30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،1-2،6 عن كل لوحة في التجربة. </li></ol> الجزء 3 : الحصول على خلايا ابنته البكر لتحليل مدى الحياة في هذا القسم ونحن الشروع في التحليل مدى الحياة من خلال ضمان أن كل خلية يبدأ بوصفها ابنة البكرالخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من الحاضنة والتحقق من أن معظم الخلايا التي تم حشدها خضعت لعملية انقسام الخلايا. اذا كانت هناك حاجة لوقت إضافي يسمح ليستكمل انقسام الخلايا ، وعودة لوحة للحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع بداية الخلية المحتشدة الأولى ، استخدام إبر لفصل الخلايا الوليدة من الخلية الأم عن طريق وضع الإبرة بلطف على الجزء العلوي من الخلايا المرفقة. ومن المفيد في بعض الأحيان للاستفادة من جانب قاعدة المجهر بينما الإبرة يستريح على الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الخلية ابنة منفصلة في خط عمودي ، لتحل محل الخلايا الأم وابنتها أية خلايا إضافية ونقلها جانبا مؤقتا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 3.2 و 3.3 لكل من الخلايا التي تم حشدها. إذا فشل خلية لتقسيم وأخذ خلية من ابنة واحدة من خلايا زائدة المتمركزة في خطوة 2.3. عند الانتهاء ، يجب أن يكون الخلايا الوليدة 20 لكل التصحيح محاذاة عموديا على لوحة الحياة تمتد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل من الخلايا الأم وابنتها خارج الخلايا في كومة وتحويلها مرة أخرى إلى منطقة قريبة من البقع (&quot;مقبرة&quot;). فمن المهم للحفاظ على الخلايا غير المرغوب فيها بعيدا عن الخلايا التي تمر التحليل مدى الحياة لمنع تشكيل microcolonies ونضوب المواد المغذية المحلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm لوحة واحتضان حتى 30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،2-3،6 عن كل لوحة في التجربة. </li></ol> الجزء 4 : قياس قدرة تنسخي الخلايا الفردية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كشوف بيانات تمتد الحياة. ويمكن لصحيفة الحياة أن تكون بيانات تمتد شبكة بسيطة حيث كل صف يناظر الخلية الأم الفردية ويتوافق مع كل عمود إلى نقطة في سن (الشكل 2). تسمية كل ورقة البيانات وفقا لعدد من السلالات التي سيتم تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من الحاضنة والتحقق من أن معظم الخلايا التي تم حشدها قد خضعت واحدة على الأقل انقسام الخلايا. اذا كانت هناك حاجة لوقت إضافي يسمح ليستكمل انقسام الخلايا ، وعودة لوحة للحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع بداية الخلية الأولى في المحتشدة لوحة الأولى ، نلاحظ بصريا الخلية الأم وابنتها (ق) وتحديد عدد من الانقسامات الخلوية التي وقعت. فمن السهل عادة لتحديد عدد الخلايا ابنة الأم المنتجة ، واستنادا إلى أنماط مميزة للترتيبات الخلية. تسجيل عدد من الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلايا الأم في الخانة المناسبة على النتيجة ورقة تمتد الحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإبرة لفصل الخلايا الوليدة من الخلية الأم كما هو موضح في الخطوة 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبقاء على الخلايا الأم في موقفها في خط عمودي ونقل خلية ابنة (ق) إلى مؤقتا جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،3-4،5 في كل من الخلايا التي تم حشدها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل من الخلايا الوليدة تجاهل ونقلها إلى &quot;مقبرة&quot; ، وتقع بالقرب من بقع الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm لوحة واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،3-4،8 عن كل لوحة في التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات حتى 4،2-4،9 كافة الخلايا الأم قد توقفت الانقسام. كما يجب على الأم خلايا السن ، وتقدم دورة الخلية تصبح أبطأ ، وسيكون من المرغوب فيه لاحتضان لوحة لفترات أطول من الوقت بين نقاط العمر. ويمكن وضع لوحات عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol> الجزء 5 : نتائج الممثل. البيانات الخام التي تنتجها فترة التجربة تنسخي الحياة عبارة عن أرقام قائمة المناظرة إلى الخلايا الوليدة التي تنتجها كل خلية الأم في كل نقطة في سن (الشكل 2). عن طريق جمع كل صف من لائحة الهدافين ، يتم الحصول على عمر تنسخي لكل خلية الأم. ويمكن تجميع البيانات عن الخلايا الأم من نفس المجموعة التجريبية لتوليد منحنى البقاء على قيد الحياة (الشكل 3A) وإجراء الحسابات الإحصائية ، مثل عمر يعني ، متوسط ​​العمر ، والانحراف المعياري. يمكن إجراء اختبار غير المعلمية مثل اختبار الرتبة مجموع Wilcoxon ، لتحديد ما إذا كان تم الكشف عن اختلافات كبيرة في طول العمر بين المجموعات التجريبية. عند التجربة يعمل بشكل صحيح ، يجب أن تكون متسقة منحنى بقاء تقريبا مع إن السفارة - Makeham حركية تظهر حالات العسر الشديد السيني مع انخفاض الوفيات المبكرة اتبعت الانخفاض السريع نسبيا في البقاء على قيد الحياة والخروج من تسطيح منحنى الأعمار في وقت لاحق. معظم السلالات البرية من نوع لديها قيم تنسخي مدى الحياة في مجموعة الجيل 20-30 ، على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن الاختلاف من خارج هذا النطاق. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="الشكل 1.5" /> الشكل 1. رسم تخطيطي لوحة تنسخي نموذجية تمتد مدى الحياة. في المساء قبل بداية microdissection من خلايا الخميرة ، ومصححة طفيفة 3-5 سلالات على سطح لوحة YEPD (مربعات حمراء) في خط عمودي على طول جانب واحد من لوحة. في أعقاب نمو بين عشية وضحاها ، وحوالي 30 المحتشدة الخلايا الفردية من كل سلالة عموديا في خط يحتوي على 20 وظيفة. الحياة تمتد analysiسوف يتم تنفيذها على خلايا ت ق ابنته البكر التي تم الحصول عليها من هذه الخلايا الأولية. وتوضع الخلايا الإضافية التي تم الحصول عليها من خلال التجربة microdissection (مثل الخلايا غير المرغوب فيها ابنته) في &quot;مقابر&quot; (بيضاوية اللون الرمادي) ، والذي يقع بعيدا عن الخلايا التجريبية من أجل تجنب نضوب المحلية من المواد الغذائية حيث يتم تشكيل المستعمرات. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. ويرد عمر تنسخي ورقة الفرز. بيانات أولية من فترة التجربة تنسخي الحياة. كل صف يناظر خلية الخميرة الأم واحدة ويقابل كل عمود إلى نقطة العمر. عدد دخلت في كل مربع هو عدد الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلايا الأم في تلك المرحلة العمرية. يسمى كل سلالة مع عدد مشفرة مثل أن الفرد تشريح خلايا الخميرة لا يوجد لديه معرفة هوية من السلالات التي يجري تحليلها. ويعاير العشرين الخلايا لكل سلالة. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. بقاء ممثل ومنحنيات النمو من فترة التجربة تنسخي الحياة (A) ويتم الحصول على منحنيات البقاء على قيد الحياة من قبل المتهم بالتآمر في جزء من الخلايا الأم لا تزال على قيد الحياة بوصفها وظيفة من العمر تنسخي (عدد انقسامات الخلية (ب) منحنيات النمو هي التي حصل عليها المتهم بالتآمر في متوسط ​​عدد الخلايا التي تنتجها ابنة سلالة معينة بوصفها وظيفة من نقطة العمر. وفي هذا المثال ، سلالة # 2 هو الأطول عمرا ولكن أبطأ نموا ، كما يتضح من انخفاض المنحدر الأولي للمؤامرة النمو.

