وقد تم دعم هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG) BL567/3-1 وفريدريش باور شتيفتونغ. ونود أن نشكر روجر تسين Y.، معهد هوارد هيوز الطبي المختبرات في جامعة كاليفورنيا، سان دييغو لتزويدنا تاج RFP-T2. ونحن نعترف لله الحمد ديفيد بالتيمور، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا في باسادينا، وديدييه Trono، جامعة جنيف، جنيف، لتقديم لنا lentiviral البلازميدات FUGW، وpsPAX2/pMD2.G.

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signaling+in+neurons.">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li><li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release.">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li><li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+ER+calcium+dynamics.">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li><li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons.">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li><li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function.">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li><li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Ca2++from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1,4,5-trisphosphate.">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li><li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off-regulation+of+phospholipase+C-gamma+1-mediated+signal+transduction.">On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction.</a> Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channels+as+cellular+sensors.">TRP channels as cellular sensors.</a> Nature. 426, 517-524 (2003).</li><li>Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIMulating+store-operated+Ca(2+)+entry.">STIMulating store-operated Ca(2+) entry.</a> Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).</li><li>Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+cellular+stress+through+STIM+proteins.">Sensing cellular stress through STIM proteins.</a> Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).</li><li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li><li>Sch&#228;uble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca(2+)+leakage+from+the+ER.">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li><li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events.">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li><li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane.">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li><li>Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+endoplasmic+reticulum+controls+metabotropic+signaling+and+plasticity+at+hippocampal+synapses.">Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).</li><li>Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+network+of+endoplasmic+reticulum+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).</li><li>Lang, S., Sch&#228;uble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca(2)(+)+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms.">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).</li><li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+forward+to+seeing+calcium.">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).</li><li>Mank, M., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators.">Genetically encoded calcium indicators.</a> Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+changes+in+free+Ca2++concentration+in+the+endoplasmic+reticulum+of+intact+cells.">Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells.</a> The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).</li><li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications.">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li><li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2++oscillations.">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1,4,5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2.">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li><li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum:+an+overview+of+modern+approaches.">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li><li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons:+direct+visualization+of+Ca(2+)-induced+Ca(2+)+release+triggered+by+physiological+Ca(2+)+entry.">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li><li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum.">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li><li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, (2010).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5, 545-551 (2008).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery.">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li><li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes.">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li><li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium measurement methods. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), 147-167 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity.">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li><li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading.">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , (2012).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

وقد نوقشت مزايا وعيوب الأسلوب TED على نطاق واسع في المنشورات الحديثة 34،35. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المذكورة أعلاه، TED تلتف مشكلة تعطيل وperfusing الخلايا. وعلاوة على ذلك، لا بد من التأكيد على جانبين. مبدأ TED لER الكالسيوم التصوير يتطلب (1). التعبير المستهدفة من إستيراز ...

