우리는 바이러스학 연구소의 동물 시설을 사용할 수있는 권한을 증폭 및 MCMV - 루크와 토마스 Baumert (INSERM U748, 스트라스부르) 적정에 대한 리 Tuddenham (IBMC, 스트라스부르) 감사합니다. INSERM, Université 드 스트라스부르과 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR-08-풍채 005 01)로부터 재정 지원을 인정 받고 있습니다. 자신의 마스터 프로젝트 기간 동안 소니아 Beroud 및 Laetitia Lelieur의 초기 참여도 인정 받고 있습니다.

1. 바이러스 현탁액의 준비 <ol><li> 울리히 Koszninowski의 연구실에서 MCMV 표현 루시 페라 제의 스미스 변형 (MCMV 뤽 15)을 얻었다. 이 재조합에서 루시 페라 제 유전자 MCMV 게놈의 IE2 현장에 삽입됩니다. </li><li> MCMV 뤽를 증폭하기 위해, 감염의 다른 다양성 (MOI 0.001 1로) 16시 MCMV와 쥐 골수 기질 세포 라인 (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) 감염. 이를 위해, 37 혈청 배지에서 배양 세포에 바이러스를 추가 ° C. 일시간 후, 상층 액을 제거하고 DMEM이 10 % 소 태아 혈청 (FCS)로 보충로 교체합니다. 5 일 후, 추가로 사용할 때까지 -80에서 배지 및 저장 분주 ° C를 수확. </li><li> 상패 분석​​에 의해 바이러스 현탁액의 적정. <ol><li> DMEM 40,000 세포에서 24 잘 판에 3T3 세포 (ATCC # CRL-1658) 스플릿 / 잘 1 ML 페니실린 (200 IU / ml)에 steptomycin을 (200 MG / ML 포함 10 % FCS와 보충) 37시 24 시간을 품어 ° C. </li><li> DMEM에 MCMV 현탁액의 나누어지는 일련 희석 (10 -1 ~ 10 -8)를 준비하고 세포 배양액을 제거한 후 희석 200 μL을 대상으로 세포 (3T3) 감염. 37 1 시간을 품어 ° C. 주요 매체의 1 ML (DMEM 3 % FCS, 2 % (v / v)의 젠타 마이신, 200 IU / ML 페니실린, 200 MG / ML 스트렙토 마이신, 8g / L 카르복시 메틸 셀룰로오스)를 추가하고 37 오일을 품어 ° C. </li><li> 각 well에 200 μL 10 %의 포름 알데히드 (물과 포름 알데히드의 희석 독성 들숨을 피하기 위해 화학 후드에서 수행되어야한다) 추가하고 실온에서 6 시간을 배양하여 세포를 고정합니다. 밖으로 pipetting하여 배양 배지 + 고정 기는를 제거하고 200 μl의 세포 염색 용액 (20 % 에탄올 1 % 크리스탈 바이올렛 (W / V))를 추가합니다. 사용하기 전에, 9 부품 밀리 Q 물과 1 부분을 희석. 상온에서 2 분 알을 품다, 물에 담가 3 배 접시를 씻어 쌍안경과 플라크의 수를 건조하고 계산하자. </li></ol></li> &lt;리&gt; 50 μl의 50 PFUs를 얻고 더 사용할 때까지 얼음에 떠날 DMEM에서 MCMV 룩을 희석. 신생아는 생후 2-3 주에 도달하기 전에 높은 바이러스 접종를 사용하여 치사를 유도합니다. 우리의 경험에서, 500 PFUs는 주사 후 모든 신생아 5-7일에서 치사를 유도. </li></ol> 2. 신생아의 주입 <ol><li> 신생아 (4 ~ 20 시간짜리 마우스)를 사용할 수있는 경우, 어머니의 스트레스와 새끼의 거부를 유도 할 &quot;외국인&quot;냄새와 오염을 방지하기 위해 조심스럽게 새끼를 취급하기 전에 쓰레기와 장갑 케이지의 배설물을 조작 . </li><li> 그림 1A와 같이 인슐린 주사기 (29 G)를 사용하여 복강 주사를 수행합니다. 지느러미 피부에 신생아를 잡습니다. 복부 쪽이 위로, 앞다리에서 바늘을 소개하고 부드럽게 복막 캐비티 (배꼽 아래 작은) 달성하기 위해 피하 주사를 누릅니다. 