ברצוננו להודות לSchippers לורה לכתיבה את גירסאות הראשונות של תא טעינת הפרוטוקול ומרקוס דה Goffau וגיי Zampar עבור מניה המורפולוגיות המיטוכונדריה.

1. ייצור והכנה של עובש פרוסות סיליקון שבבי microfluidic נוצרים מתבנית פרוסות סיליקון המיוצרת על ידי יתוגרפיה הרכה. ניתן לעשות שימוש חוזר ופלים אלה פעמים רבות כדי לייצר שבבי microfluidic. מומלץ כי ייצור של פרוסות סיליקון בהתאמה מבוצע על ידי קבוצה מתמחה ב6 מיקרופלואידיקה. רקיק הוא עשה בתהליך photolithography שני שלבי שימוש בשתי שכבות שונות של photoresist השלילי, SU-8 7. השכבה התחתונה משמשת ליצירת אזור השמנת התא (SU-8 2002; מיקרומטר 3-4 גובה), ואילו הערוצים נעשים עם השכבה העליונה (SU-8 2010; גובה 10 מיקרומטר). ניתן למצוא רושם של תהליך ייצור פרוסות סיליקון בואנג ואח&#39; 8. ניתן לקבל מהמחברים, כמו גם ייעוץ הציורים של שבבי microfluidic כיצד להשיג רקיק, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמתקבלות פרוסות, לחתוך חתיכת int קשוח תג אחדרצועות דקות o של כ 0.5 מ&quot;מ על 3 מ&quot;מ עם אזמל ולמקם אותם בזהירות על פרוסות סיליקון במקצת על גבי מבנה הערוץ בין ערוצי הכניסה ומערך micropad (איור 2 א). זה יגרום להיווצרות של ערוץ נוסף גדול בכל שבב, אשר לא רק לשמש במהלך טעינת תא, אך חשוב גם לפעולה היציבה של מכשיר microfluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת פטרי הזכוכית עם שכבה כפולה של נייר אלומיניום והכניס את פרוסות בצלחת פטרי. רדיד האלומיניום ימנע מלפעול בPDMS בין רקיק וצלחת פטרי. אם PDMS עושה לזחול בין רקיק וצלחת פטרי הזכוכית, רקיק יהפוך באופן קבוע בצלחת פטרי. למרות שהרקיק הוא עדיין אפשרי, זה לא יהיה אפשרי להחליף את צלחת פטרי זכוכית אם זה שובר את PDMS ויהיה צורך לגזור לאחר מכן. </li></ol> 2. ייצור של שבבי microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פלסטיק ריקכוס על האיזון וטרת האיזון. יוצקים 40 גרם PDMS בסיס לכוס הפלסטיק (לצלחת זכוכית בקוטר 12 ס&quot;מ פטרי). הוסף סוכן ריפוי PDMS עם טפטפת פנויה ביחס AW / W של 1:10, כלומר כ 4 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את PDMS וסוכן ריפוי ביסודיות במשך מספר דקות. ניתן לעשות זאת עם פיפטה הפלסטיק חד פעמית ששימש לפיפטה סוכן הריפוי. חשוב שהתערובת מעורבבת היטב לפני ששופך אותו על גבי פרוסות סיליקון. עניי ערבוב יגרום לחלק מPDMS לא לפלמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את PDMS על גבי פרוסות סיליקון בצלחת פטרי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערבוב של PDMS עם סוכן הריפוי יוביל להיווצרות בועה בתערובת PDMS. בועות אלה צריכים להסיר לפני PDMS polymerizes. ניתן degassed PDMS לאחר מזיגתו על גבי פרוסות סיליקון ידי הצבת צלחת פטרי בייבוש מחובר למשאבת ואקום. עם ההגדרה הזאת, זה לוקח בערך 30 דקות כדי להסיר את כל הבועות מהתערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלמר ההדואר PDMS על ידי הצבת צלחת פטרי עם רקיק על גבי צלחת חמה ב 120 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולאחר מכן על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נייר האלומיניום יחד עם רקיק וpolymerized PDMS מצלחת פטרי הזכוכית. לקלף את נייר האלומיניום והשכבה דקה של שיורי polymerized PDMS מהחלק האחורי של פרוסות סיליקון. השכבה של PDMS על גבי פרוסות סיליקון אז יכולה להיות מופרדת מהרקיק על ידי הרמתו בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שכבת PDMS הפוך (עם הערוצים פונים כלפי מעלה) על הספסל ולחתוך את עיצובי שבב בודדים מוטבע על PDMS בזהירות עם אזמל. נסה לשמור על 3 מ&quot;מ של PDMS מסביב לקצוות של הערוצים כדי לשפר את הקובץ המצורף של השבב למכסה הזכוכית בהמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חורי אגרוף בPDMS בקצות ערוץ כניסה, יציאה וצד (איור 2 א) על ידי דחיפת בדל Luer 20 מד לאורך כל הדרך PDMS בצורה ישרה. </li></ol> ודא שבב PDMSהוא עדיין שוכב במהופך על הספסל בזמן ניקוב החורים. זה מונע PDMS מלהידבק לחלק הפנימי של הערוץ, אשר יכולים לגרום לחסימה של הערוץ. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חבטות כל חור, להסיר את העמודה של PDMS בבדל Luer עם פינצטה לפני שמשכתי את הבדל החוצה שוב. טור PDMS אחרת יכל להישאר מאחור ולחסום את החור רק אגרוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המשטחים של השבב מחלקיקי אבק וPDMS השיורי על ידי הנחת נייר דבק עליו והסרת הסרט מייד שוב. כמו כן לנקות את מכסה זכוכית שלשבב יהיה מחובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השבב ניקה ומכסה הזכוכית מתחת למנורת UV של מנקה-UV אוזון Benchtop. הצדדים שצריכים להיות קשורים יחד חייבים להתמודד עם המנורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את PDMS ולכסות את הכוס לאור UV במשך 6-8 דקות ולאחר מכן באופן ישיר את השבב על מכסה הזכוכית על ידי הצבת את המשטחים החשופים על גב אחד את השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות סביב הצדדים של השבבכדי לקדם את צירופה של PDMS למכסה הזכוכית וכדי להסיר כל בועות אוויר. אין להקיש על גבי מבנה ערוץ מכיוון שהדבר עלול לגרום לmicropads להיקשר למכסה הזכוכית גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התקנת microfluidic עשה זה עתה על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. בדוק את חוזקו של המליטה בין מכסה הזכוכית ושבב PDMS על ידי מנסה להרים את הקצוות של שבב PDMS מעט. כאשר בלוק PDMS לא ניתן להרים ממשטח הזכוכית, המליטה היא מוצלחת והשבב הוא מוכן לשימוש. </li></ol> 3. הכנת צ&#39;יפ לטעינה סלולרי כישלון של מכשיר microfluidic עלול לגרום לדליפה של מדיום למיקרוסקופ. כדי להימנע מכך, הוא מייעץ לשימוש מחזיק מתכת ו / או לאטום את הצדדים של השבב שבו פוגש את PDMS הזכוכית עם לק או דבק אפוקסי. זה מונע זליגה של מדיום במקרה שבב PDMS הוא לא ערובה מספיק טוב כדי לכסות את הכוס. גם צינורותיכולים להיות מאובטחים חיבורים סביב הנקודות הכניסה באופן דומה, כדי למנוע זליגה של מדיום. חיישן מים תוצרת בית שמכבה את משאבת המזרק במקרה של דליפה יכול לשמש כאמצעי בטיחות נוסף. ניתן להשיג ציורים של בעל המתכת תוכנן במיוחד עבור שבב microfluidic מהמחברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שבב microfluidic בבעל המתכת, עם ג&#39;ל סיליקון בין הזכוכית של השבב ואת חלקי המתכת של בעל ליצור חותם אטום למים. הברג את האגוזים בעדינות, לא לשבור את הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות דקים (ארוך 5-15 ס&quot;מ בקירוב) לצד הערוץ וערוץ היציאה של השבב. השימוש בפינצטה עושה את זה קל יותר להכניס את צינורות לחורים המנוקבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק 50 מ&quot;ל Luer-לוק עם התרבות בינונית, להסיר את האוויר מהמזרק ולחבר אותו ברצף למסנן מזרק, בדל Luer 20 מד, צינור עבה וקצר (באורך של 2 ס&quot;מ בקירוב) וצינור דק. ודא שאמבטיה דקהדואר הוא ארוך מספיק כדי להקיף את המרחק בין משאבת המזרק והבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרק במשאבת המזרק, להריץ קדימה את המשאבה עד שהצינור הדק מלאה לחלוטין עם מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את הצינור הדק המחובר למזרק לתוך ערוץ הכניסה של השבב ולאפשר את הזרימה בינונית באמצעות השבב ב10 μl / דקה (איור 2). לאסוף את המדיום משאיר את השבב (למשל בצלחת פטרי). בינונית ייגמר דרך ערוץ הצד בגלל הבדל ההתנגדות בין התג קשוח מתוצרת צד ערוץ גדול וערוץ לשקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השבב בבמת מיקרוסקופ ולהגדיר את המיקוד של המיקרוסקופ על הכריות. </li></ol> השימוש במטרות נפט טבילה עדיפה על זה של מטרות טבילה במים, כי שמן לא יתייבש במשך הזמן במהלך הניסוי. בהתאם למיקרוסקופ שאולי יש בעיות עם שמירה על Focus בשעות הראשונות של הניסוי. לכן מומלץ להשאיר את השבב לשעה עד שעות בבמת מיקרוסקופ ולכן הוא יכול להתיישב לפני טעינת תאים ותחילת הניסוי. 