من أجل حل الاستجابات الفسيولوجية الكالسيوم من ER، قمنا بتطوير استراتيجية جديدة لتحسين محاصرة من الكالسيوم الاصطناعية الأصباغ الحساسة في ER. تمكن الطريقة المباشرة وغير مدمرة في الوقت الحقيقي رصد الحر ER الكالسيوم في وجود الكالسيوم خارج الخلية. وظيفة وإشارات من الكالسيوم ER تم العثور على إشارات الكالسيوم في الخلية أنواع مختلفة، مثل خلايا العضلات، الخلايا العصبية والخلايا الدبقية وتتراوح الوظائف من التوسط تقلص العضلات لتورطه في انتقال متشابك في التعلم والذاكرة 1،2. التغييرات في تركيز الكالسيوم الحرة هي ذات أهمية علمية عالية لأن الكالسيوم ويشارك في تنظيم النسخ الجيني، تكاثر الخلايا، استثارة الخلايا العصبية، موت الخلايا والخلايا الأخرى مما يشير الأحداث 1-7. وترتبط وظيفيا كل هذه الإشارات الخلوية الكالسيوم داخل الخلايا وتساهم في الكالسيوممخزن 8-10 ديناميكية. ثمة سمة مشتركة بين جميع إشارات الكالسيوم هو تدفق الكالسيوم بين الفضاء خارج الخلية، العصارة الخلوية والعضيات، وعلى رأسها ER والميتوكوندريا. هذا يسبب تغيرات ديناميكية في تركيز الكالسيوم داخل هذه العضيات، والتي لمست من قبل مكونات إشارات مختلفة. في العام، وتركيز الكالسيوم في نطاقات ER بين 100-800 ميكرون، في العصارة الخلوية تركيز الكالسيوم على مقربة من 100 نانومتر، وفي الفضاء خارج الخلية تركيز حوالي 1-2 ملم. وفقا لذلك، هناك قوة دافعة عالية الكيميائية لتدفق الكالسيوم نحو العصارة الخلوية 2،9،10. تعتمد إشارات الكالسيوم ER-استمدت معظم التحقيق عادة على تحفيز مستقبلات البروتين G-يقترن (GPCR)، التي تنشط ثم فسفوليباز C (PLC). PLC بدورها تنتج اينوزيتول 1،4،5-trisphosphate (IP 3) 1. عند ربط الملكية الفكرية 3 إلى تفصيل لهاeptor (IP-3 التوصية، الشكل 1) في ER-الغشاء، يتم الافراج أيونات الكالسيوم من لمعة ER. تاريخيا، كان IP إطلاق الكالسيوم 3 بوساطة من لائحة الأول - حتى ولو بشكل غير مباشر - في قياس خلايا البنكرياس عنيبية بواسطة Streb وآخرون في عام 1983 11. واقترح هذا المنشور لأول مرة شلال إشارات تنطوي على أستيل، فسفوليباز C، وIP 3. هذه الطريقة في إطلاق الكالسيوم ويطلق عموما IP إطلاق الكالسيوم 3 التي يسببها (IiCR) (الشكل 1). التنشيط التي تعتمد على كيناز من فسفوليباز Cγ بواسطة مستقبلات tyrosin تحركات روابط العمل من عوامل النمو وعوامل عصبية إلى ER الكالسيوم مما يشير IP بعد 3 الارتفاع 12. بالإضافة إلى IiCR، قد يتم بوساطة ارتفاع الكالسيوم عن طريق دخول الكالسيوم ionotropic، على سبيل المثال عبر قنوات الكالسيوم الجهد بوابات (كا V)، وإطلاق الكالسيوم الكالسيوم التي يسببها اللاحقة (CICR) من خلال إعادة ryanodineمستقبلات (RYR). وترتبط IiCR وCICR الناحية الفسيولوجية لدخول الكالسيوم المخزن التي تديرها (SOCE). يتضمن SOCE عمل STIM (ستروما جزيء التفاعل)، وهو جهاز استشعار لإطلاق الكالسيوم ER. وقد تبين STIM لتحفيز دخول الكالسيوم خارج الخلية من خلال قنوات عابر مستقبلات المحتملة (التربتوفان) 13، وقنوات الكالسيوم Orai 14 وحتى قنوات الكالسيوم الجهد بوابات 15 (الشكل 1). فقدان ER الكالسيوم هو انقاذ حيوي بواسطة العمل من الكالسيوم شبكية هيولي باطني أتباز-ساركو (SERCA)، الذي بنشاط مضخات الكالسيوم مرة أخرى في ER. منع SERCA مع عقاقير مثل thapsigargin، يكشف عن استمرار فقدان الكالسيوم ER إلى المقصورة عصاري خلوي. ويتسبب هذا ER الكالسيوم &quot;تسرب&quot; بواسطة ER intramembrane المجمعات المسام مثل بروتين معقد Sec61 16،17 (الشكل 1). في عام 1998، نشرت Berridge نموذجا، و &quot;الخلايا العصبية ضمن نموذج الخلايا العصبية&quot;، حركتيح يشير إلى وجود دور الفسيولوجية مبدأ ER في دمج الخلايا العصبية الكالسيوم 5. ويرى هذا النموذج وجود نظام مستمر غشاء ER تشكيل الخلايا &quot;صورة&quot; من ​​غشاء البلازما الخلايا العصبية 5. وقد ادعى هذا النظام غشاء حقيقية النواة الثنائية لتكون شرط أساسي لتحقيق التكامل الزمانية والمكانية للإشارات الكالسيوم السريعة والبطيئة في الخلايا العصبية. وتمنح إشارات الكالسيوم التي تحدث إما بالتزامن أو في وقت لاحق في العمود الفقري التشعبات المختلفة أو من نفس العصبون إلى سوما الخلية أو النواة عبر ER، حيث تتلخص أنها تصل 5،18. ثم، قد يكون لها آثار مجموعهما على استثارة الخلايا العصبية، وتنظيم النسخ الجيني أو التكامل من أجهزة الطرد المركزي الإشارة. وهكذا، فإن ER يدعم دمج إشارات الكالسيوم. واحد شرط مسبق لهذا المفهوم هو استمرارية ER في خلية واحدة، والتي تم الادعاء من قبل العديد من الدراسات والتي ثبت على الأقل لsomato-Dالمناطق endritic ومسافة قصيرة التوقعات محور عصبي 19-21. ما إذا كان هناك استمرارية ER ضمن التوقعات محور عصبي طويل هو موضوع نقاش. استراتيجيات لقياس تدفق الكالسيوم مجانا عبر غشاء ER في معظم الأحيان يتم رصد إشارات الكالسيوم في العصارة الخلوية 22،23. وبالتالي، فإنه لا يمكن بسهولة أن تميز سواء كا 2 + والتي تصب في العصارة الخلوية من خارج الخلية أو من مخازن داخل الخلايا 6،24. للتغلب على هذا