우리는 현재 DPBS에 희석 1 % 메틸렌 블루를 주입 P에 생존을 모니터링바이러스 감염을 수행하기 전에 ractice 기술. 메틸렌 블루 주사 과정에서 명확하게 볼 수 있기 때문에, 우리는 복강 내 구멍에 바이러스 서스펜션의 적절한 전달을 보장하기 위해 먼저이 &quot;교육&quot;분사를 수행하는 것이 좋습니다. </li><li> 발생 및 신생아 다시 케이지에 배치 할 수있는 작은 혈액 방울을 제거합니다. </li></ol> 3. 생체 내 이미징 <ol><li> 7 일째에 동일하게 앞서 언급했듯이주의와 신생아를 처리합니다. 복강에게 마취제 (4 MG / ML 케타민, 0.8 MG / ML xylazine)와 각 동물에 μL 50 루시페린 (0.15 ㎎ / g 체중)의 혼합물을 주입. 동물의 평균 체중 1-2 g와 마취제 당 동물의 복용량입니다 : 루시페린이 방출의 최대에 도달 할 때까지 케타민을 40 μg, xylazine 8 μg 12-15 분을 기다립니다. 이 사전에 결정되어야하며 루시페린 공급자 및 사용 이미징 시스템에 따라 달라집니다. </li><li> 새끼는 anestheti 있지만데이빗 미래의 식별을 태그와 돌연변이 동물을 사용하는 경우, 향후 유전자형에 사용할 수있는 조직의 작은 조각을 수확. </li><li> 영상 시스템의 새끼를 놓고 몸 전체에서 나오는 빛의 인수를 수행합니다. 감염 후 7 일, 바이러스는 대상과 같은 간 등의 장기, 신장, 폐, 타액선 수많은 복사본으로 복제 한하므로, 노출 기간은 짧아야한다. 우리의 경우, 우리는 10 ~ 20 초 (그림 1B)에 대한 인수를 수행합니다. 이미징 장치의 취득 챔버 플랫폼은 마취 동물의 체온의 과도한 냉각을 방지하기 위해 가열해야합니다. 또한, 획득 한 라운드에서 여러 동물의 낮은 해상도의 이미지를 얻을 후, 해부에 따라 특정 동물이나 고립 된 기관의 한 부분에 집중하기 위해 플랫폼 가까이 카메라 렌즈까지 이동하는 도움이됩니다. 이 소프트웨어는 급속한 변화를 사용하도록 설정해야합니다관심과 스냅 샷 이미지의 향후 수출 정의 된 영역의 매개 변수 (노출 시간, 거리 / 샘플 렌즈, 감도), 정량. </li><li> 단지 머리에서 빛 신호를 얻기 위해, 높은 바이러스 성 복제가 발생 기관의 수준 (간, 폐, 타액선)에서 방출되는 광자를 마스킹 수행 두껍고 어두운 종이로 옆으로 누워 신생아의 몸을 커버 5 ~ 10 분 (그림 1C)에 대한 인수. 동일한 조건에서 동물의 반대 측의 인수를 수행합니다. </li><li> 케이지에 새끼를 재 도입하고 마취 신생아의 과도한 냉각을 방지하기 위해 상단에 가열 램프를 배치합니다. 정기적으로 사후 마취 복구를 모니터링 할 수 있습니다. 표시된 용량과 마취는 현재 30 분 동안 지속됩니다. </li><li> 일 9, 11 및 14에서 동일한 절차를 반복합니다. 일 11 14, 마취제 (6 밀리그램 / ML 케타민, 1.2 MG / ML xylazine)의 용량을 변경합니다. </li></ol>

<ol>
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저자는 더 경쟁 재무 적 이해 관계를 선언합니다. 윤리 문 동물 문화원 디부 Immunologie 등 디 Hématologie의 동물 보호 시설에서 무균 조건 하에서 유지 하였다. 쥐 실험 절차의 처리는 실험 동물의 보호를위한 프랑스 법에 따라 실시 하였다. 절차는 인증 번호 A-67-345에서 서비스 véterinaire 드 라 경시청 뒤 바랭 (프랑스)에 의해 승인되었다.

마우스 신생아 MCMV 룩 보급을 모니터링하는 생체 이미징 기술을 사용하여, 우리는 야생형에 반대 돌연변이 동물의 뇌에 바이러스 확산을 관찰 할 수 있었다. 뇌의 동물과 생체 이미징의 추가 해부 중추 신경계의 발광 바이러스의 존재를 확인했다. 또한, 우리는 또한 MCMV E1 초기 단백질에 대한 특정 항체를 뇌의 얇은 부분에 (미도시) 면역 조직 화학 염색을 시행하고 실제로 MCMV?...