4. טעינה של תאי שמרים לתוך השבב microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קצה מזרק 5 מ&quot;ל לLuer בדל Luer 20 מד וצינור עבה (3 ס&quot;מ בקירוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את דוגמה של תרבית התאים להיות טעונים לתוך השבב. </li></ol> ספירת התאים המועדפת לטעינה היא בין 1-5 x 10 6 תאים לכל מ&quot;ל. תרבויות עם ספירת תאים גבוהה יותר צריכים להיות מדוללת לפני הטעינה. כאשר תאי culturing על YPD, יעילות העמסת תא יכול להיות שיפור רבים של פי אם תאים נשטפים ראשון עם וresuspended במדיום מינימאלי המכיל אחוז סוכר דומה לפני הטעינה. במהלך פעולה של השבב, שוב ניתן להשתמש בינונית YPD בבטחה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען כ 1 מ&quot;ל של ההשעיה התא לתוך המזרק הדואר ולהסיר את כל האוויר מהמזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקטין את קצב הזרימה של משאבת המזרק ל0.5 μl / דקה. הזרימה הנמוכה והמשך נאכפה על ידי משאבת המזרק במהלך טעינה (בשלב 4.5) ידחוף תאים שאינם מחוברים דרך החוצה את הערוץ בצד (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המזרק המכיל תרחיף התאים לצינור של הערוץ לשקע. לטעון את התאים על ידי לחיצה על הבוכנה של המזרק בעדינות. שימו לב לתאים הקרובים וביישוב מתחת לmicropads דרך עיני או דרך מסך מחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על לחץ על הבוכנה עד שמספיק תאים להתיישב מתחת לכריות. העומס האופטימלי הוא 1-3 תאים למשטח. ככל שתאים להתיישב מתחת לרפידות באופן אקראי, שזה די נפוץ שכמה כריות אינן מכילות תאים ורפידות אחרות מלאות לחלוטין עם תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את המזרק המשמש להעמסת תא והצינור העבה המחוברים אליו מהצינורות דקים של הערוץ לשקע, שטוף את פרק הצדannel במשך כמה דקות בקצב זרימה גבוהה יותר (10 μl / min) כדי להסיר בועות ו / או תאים שעדיין לא לצאת מהשבב (איור 2) באוויר. אם תאים לא יוסרו מן הצד הערוץ, הם יכולים להתחיל לגדל בצד הערוץ ומפריעים לניסוי בשלב מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הזרימה של משאבת המזרק בחזרה ל 0.5 μl / דקות ולסגור את הערוץ מהצד על ידי חיבורו לצינור עבה (עוד 5 ס&quot;מ בקירוב) המכיל תקע קטטר בסופה (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הזרימה לקצב זרימה סופית של 1-5 μl / דקה. ספיקות עשויות להשתנות בהתאם לבינוניות וזן שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל סרט עם המיקרוסקופ ומצלמה ההגדרות המתאימות למטרת הניסוי. ודא שהמהירות של הבמה מיקרוסקופ מוגדרת מהירות כה נמוכה שהשמן יכול לעקוב. לקביעת replicative תוחלת חיים, תאי תמונה בכל 10 דקות. כדי להגן על תאים מהכמויות הזעירות של אור האולטרה סגול הנפלט מההלוגןמנורה, המשמשת במהלך רכישת דסק&quot;ש, רצוי למקם את מסנן UV נוסף בנתיב האור. בעת שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי, הוא העדיף לתמונת התאים בתדירות נמוכה יותר (למשל, בכל 20 דקות), כדי למנוע תופעות phototoxic. הניסוי מסתיים כאשר כל התאים הטעונים בתחילת הניסוי מתים, אשר בתנאים רגילים לוקח עד 5 ימים. מומלץ לבדוק באופן קבוע את הפוקוס של התמונות במהלך הניסוי ובמידת צורך להתאים אותו. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth.">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast.">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures.">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cancer+stem+cell+migration+using+compartmentalizing+microfluidic+devices+and+live+cell+imaging.">Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+determining+yeast+replicative+life+span+in+a+long-lived+genetic+background.">Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).</li><li>Scheckhuber, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models.">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li><li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells.">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIR2/3/4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms.">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li><li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding.">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li><li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטת microfluidic המתוארת כאן היא כלי חשוב בתהליך הזדקנות רומן מחקר כפי שהיא מאפשרת יצירה פשוטה והאוטומטית של נתוני תוחלת החיים replicative שמרים בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה מתמשכת. תכונות אלה הן שיפורים משמעותיים על פני האפשרויות הניסיוניות של השיטה הקלסית לנתיחה, עדיין ?...