القيد، وقد وضعت استراتيجيات منهجية لمباشرة التصوير الكالسيوم ER. في ملخص، يتم استخدام الاستراتيجيات التالية: (1) ER-استهدفت المهندسة وراثيا، مؤشرات بروتين 25-27 كا 2 + المؤشرات المنخفضة تقارب البروتين على أساس استخدام البروتين GFP إضاءة الحيوية aequorin أو في توليفة مع البروتين الاستشعار الكالسيوم. هذا كا 2 + المؤشرات المعدلة وراثيا (GECIs) ويمكنأن تستهدف لائحة مع مساعدة من الببتيد إشارة ويتم الاحتفاظ بنشاط في ER باستخدام الاستبقاء وعزر استرجاعها. مشترك ER كا 2 + مؤشرات على قاعدة مبدأ كمليون وهي كمليون YC4.3 26،28؛ كمليون الانقسام YC7.3ER 29، وD1 كمليون 30. (2) تحميل مباشر صبغ المستندة إلى استريز من AM-استر منخفضة تقارب كا 2 + المؤشرات 31،32. AM-مشتقات الأصباغ مؤشر (ماج-Fura2-AM، MAG-Fluo4-AM أو Fluo5N-AM) تمرير الأغشية البيولوجية في محبة للدهون، دولة الكالسيوم الأحرف. ثم، في العصارة الخلوية وكذلك في لائحة، الاسترات الذاتية يلتصق الفريق AM-استر والإفراج عن كا 2 + المؤشر، مخلفين وراءهم كمية معينة من صبغة نشطة في العصارة الخلوية وفي ER. ولذلك، فإن هذا النهج هو مفيد في ظل ظروف من تركيز عالية من الكالسيوم في ER طالما يبقى تركيز الكالسيوم عصاري خلوي أقل بكثير من ديالحد بحماية المناخ من المؤشرات المنخفضة تقارب، ولا سيما خلال إشارات الكالسيوم مميزة (مثل نانومتر إلى ميكرومتر منخفض). (3) تحميل AM-استر في تركيبة مع غشاء البلازما permeabilization 32. تتم إزالة أي المتبقية عصاري خلوي كا 2 + المؤشر بواسطة غشاء البلازما permeabilization مع كميات صغيرة من المنظفات &quot;خفيفة&quot; (على سبيل المثال سابونين) في وجود مخزن مؤقت داخل الخلايا الاصطناعية. وبالتالي، قد يكون حافزا للأغشية الخلايا، على سبيل المثال مع IP 3 في المخزن المؤقت داخل الخلايا، مباشرة من خلال &quot;مسام&quot; في غشاء البلازما. (4) غسيل الكلى من العصارة الخلوية ضمن تكوين خلية كاملة والقياسات في وقت واحد من كا 2 + في التجويف ER والعصارة الخلوية 32،33. يتم تحميل الخلية الأولى مع انخفاض تقارب كا 2 + مؤشر (على سبيل المثال ماج-Fura2- AM، ratiometric، ضوء الأشعة فوق البنفسجية). بعد ذلك، مع مساعدة من ماصة التصحيح، أي CYT المتبقيةوdialysed osolic منخفضة تقارب كا 2 + مؤشر للخروج من العصارة الخلوية مع العازلة التي تحتوي على نسبة عالية تقارب كا 2 + مؤشر (على سبيل المثال فلوو-3، الضوء المرئي). تمكن هذه الاستراتيجية في وقت واحد تسجيل الاشارات عصاري خلوي وER مشتقة. (5) التي تستهدف استريز التي يسببها صبغ التحميل 8،34. A إستيراز الكربوكسيل (CES) والتي تستهدف تجويف ER ويوفر النشاط استريز السامية لمحاصرة كفاءة من النموذج AM-استر من كا 2 + مؤشرات الاسعار المنخفضة للتقارب. التي يسببها استهدفت-استريز صبغ التحميل (TED) لتحسين استهداف كا 2 + المؤشرات المنخفضة تقارب إلى ER التجويف، وقد وضعت TED. يتطلب TED على overexpression من وER إستيراز الكربوكسيل الماوس المستهدفة (CES2) (الشكل 2)، والذي يتحقق من خلال بنيات التعبير. يتم تحضين الخلايا معربا عن المؤتلف CES-بناء مع شكل AM-استر من الكالسيوم فيdicator صبغ (Fluo5N-AM، الشكل 2). ثم، في لائحة، يتم تحويل الصبغة إلى كا 2 + حساسة، غشاء كتيمة كا 2 + مجمع مؤشر (Fluo5N/Ca 2 +) من قبل النشاط استريز عالية، وبالتالي محاصرة الصبغة في تركيز عال في التجويف ER 8 ، 34. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للتحقيق ER الكالسيوم الإفراج عبر مسارات-IiCR على سبيل المثال عن طريق metabotropic purinergic أو الغلوتامات المستقبلات، 8،34 وتصور استنزاف الكالسيوم ER عبر &quot;قنوات تسرب&quot; مباشرة، على سبيل المثال بعد الحصار المفروض على SERCA 17 ، 34. لتجربتنا انخفاض تقارب كا 2 + مؤشر Fluo5N-AM حاليا أفضل مؤشر متاحة للاستخدام مع استراتيجية جار صبغ TED. Fluo5N-AM يحتوي على نسبة منخفضة تقارب لكا 2 + (التفكك المستمر K D ~ 90 ميكرون، الشكل 2)، هي تقريبا غير الفلورسنت في تقريرها AM-شكل، ولكنها توفر الانبعاثات مضان عالية على calciuم ملزمة 8،34. يمكن متحمس Fluo5N/Ca 2 + معقدة مع مصدر ضوء معيار من ~ 490 نانومتر، والتي تتطابق مع الأصباغ القياسية مثل FITC، اليكسا 488، أو EGFP. إشارات الكالسيوم عصاري خلوي نكاد نبلغ تركيز في نطاق ميكرومتر منخفضة، وبالتالي يتم الكشف عنها من قبل بالكاد Fluo5N في العصارة الخلوية 35. لتحسين أداء TED، وقد وضعت عدة بنيات ناقلات المؤتلف (الشكل 3). في الأصل، وناقلات TED على أساس تسلسل الترميز من CES2 (Refseq انضمام عدد NM_145603، CES2c) وأفضل أداء TED لوحظ مع التعبير المستقرة للبنيات CES. ناقلات TED نيو اكسبريس عنصرا أساسيا من CES2 تنصهر في البروتين مضان أحمر TagRFP-T2 36. هذه النواقل لها ميزة أنها يمكن أن تستخدم لتحديد الخلايا transduced واستخدام مضان أحمر باعتبارها الرقابة الداخلية لتطبيع التغييرات في Fluo5N/Ca 2 + مضان. كما يقدم مضان أحمر إمكانية لتصور توزيع الهيكلي للER والتغيرات في ديناميات ER في ظل ظروف التحفيز.