인간 거대 세포 바이러스 (HCMV/HHV-5)는 β-헤르페스 가족의 구성원입니다. HCMV는 일반적으로 무증상 감염이 1로 초기 생활하는 동안 획득 매우 유행, 기회 병원균이다. 모든 헤르페스 바이러스와 마찬가지로, HCMV는 면역 체계를 단단히 바이러스 복제를 제어하는​​ 호스트의 전체 수명 동안 지속됩니다. 바이러스 재 활성화의 에피소드는 대부분 같은 이식 거부 2을 방지하기 위해 약물을받는 이식 환자와 같은 면역 개인에서 발생합니다. 성인, HCMV는 교종 3에 연결되어 있습니다. 또한, HCMV는 미성숙 한 면역 4-6 신생아 눈에 띄는 병원체이다. 개발 태아 또는 신생아의 주 감염은 심각한 결과를 가질 수 있습니다. HCMV 감염은 선진국의 선천적 결함과 어린 시절 장애의 가장 흔한 감염 원인입니다. 그것은 신생아 HCMV 감염의 빈도는 0.5 % O에 영향을 미치는 것으로 추정된다F ~ 10 %가 같은 소두증 또는 소뇌 형성 부전 등의 심각한 증상으로 고생되는 가운데 모든 출산. 또한, 무증상 바이러스 감염에 감염된 유아의 10 %는 나중에 손실, 시각적 결함이나 발작과 간질 7,8 청각, 정신 지체로 이어지는 sequellae을 개발합니다. 로 주입 9 다른 경로를 통해 마우스에 접종 할 수있는 등 단순 포진 1 (HSV-1/HHV-1)와 같은 다른 인간 헤르페스 바이러스에 반대, 사이토 메갈로 바이러스 복제는 특정 종이다. 이 기능은 심각하게 다른 동물 모델에서 수행되는 HCMV의 발병의 조사를 방해 (마우스, 쥐, 기니피그, 붉은 털 원숭이)과 각각의 정품 호스트 관련 CMVs있다. 모든 CMVs 게놈의 크기 및 조직, 조직 친 화성 및 유전자 발현의 조절에 상당한 유사성을 나타냅니다. 또한 각각의 호스트에있는 유사한 병리를 유발. 에도 불구하고 게놈 다양성은 수사이 HCMV 및 마우스 사이토 메갈로 바이러스 (MCMV) (ORF를 50 % 쥐 CMV에서 확인 된 인간의 바이러스에 존재)는 마우스 모델은 최근 대부분의 돌연변이 변종이 바이러스를 통제 할 수있는 능력을 테스트 할 수 있기 때문에 유리한 것으로 판명되었습니다 생체 내에서 복제. 이것은이 바이러스 10 &quot;resistome&quot;를 구성하는 성인 무대에서 표현 마우스 유전자의 수의 추정을 가능하게 유전 화면되었다. 모두이는 MCMV에 감염된 생쥐는 성인의 호스트 바이러스 상호 작용의 연구를위한 매력적인 모델을 나타냅니다 나타냅니다. 인간과 생쥐 사이의 태반 층 조직의 차이가 생쥐의 바이러스 감염의 어머니에 태아 전송을 방해하기 때문에 선천성 CMV 감염의 탐험은 더 복잡합니다. 최근 임신 일 12.5에 태반 MCMV 직접 주입 장애 11 청각을 주도 쥐 신생아의 뇌 감염을 가능하게했다. 그러나 대부분의 전nvestigations 지금 잠재적으로 혈행 뇌 감염으로 이어지는 조직의 바이러스 전파, 두개 내 주사보다 더 관련이 모델을 제공하는 4-20 시간 된 신생아의 복강 내 주사를 사용합니다. 이 프로토콜은 CMV의 병인에 중요한 통찰력을 제공하고 특히, 그것은 대식 세포 12와 같은 단핵 세포에 침투하는 염증 병소에있는 신경 세포와 아교 세포에서 바이러스 복제 신생아 결과의 MCMV 감염을 증명 하였다. 이 보고서는 또한 감소 과립 신경 세포의 증식과 이동 및 여러 인터페론 - 자극 유전자의 유도와 함께 소뇌의 변경 형태 형성을 설명했다. 중추 신경계 MCMV의 컨트롤에 대한 CD8 + T 세포의 중요한 역할은 같은 그룹 (13)에 의해보고되었다. 미생물의 병적 인 효과를 분석 할 때 고려해야 할 중요한 측면은 감염의 역학이다이온. MCMV의 경우는 미래 신경 생물학적 손상의 정도를 이해하고 예측하기 위해 개발 뇌에 바이러스 전파의 진행을 탐구하고 정량화하는 것이 특히 중요합니다. 전통적으로, 감염의 진행의 정량화는 감염된 동물의 정기적 인 희생 액세스 할 수없는 두뇌와 같은 조직에 병원체, 역가 필요합니다. 프로토콜 유형은 지금 필요한 동물 복지의 향상과 3RS (교체, 수정, 감소) 원리 (14)에 의해 도전을하고 있습니다. 생체 내 이미징 기술을 사용하여 생체 내 감염 실험에 필요한 동물의 수의 급격한 감소를 허용 할 수 있습니다. 여기, 우리는보고와 마우스 신생아에 복강 MCMV 룩 주입시 뇌에 바이러스 전파의 시간 코스 분석을 설명합니다. 