Wir danken Lee Tuddenham (IBMC, Straßburg) zum Verstärken und Titration MCMV-Luc und Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) für die Erlaubnis, die Tierhaltung des Instituts für Virologie verwenden. Finanzielle Unterstützung von INSERM, Université de Strasbourg und Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) anerkannt wird. Die anfängliche Beteiligung von Sonia Beroud und Laetitia Lelieur während ihres Master-Projekt wird auch anerkannt.

1. Herstellung von Viral Suspension <ol><li> Besorgen Sie sich die Smith Stamm von MCMV Ausdruck Luciferase (MCMV-Luc 15) von Ulrich Koszninowski Labor. In diesem rekombinanten wird die Luciferase-Gens in der ie2 Ort der MCMV-Genoms inseriert. </li><li> Um MCMV-Luc verstärken, infizieren murinen Knochenmark Stroma-Zelllinie (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) mit MCMV bei unterschiedlichen Multiplizität der Infektion (MOI, 0,001 bis 1) 16. Dazu hinzuzufügen Virus kultivierten Zellen in serumfreiem Medium bei 37 ° C. Nach einer Stunde, den Überstand entfernen und ersetzen Sie es mit DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt. Fünf Tage später, ernten das Kulturmedium und speichern Aliquots bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Titration des viralen Suspension durch Plaque-Assay. <ol><li> Split-3T3-Zellen (ATCC # CRL-1658) in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 40.000 Zellen / Vertiefung in 1 ml DMEM mit 10% FCS enthält, Penicillin (200 IU / ml) und steptomycin (200 mg / ml ergänzt) Und Inkubation 24 h bei 37 ° C. </li><li> Bereiten Reihenverdünnungen (10 -1 bis 10 -8) eines Aliquots MCMV Suspension in DMEM und infizieren Zielzellen (3T3) mit 200 ul einer Verdünnung nach dem Entfernen Zellkulturmedium. Inkubieren Sie 1 hr bei 37 ° C. 1 ml der oben Medium (DMEM 3% FCS, 2% (v / v) Gentamycin, 200 IU / ml Penicillin, 200 mg / ml Streptomycin, 8 g / l Carboxymethylcellulose) und Inkubation 5 Tagen bei 37 ° C. </li><li> Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 ul 10% Formaldehyd (Verdünnung von Formaldehyd mit Wasser sollte in einer chemischen Haube zu toxischen Inhalationen vermeiden geschehen) in jede Vertiefung und Inkubation 6 h bei Raumtemperatur. Entfernen Kulturmedium + Fixateur durch Pipettieren aus und fügen Sie 200 ul Zelle Färbelösung (1% Kristallviolett (w / v) in 20% Ethanol). Vor Gebrauch verdünnen 1 Teil mit 9 Teilen Milli-Q-Wasser. Inkubation 2 min bei Raumtemperatur, waschen Sie die Platte 3-4x durch Einweichen in Wasser, trocknen lassen und zählen die Anzahl der Plaques mit einem Fernglas. </li></ol></li> &lt;li&gt; verdünnen MCMV-Luc in DMEM bis 50 PFUs in 50 ul erhalten und lassen auf Eis bis zur weiteren Verwendung. Mit höheren viralen Impfkulturen induziert Letalität bevor die Neugeborenen 2-3 Wochen alt zu erreichen. Nach unserer Erfahrung induzieren 500 PFUs Letalität in alle Neugeborenen 5-7 Tage nach der Injektion. </li></ol> 2. Die Injektion von Neugeborenen <ol><li> Wenn neonates (4 bis 20 hr-alten Mäusen) verfügbar sind, zu manipulieren das Katzenklo und den Kot des Käfigs mit Handschuhen, bevor sorgfältig den Umgang mit den pups um eine Kontamination mit &quot;fremden&quot; Gerüche, die die Mutter betonen, würde und induzieren die Ablehnung der pups zu vermeiden . </li><li> Führen Sie ein intraperitoneale Injektion unter Verwendung von eine Insulin-Spritze (29 G) wie in Fig. 1A gezeigt. Halten Sie die Neugeborenen mit der dorsalen Haut. Mit Bauchseite up, Einführung der Nadel unter dem Vorderbein und drücken Sie sie vorsichtig subkutan in die Bauchhöhle (ein wenig unter dem Nabel) zu erreichen. Wir haben derzeit injizieren 1% Methylenblau in DPBS verdünnt und zu überwachen, um Überleben practice die Technik, bevor Virusinfektionen. Da Methylenblau ist deutlich sichtbar beim Einspritzen, empfehlen wir die Durchführung dieses &quot;Training&quot; injection erste ordnungsgemäße Lieferung der viralen Suspension in der Bauchhöhle zu gewährleisten. </li><li> Beseitigen Sie die winzigen Tropfen Blut, die auftreten können und legen Sie die Neugeborenen in den Käfig zurück. </li></ol> 3. In vivo Imaging <ol><li> Am