ניצני שמרים הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הזדקנות 1. עד לאחרונה לומד replicative הזדקנות בתאי שמרים היה תהליך מייגע הדורש נתיחת שיטה, שבה כל ניצן הוסר באופן ידני מהתא האם 2,3. כדי לפתור בעיה זו, אנו הצגנו לאחרונה התקנת microfluidic רומן מסוגלת לעקוב אחר תאי אמא בודדים לאורך כל תוחלת החיים שלהם 4. בשבב microfluidic שלנו, תאי שמרים לכודים תחת micropads מבוסס אלסטומר הרך (ראה איור 1). זרימה רציפה של מדיום שוטפת חדש שנוצרו תאי בת ומספקת את התאים עם חומרים מזינים טריים. בניסוי אחד, יכולים להיות במעקב עד 50 תאים האם באופן אוטומטי לחלוטין לאורך כל replicative תוחלת החיים שלהם. בשל תכונות האופטיות מעולות של שבב microfluidic, ניתן לפקח בו זמנית היבטים שונים של ביולוגיה של תא שמרים (למשל </em&gt; באמצעות חלבוני ניאון). בהשוואה לשיטה הקלסית לנתיחה, התקנת microfluidic מספקת יתרונות משמעותיים. זה מבטיח סביבה מוגדרת וקבועה במשך כל ניסוי ההזדקנות. זה לא דורש ציוד מיוחד ויקר ניתן להריץ על כל מיקרוסקופ מצויד בפוקוס אוטומטי ויכולות זמן לשגות כמו גם טמפרטורת בקרה לגידול תאים. הייצור והתפעול של שבבי microfluidic ניתן ללמוד תוך כמה ימים. בנוסף לכך, תאים ניתן לטעון ישירות מתרבות גדלה באופן אקספוננציאלי, יתרון על פני שיטה אחרת שפורסמה לאחרונה microfluidic 5, אשר דורשת biotinylation של תאים האם. בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, בשיטה שתוארה כאן יכולה לשמש למדידת שינויים הדרגתיים במורפולוגיה תאית, ביטוי חלבון ולוקליזציה בשמרי ההזדקנות באופן חסר תקדים. היכולת לניטור ארוך טווח של תאים בודדים גם מספק אפשרויות ייחודיות ללימודי מחזור תא שמרים. שיטה זו מזמן כבר מותאמת להסיר biotinylation מ16 הפרוטוקול, שפורסם בעת כתב היד הזה היה בביקורת.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