<table border="1">
	 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)</td>
 <td>Tocris</td>
 <td>0805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A26209-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B-27 supplement,50x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbamoylcholine chloride (Charbachol)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C4382-1g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cyclopiazonic acid (CPA)</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM with Glutamax</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>31966-047</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x</td>
 <td>PAA</td>
 <td>H15-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>10270-106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamate</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamax</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ham's F12 nutrients mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21765-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS</td>
 <td>PAA Laboratories</td>
 <td>H15-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Horse serum</td>
 <td>SHD3250YK</td>
 <td>Linearis</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin Ca2+ salt</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-116</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>murine EGF </td>
 <td>PreproTech</td>
 <td>315-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N2 supplement 100x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal medium</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21103-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F127, low UV absorbance,2g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P8638</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-Lysin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2636</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thapsigargin</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>586005-1mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TryLE Express</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12605-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS-003707</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heater controller TC-344B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0101</td>
 <td>to control in line solution heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NIH ImageJ software</td>
 <td>WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N2709100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLFLN40XO</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1478700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1480700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, inverse</td>
 <td>custom-made</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, RC-49FS</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>W4 64-1709 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion tube: PT-49</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1730</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>n.a. </td>
 <td>perfusion pump</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single inline solution heater SH-27B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0102</td>
 <td>controlled by heater controller</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suction tubes: ST3R</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1407</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel</td>
 <td>Pecon</td>
 <td>n.a. </td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)