Tag 7, behandeln die Neugeborenen mit dem gleichen Vorsichtsmaßnahmen wie zuvor erwähnt. Spritzen intraperitoneal eine Mischung von Anästhetika (4 mg / ml Ketamin, 0,8 mg / ml Xylazin) und Luciferin (0,15 mg / g Körpergewicht) in 50 ul in jedem Tier. Durchschnittliche Körpergewicht der Tiere beträgt 1-2 g und die Dosis von Anästhetika pro Tier ist: Ketamin 40 ug, Warten Xylazin 8 ug 12-15 min bis Luciferin erreicht ihr Maximum der Emission. Dies hat zu bestimmen vorher und hängt von der Luciferin-Provider und dem Abbildungssystem verwendet wird. </li><li> Während die pups sind anesthetized, markieren Sie sie für zukünftige Identifizierung und ernten ein kleines Stück Gewebe, das dann für zukünftige Genotypisierung kann verwendet werden, wenn mutierten Tiere verwendet werden. </li><li> Legen Sie die Welpen in der Imaging-System und führen Erwerb des Lichts durch den ganzen Körper emittiert. Sieben Tage nach der Infektion ist das Virus in zahlreichen Kopien in Zielorganen wie Leber, Nieren, Lungen und Speicheldrüsen repliziert, weshalb die Dauer der Exposition sollte kurz sein. In unserem Fall, führen wir den Erwerb für 10 bis 20 Sekunden (Abbildung 1B). Die Plattform für den Erwerb Kammer des bildgebenden Gerät muss erhitzt werden, um zu starke Abkühlung der Körpertemperatur von betäubten Tieren zu vermeiden. In Zusätzlich, ist es hilfreich, um Bilder mit niedriger Auflösung von mehrere Tiere innerhalb einer Runde des Erwerbs erhalten, und dann, bewegen Sie up die Plattform näher an der Kamera Linse in, um auf der einen Teil einer bestimmten Tier oder in einen isoliertes Organ im Anschluss an dissection zu konzentrieren. Die Software muss ermöglichen schnelle Änderungenvon den Parametern (Belichtungszeit, Entfernung sample / Linse Empfindlichkeit), Quantifizierung von definierten Bereichen von Interesse und zukünftige Übertragungen von Schnappschuss-Bildern. </li><li> To Licht Signal aus dem Kopf nur erwerben,, decken Sie den Körper von den Neugeborenen liegend seitlich mit einer dicken, dunkel Papier, das den Photonen auf der Ebene der den Organen, wo hohe virale Replikation tritt auf, (Leber, Lunge, Speicheldrüsen) emittierten maskieren wird und führen Sie Akquisition für 5 bis 10 min (Abbildung 1C). Führen Übernahme der gegenüberliegenden Seite des Tieres in den gleichen Bedingungen. </li><li> Reintroduce die Welpen in den Käfig und legen Sie eine Wärmelampe auf eine zu starke Abkühlung der narkotisierten Neugeborenen zu vermeiden. Regelmäßig überwachen post-Anästhetikum Genesung. Mit der angegebenen Dosis, Anästhesie aktuell dauert 30 min. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang an den Tagen 9, 11 und 14. An den Tagen, 11 und 14, ändern Sie die Dosis von Anästhetika (6 mg / ml Ketamin, 1.2 mg / ml Xylazin). </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+control+murine+cytomegalovirus+replication+in+the+central+nervous+system+of+newborn+animals.">CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals.</a> J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).</li><li>Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+welfare+and+the+3Rs+in+European+biomedical+research.">Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).</li><li>Sacher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+types+in+cytomegalovirus+infection+in+vivo.">The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).</li><li>Lutarewych, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+murine+cytomegalovirus+in+a+continuous+bone+marrow-derived+stromal+cell+line+(M2-10B4).">Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4).</a> J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanzielles Interesse. Ethik-und Verlustrechnung Die Tiere wurden unter pathogen-freien Bedingungen in der Tierpflege Anlage des Institut d&#39;Immunologie et d&#39;Hématologie gepflegt. Handhabung von Mäusen und experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Französisch Gesetz zum Schutz von Labortieren durchgeführt. Das Verfahren wurde durch den Dienst VETERINAIRE de la Préfecture du Bas-Rhin (Frankreich) unter der Zulassungsnummer A-67-345 genehmigt.