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+yeast+aging.">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109-120 (2006).</li><li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species.">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li><li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast.">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast.">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li><li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes.">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li><li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients.">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0145-17-0 (214530)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto-Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0118-17-0 (211677)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0886-17-0 (288620)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring replicative life span in the budding yeast

الشيخوخة هي عملية التنكسية يتميز التدهور التدريجي لمكونات العضيات الخلوية ويؤدي إلى الوفاة. الخميرة في مهدها<em&gt; السكيراء الجعوية</em&gt; قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الشيخوخة ، وثبت العديد من المحددات طول العمر لتكون الخميرة المحفوظة في حقيقيات النوى متعددة الخلايا ، بما فيها الديدان والذباب والفئران<sup&gt; 1</sup&gt;. وقد يعاير بسبب عدم وجود الظواهر المرتبطة بالسن كميا بسهولة ، والشيخوخة في الخميرة على وجه الحصر تقريبا من خلال قياس العمر الافتراضي للخلايا في سياقات مختلفة ، مع اثنين من نماذج مختلفة تمتد الحياة في الاستعمال الشائع<sup&gt; 2</sup&gt;. عمر زمني يشير إلى طول الفترة الزمنية التي خلية الأم يمكن أن يعيش في حالة عدم تقسيم هدوء يشبه ، ويقترح أن تكون بمثابة نموذج للشيخوخة بعد الإنقسامية الخلايا في حقيقيات النوى متعددة الخلايا. تنسخي مدى الحياة ، في المقابل ، يشير عدد من الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلايا الأم قبل الشيخوخة ، ويعتقد أن تقدم نموذجا للتقدم في السن في الخلايا النشطة mitotically. هنا نقدم بروتوكول معمم لقياس مدى الحياة تنسخي من الناشئين خلايا الخميرة الأم. هدف تمتد مقايسة تنسخي الحياة لتحديد عدد مرات كل براعم الخلية الأم. يمكن أن تكون الخلايا الأم وابنتها متباينة بسهولة من قبل ذوي الخبرة الباحث باستخدام مجهر الضوء القياسية (التكبير مجموع 160X) ، مثل Axioscope زايس 40 أو نموذج آخر للمقارنة. ويتحقق الفصل المادي بين الخلايا من خلايا والدة ابنته باستخدام micromanipulator دليل مجهزة إبرة الألياف البصرية. مختبر نموذجي سلالات إنتاج خلايا الخميرة ابنة 20-30 في تجربة واحدة من الأم وعمر يتطلب 2-3 أسابيع.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast at JoVE.com

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

في هذا المقال نقدم بروتوكول عام لقياس مدى الحياة تنسخي من الخلايا الأم الخميرة.

قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

measuring-replicative-life-span-in-the-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

20.5K Views.  University of Washington. في هذا المقال نقدم بروتوكول عام لقياس مدى الحياة تنسخي من الخلايا الأم الخميرة.

Video: Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

قياس انواع معينة ايليجانس سبان الحياة على وسائل الاعلام الصلبة

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

قياس سبان الخميرة الحياة الزمني بواسطة خلايا ثمرة المسنين

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

تنقية م. magneticum سلالة AMB - 1 بروتين المرتبطين Magnetosome MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

قياس حركية النسخ مرنا في الخلايا الحية واحدة

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

الحصول على الإسفار الوقت الفاصل بين الأفلام من الخميرة في مهدها وتحليل ديناميات وحيدة الخلية باستخدام الطعوم

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.