تصور ديناميات الكالسيوم المهم أن نفهم دور الكالسيوم في علم وظائف الأعضاء الخلية. لدراسة ديناميات الكالسيوم، أصبحت الاصطناعية الفلورسنت كا 2 + المؤشرات شعبية. هنا علينا أن نظهر TED (= يسببها استهدفت-استريز صبغ التحميل)، وهي طريقة لتحسين الإفراج عن كا 2 + الأصباغ مؤشر في التجويف ER من أنواع مختلفة من الخلايا. حتى الآن، تم استخدام TED في خطوط الخلايا، والخلايا الدبقية، والخلايا العصبية في المختبر. قواعد TED على كفاءة، المؤتلف استهداف نشاط إستيراز الكربوكسيل عالية لمعة ER باستخدام ناقلات التركيبات التي Carboxylesterases صريح (CES). أحدث ناقلات TED تحتوي على عنصر أساسي من CES2 تنصهر لبروتين أحمر فلوري، وبالتالي تمكين المتزامن التصوير اللونين. يتم تصوير ديناميات الكالسيوم الحرة في ER في لون واحد، في حين يظهر هيكل ER المقابلة باللون الأحمر. في بداية الإجراء، والخلايا transduced مع الفيروسة البطيئة. وفي وقت لاحق، والخلايا المصابة لإعادة المصنف coverslips على لتمكين أخيرا التصوير الخلية الحية. ثم، يتم تحضين الخلايا الحية مع استر acetoxymethyl (AM-استر) شكل من الاسعار المنخفضة للتقارب كا 2 + المؤشرات، على سبيل المثال Fluo5N-AM، MAG-Fluo4-AM، أو ماج-Fura2-AM. يتم تشكيل النشاط استريز في ER يشق قبالة سلاسل الجانب مسعور من النموذج AM من كا 2 + المؤشر وماء صبغة الفلورسنت / كا 2 + معقدة والمحاصرين في التجويف ER. بعد صبغ التحميل، ويتم تحليل الخلايا في مقلوب ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي. و perfused الخلايا باستمرار مع حلول قارع الأجراس تشبه وديناميات الكالسيوم ER هي تصور مباشرة بواسطة الوقت الفاصل بين التصوير. يتم التعرف الافراج الكالسيوم من ER من انخفاض في كثافة مضان في المناطق ذات الاهتمام، في حين أن إعادة تعبئتها من مخزن الكالسيوم ER تنتج زيادة في كثافة مضان. وأخيرا، يتم تحديد التغير في كثافة الفلورسنت بمرور الوقت من خلال حساب ΔF / F 0.