אנו מדגימים את השימוש בהתקנת microfluidic פשוט, שבו ניתן לעקוב אחר תאי שמרי ניצנים בודדים לאורך כל תוחלת החיים שלהם. שבב microfluidic מנצל את ההבדל בגודל בין תאים אם ובתה באמצעות מערך של micropads. לאחר הטעינה, תאים לכודים מתחת micropads אלה, משום שהמרחק בין micropad ומכסה הזכוכית דומה לקוטר של תא שמרים (מיקרומטר 3-4). לאחר הליך הטעינה, תרבות בינונית הוא הסמיק ברציפות באמצעות השבב, שיוצר סביבה קבועה ומוגדרת לא רק לאורך כל הניסוי, אלא גם את החום מתפתחים התאים בת, שאינם נשמרים מתחת לרפידות עקב הגודל הקטן שלהם. ההתקנה שומרת תאי אמא כל כך יעילה, כי בניסוי אחד יכולים להיות במעקב עד 50 תאים בודדים באופן אוטומטי לחלוטין למשך 5 ימים או, במידת צורך, זמן רב יותר. בנוסף, את התכונות האופטיות מעולות של השבב תאפשר גבוהותרזולוציה הדמיה של תאים במהלך תהליך ההזדקנות כולו.

בפרוטוקול זה, תאים נטענים לתוך שבב microfluidic ישירות מתרבות אמצע מעריכי. על מנת לבדוק אם התפלגות הגילים של תאים הלכודים בשבב microfluidic היא דומה לזה של התרבות לפני הטעינה, תאים היו מוכתמים agglutinin החיטה מצומדת לFITC (WGA-FITC) כדי להמחיש צלקות ניצן. כפי שניתן לראות באיור 3, המ...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast at JoVE.com

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

אנו מתארים כאן את הפעולה של מכשיר microfluidic המאפשר הדמיה מיקרוסקופית רציפה ורזולוציה גבוהה של תאי שמרי ניצנים בודדים במהלך replicative המלא ו / או תוחלת החיים כרונולוגית.

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K Views.  University of Groningen. אנו מתארים כאן את הפעולה של מכשיר microfluidic המאפשר הדמיה מיקרוסקופית רציפה ורזולוציה גבוהה של תאי שמרי ניצנים בודדים במהלך replicative המלא ו / או תוחלת החיים כרונולוגית.

Video: Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

מיקום מתאים ואיפוק של איבר הינד עכברוש עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה ממוקד של עצם באמצעות מיקרו-ארכיטקטורה In Vivo שחושב מיקרו טומוגרפיה

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של הרשת נוירו-סקסיסטית לבלב אנושי

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning tool. EHD printing uses a fluidic supplier to maintain the extruded meniscus by pushing the ink out of the nozzle tip. The electric field is then used to pull the meniscus down to the substrate to produce high-resolution patterns. Two modes of EHD printing have been used for fine patterning: continuous near-field electrospinning (NFES) and dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing. According to the printing modes, the requirements for the printing equipment and ink viscosity will differ. Even though two different modes can be implemented with a single EHD printer, the realization methods significantly differ in terms of ink, fluidic system, and driving voltage. Consequently, without a proper understanding of the jetting requirements and limitations, it is difficult to obtain the desired results. The purpose of this paper is to present a guideline so that inexperienced researchers can reduce the trial and error efforts to use the EHD jet for their specific research and development purposes. To demonstrate the fine-patterning implementation, we use Ag nanoparticle ink for the conductive patterning in the protocol. In addition, we also present the generalized printing guidelines that can be used for other types of ink for various fine-patterning applications.

Here, we present a protocol to produce high-resolution conductive patterns using electrohydrodynamic (EHD) jet printing. The protocol includes two modes of EHD jet printing: the continuous near-field electrospinning (NFES) and the dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing.

ברזולוציה גבוהה תכנים באמצעות שני מצבים של Electrohydrodynamic סילון: ירידה על הביקוש, שדה-Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

ברזולוציה גבוהה בדוגמת באמצעות התצהיר Biofilm pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

ברזולוציה גבוהה הדמיה של דינמיקה גרעינית בתאים חיים תחת מתיחה Uniaxial המתח

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...