Mit In-vivo-Imaging-Technologie MCMV-Luc Verbreitung in Mäusen Neugeborenen zu überwachen, waren wir in der Lage, die Ausbreitung des Virus in das Gehirn von mutierten Tieren, wie zum Wildtyp Gegensatz zu beobachten. Weitere Präparation des Tieres und ex vivo Bildgebung des Gehirns bestätigte die Anwesenheit von Lumineszenz-Virus in das zentrale Nervensystem. Darüber hinaus haben wir auch durchgeführt Immunhistochemie (nicht gezeigt) auf Gehirn dünne Abschnitte mit einem Antikörper spezifisch f...

Menschliches Cytomegalovirus (HCMV/HHV-5) ist ein Mitglied der β-Herpesvirus-Familie. HCMV ist eine sehr weit verbreitete, opportunistische Erreger, die normalerweise während der frühen Leben als asymptomatische Infektion 1 erworben. Wie alle Herpesviren bleibt HCMV über die gesamte Lebensdauer des Wirts, deren Immunsystem dicht steuert virale Replikation. Folgen der viralen Reaktivierung meist bei immungeschwächten Personen wie Transplantation Patienten, die Medikamente zur Verhinderung der Abstoßung von 2 auftreten. Bei Erwachsenen wurde HCMV auch Glioblastome 3 in Verbindung gebracht worden. Darüber hinaus ist HCMV ein prominenter Erreger für Neugeborene mit unreifen Immunität 4-6. Die primäre Infektion in den sich entwickelnden Fötus oder Neugeborenen kann schwerwiegende Folgen haben. HCMV-Infektion ist die häufigste infektiöse Ursache der angeborenen Missbildungen und Störungen im Kindesalter in den entwickelten Ländern. Es wird geschätzt, dass die Inzidenz von Neugeborenen HCMV-Infektion 0,5-1% o wirktf alle Lebendgeburten unter denen 5-10% von schweren Symptomen wie Mikrozephalie oder Kleinhirnhypoplasie leiden. Darüber hinaus werden 10% der infizierten Säuglinge mit subklinischen Virusinfektion später entwickeln Folgeerscheinungen führt zu mentaler Retardierung, Hörverlust, Sehstörungen oder Beschlagnahme und Epilepsie 7,8. Im Gegensatz zu anderen humanen Herpesviren wie Herpes Simplex 1 (HSV-1/HHV-1), die Mäuse über verschiedene Wege der Einspritzung 9 geimpft werden kann, ist im Gegensatz Cytomegalovirus-Replikation artspezifisch. Diese Funktion wurde stark Untersuchungen von HCMV Pathogenese, die in verschiedenen Tiermodellen durchgeführt behindert werden (Maus, Ratte, Meerschweinchen, Rhesusaffen) sowie ihre jeweiligen echten Host-spezifische CMVs. Alle CMVs signifikante Ähnlichkeiten in der Genom-Größe und Organisation, Gewebetropismus und Regulation der Genexpression. Sie induzieren auch ähnliche Pathologien in ihren jeweiligen Gastgeber. Trotz genomischen Vielfalt seinzwischen HCMV-und Maus-Cytomegalievirus (MCMV) (50% der ORFs im menschlichen Virus im murinen CMV identifiziert) hat die Mausmodell kürzlich als vorteilhaft erwiesen, vor allem, weil Mutanten können auf ihre Fähigkeit, virale Kontrolle getestet werden Replikation in vivo. Dies hat zu einer genetischen Bildschirm, die eine Abschätzung der Zahl der Gene der Maus an der erwachsenen Stadium ausgedrückt, die die &quot;resistome&quot; gegen dieses Virus 10 komponieren aktiviert führte. Insgesamt bedeutet dies, dass MCMV-infizierten Mäuse stellen ein attraktives Modell für die Untersuchung von Wirt-Virus-Interaktionen bei Erwachsenen. Die Erforschung der angeborenen CMV-Infektion ist komplexer, weil Unterschiede in