<html> يوفر هذا البروتوكول نهجا غير التخريبية للتصوير مباشرة من حر ER الكالسيوم. انخفاض تقارب الاصطناعية كا 2 + يتم الافراج المؤشرات والمحاصرين في التجويف ER مع مساعدة من ER المستهدفة، المؤتلف نشاط انزيم استريز. تحسين التحميل من كا 2 + الأصباغ مؤشر إلى ER التجويف ت...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED at JoVE.com

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

استهدفت-استريز التي يسببها صبغ التحميل (TED) يدعم تحليل الديناميات داخل الخلايا مخزن الكالسيوم عن طريق التصوير مضان. تستند هذه الطريقة على استهداف من إستيراز الكربوكسيل المؤتلف إلى الشبكة الإندوبلازمية (ER)، حيث أنه يحسن إماطة اللثام المحلية الاصطناعية منخفضة تقارب كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; الأصباغ مؤشر في التجويف ER.

التصوير المباشر من الكالسيوم مع ER-المستهدفة استريز المستحثة صبغ تحميل (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

direct-imaging-er-calcium-with-targeted-esterase-induced-dye-loading

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

19.1K Views.  University of Wuerzburg. استهدفت-استريز التي يسببها صبغ التحميل (TED) يدعم تحليل الديناميات داخل الخلايا مخزن الكالسيوم عن طريق التصوير مضان. تستند هذه الطريقة على استهداف من إستيراز الكربوكسيل المؤتلف إلى الشبكة الإندوبلازمية (ER)، حيث أنه يحسن إماطة اللثام المحلية الاصطناعية منخفضة تق?...

Video: Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

محطات التحميل العصب ذبابة الفاكهة مع مؤشرات الكالسيوم

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

في فيفو 2 فوتون التصوير الكالسيوم في طبقة 2 / 3 من الفئران

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

التصوير الكالسيوم من الخلايا العصبية باستخدام Fura القشرية ، 02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

يعيش التصوير الكالسيوم الخلية المشتركة مع وساطة سيرنا إسكات الجينات يحدد كا 2 + قنوات تسرب في غشاء ER وآلياتها التنظيمية

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased biosafety and stability over use of live pathogens. Non-infectious and self-assembling, VLPs are used to present structural proteins as immunogens, bypassing the need for live pathogens or recombinant viral vectors for antigen delivery. In this article, we demonstrate the different stages of VLP design and development for future applications in preclinical animal testing. The procedure includes the following stages: selection of antigen, expression of antigen in cell line of choice, purification of VLPs/SVPs, and quantification for antigen dosing. We demonstrate use of both mammalian and insect cell lines for expression of our antigens and demonstrate how methodologies differ in yield. The methodology presented may apply to a variety of pathogens and can be achieved by substituting the antigens with immunogenic structural proteins of the user&#39;s microorganism of interest. VLPs and SVPs assist with antigen characterization and selection of the best vaccine candidates.

Here, we present a protocol for synthesizing virus-like particles using either baculovirus or mammalian expression systems, and ultracentrifugation purification. This highly customizable approach is used to identify viral antigens as vaccine targets in a safe and flexible manner.

التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

رصد إير / سر إطلاق الكالسيوم مع الكالسيوم المستهدفة<sup&gt; 2+</sup&gt; الاستشعار الماسك<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

التصوير خيوط متوسطة وميكروتوبوليس مع الفحص المجهري 2-الأبعاد التعمير البصرية العشوائية المباشرة

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

الأسفار الانتعاش بعد p62 "فوتوبليتشينج من الأصفر فلوري البروتين معلم" في "الهياكل التي يسببها" مثل أجريسومي

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

تصوير ديناميات الكالسيوم في السكان الفرعيين من خلايا الفئران جزيرة البنكرياس

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...