der Plazenta Schicht Organisation zwischen Mensch und Maus beeinträchtigen die Mutter-Fötus Übertragung des viralen Infektion in Mäusen. Vor kurzem hat die direkte Injektion von MCMV in der Plazenta an Tag 12,5 der Trächtigkeit Gehirninfektion von Mäusen Neugeborenen, die zu Hörschäden 11 geführt aktiviert. Allerdings sind die meisten investigations jetzt intraperitoneale Injektion von 4-20 hr-alten Neugeborenen auf eine systemische virale Verbreitung potenziell zu hämatogene Infektion des Gehirns, ein Modell, das mehr relevant als die eines intrakraniellen Injektion geben. Dieses Protokoll die wichtige Hinweise auf CMV Pathogenese und insbesondere, dass es MCMV Infektion von Neugeborenen Ergebnisse der viralen Replikation in neuronalen und glialen Zellen in Entzündungsherde, die mit mononukleären Zellen wie Makrophagen infiltriert 12 befinden gezeigt. Dieser Bericht ist auch verändert Morphogenese des Kleinhirns mit verminderter körnige Neuron Proliferation und Migration und die Induktion von Interferon-stimulierten mehrere Gene begleitet beschrieben. Die wesentliche Rolle von CD8 +-T-Zellen zur Kontrolle der MCMV in das zentrale Nervensystem wurde auch von der gleichen Gruppe 13 gemeldet. Ein wichtiger Aspekt bei der Analyse der pathologischen Wirkung einer Mikrobe ist die Dynamik des infizierenion. Im Falle von MCMV, ist es besonders wichtig zu erforschen und zu quantifizieren, das Fortschreiten der viralen Verbreitung in die sich entwickelnde Gehirn, um zu verstehen und zu antizipieren Umfangs des zukünftigen neurobiological Verletzungen. Traditionell erfordert die Quantifizierung der Progression einer Infektion das regelmäßige Opfer der infizierten Tiere den Erreger in Geweben wie dem Gehirn, die sonst nicht zugänglich sind titrieren. Diese Art von Protokoll ist nun durch notwendige Verbesserung des Tierschutzes und der 3R (Reduce, Refine, Replace) 14 Prinzipien in Frage gestellt. Mit In-vivo-Imaging-Technologien gestatten eine drastische Reduzierung der Zahl der Tiere, die notwendig sind, in vivo Infektion Experimente. Hier berichten wir und beschreiben eine zeitliche Verlauf Analyse der viralen Verbreitung in das Gehirn auf intraperitoneale MCMV-Luc Injektion Maus Neugeborenen. Mit den gleichen Tieren, verfolgt und überwacht werden wir in vivo die Websites der intensiven viral Replikation während einer 2-Wochen-Frist.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3523A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319112</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4897</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CentraVet</td>
			<td>Ket 201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine/Vetranal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>P0436500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>gentamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>carboxymethylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4888</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3886</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IVIS 50</td>
			<td>Caliper/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of in vivo imaging to monitor the progression of experimental mouse cytomegalovirus infection in neonates

Humanen Cytomegalovirus (HCMV oder HHV-5) ist eine lebensbedrohliche Erreger in immungeschwächten Personen. Upon angeborenen oder neonatalen Infektion, kann das Virus infizieren und zu replizieren in das sich entwickelnde Gehirn, die schweren neurologischen Schäden, einschließlich Taubheit und geistige Retardierung induzieren, kann. Ein Hindernis für die Schwere der Symptome, die therapeutischen Möglichkeiten der Nichtverfügbarkeit eines Impfstoffs und das Fehlen eines spezifischen antiviralen Therapie begrenzt. Weiterhin ist ein genaue Beschreibung der molekularen Ereignisse vorkommenden während der Infektion des zentralen Nervensystems-System (CNS) noch fehlt seit Beobachtungen meist aus dem Autopsie der infizierten Kinder abzuleiten. Mehrere Tiermodellen, wie Rhesusaffen CMV, wurden entwickelt und lieferte wichtige Einblicke in CMV Pathogenese im ZNS. Doch trotz seiner evolutionären Nähe mit Menschen wurde dieses Modell durch den intrakraniellen Impfung Verfahren verwendet werden, um die Tiere und Nachteile infizieren begrenztistently induzieren ZNS-Infektion. Darüber hinaus haben ethische Überlegungen die Entwicklung alternativer Modelle gefördert, unter denen Neugeborenen Infektion von neugeborenen Mäusen mit Maus Cytomegalovirus (MCMV) hat vor kurzem zu bedeutenden Fortschritten geführt. Zum Beispiel wurde berichtet, dass intraperitoneale Injektion von MCMV in Balb / c Neugeborenen zur Infektion von Neuronen und Gliazellen in bestimmten Bereichen des Gehirns führt. Diese Befunde legen nahe, dass die experimentellen Impfung von Mäusen könnten die Defizite durch HCMV-Infektion bei Kindern induziert rekapitulieren. Dennoch ist eine dynamische Analyse der MCMV Infektion von Neugeborenen schwierig durchzuführen, weil klassische Methodik erfordert das Opfer einer erheblichen Anzahl von Tieren zu unterschiedlichen Zeitpunkten, um die virale Belastung und / oder immun-Parameter zu analysieren. Um diesen Engpass zu umgehen und künftigen Untersuchungen von seltenen mutierten Tiere zu ermöglichen, verwendeten wir in vivo Imaging-Technologie, um eine Zeit-Gänge Analyse der vira durchführenl Verbreitung im Gehirn bei peripherer Injektion eines rekombinanten MCMV Luciferase zu C57BL / 6 Neugeborenen.

Ein repräsentatives Experiment ist in Abbildung 1 dargestellt. Upon intraperitoneale Injektion von 50 PFUs von MCMV-Luc (Das Bedienfeld A zeigt eine ähnliche Injektion mit Methylene blau durchgeführt, um die subkutane Route der der Nadel visualisieren), waren Neugeborenen anästhesiert und empfangenen gleichzeitig 0,3 mg des Luciferase-Substrat (Luciferin, Caliper). Fünfzehn Minuten später wurden die Tiere Bauchseite nach oben in den Erwerb Kammer des IVIS 50 (In-vivo-Imaging System, Caliper) und d...

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Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Humanen Cytomegalovirus (HCMV)-Infektion des Neugeborenen stellt eine wichtige Ursache für geistige Behinderung, aber die molekularen Ereignisse, die zum Virus-induzierten Pathogenese sind noch weitgehend unverstanden. Um die Dynamik der Infektion des Gehirns zu untersuchen, passten wir Ganzkörper-Tier<em&gt; In vivo</em&gt; Bildgebung durchführen Zeitverlauf Analyse der Neugeborenen mit einem Luciferase-rekombinanten Virus infiziert.

Verwenden Sie von<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging zur Überwachung der Progression of Experimental Maus Cytomegalovirus-Infektion bei Neugeborenen

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

14.9K Aufrufe.  Université de Strasbourg. Humanen Cytomegalovirus (HCMV)-Infektion des Neugeborenen stellt eine wichtige Ursache für geistige Behinderung, aber die molekularen Ereignisse, die zum Virus-induzierten Pathogenese sind noch weitgehend unverstanden. Um die Dynamik der Infektion des Gehirns zu untersuchen, passten wir Ganzkörper-Tier In vivo Bildgebung durchführen Zeitverlauf Analyse der Neugeborenen mit einem Luciferase-rekombinanten Virus infiziert.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

Die Verwendung von Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) auf Lymphozyten-Proliferation-Monitor

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Nachweis eines Neuro-Invasive encephalitische Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

In-vivo-Imaging-Methode zu unterscheiden, akuten und chronischen Entzündungen

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten<em&gt; In-vivo-</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Bildgebung der In Situ Interferon Gamma Produktion in der Maus Milz nach Listeria monocytogenes Infektion

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...