같은 동물을 사용하여, 우리는 강렬한 VI의 사이트를 추적하고 생체 모니터링2 주 기간 동안 RAL 복제.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3523A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319112</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4897</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CentraVet</td>
			<td>Ket 201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine/Vetranal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>P0436500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>gentamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>carboxymethylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4888</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3886</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IVIS 50</td>
			<td>Caliper/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of in vivo imaging to monitor the progression of experimental mouse cytomegalovirus infection in neonates

인간 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV 또는 HHV-5) 면역 손상 개인의 생명을 위협하는 병원체이다. 선천성 또는 신생아 감염되면, 바이러스는 감염 및 청각 장애, 정신 지체 등 심각한 신경 손상을 야기 할 수 두뇌 개발에 복제합니다. 증상의 잠재적 인 심각성에도 불구하고, 치료 옵션이 백신은 특정 바이러스 치료의 부재의 가용성에 의해 제한됩니다. 관찰은 주로 감염된 아이의 부검에서 파생 있기 때문에 또한, 중추 신경계 (CNS)의 감염 중에 발생하는 분자 사건의 정확한 설명은 아직 부족하다. 같은 붉은 털 원숭이 짧은 꼬리 원숭이 CMV 등 여러 동물 모델, CNS에서 CMV의 병인으로 발전하고 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 그러나 인간과 진화의 근접에도 불구하고,이 모델은 동물과 단점을 감염하는 데 사용되는 두개 접종 절차에 의해 제한되었다istently CNS 감염을 유도. 또한, 윤리적 마우스 사이토 메갈로 바이러스 (MCMV) 신생아 생쥐의 신생아 감염이 최근 크게 발전하게되었다 그중, 다른 모델의 개발을 추진하고있다. 예를 들어, 그것은 글루 Balb / C 신생아에 MCMV의 복강 내 주입은 뇌의 특정 영역에있는 뉴런과 glial 세포의 감염에 이르게 것을보고 하였다. 이러한 연구 결과는 생쥐의 실험 접종은 어린이 HCMV 감염에 의해 유발 적자를 요점을 되풀이 할 수 있다고 제안했다. 그럼에도 불구하고, 신생아의 MCMV 감염의 동적 분석은 고전적인 방법은 바이러스 성 부담 및 / 또는 면역 관련 매개 변수를 분석하는 서로 다른 시간 지점에서 동물의 상당수의 희생을 필요로하기 때문에 수행하기가 어렵습니다. 이 병목 현상을 회피하고 희귀 한 돌연변이 동물의 향후 조사를 가능하게하기 위해, 우리는 비라의 시간 코스 분석을 수행하기 위해 생체 내 이미징 기술 적용C57BL / 6 신생아에 루시 페라 제 표현하는 재조합 MCMV의 말초 주입시 뇌의 L 보급.

대표적인 실험은 그림 1에 설명되어 있습니다. MCMV 룩의 50 PFUs (패널 A는 바늘의 피하 경로를 시각화하기 위해 메틸렌 블루로 수행 유사한 주사를 보여줍니다)를 복강 내 주사시 신생아는 마취와 동시에 루시 페라 제 기판 (루시페린, 캘리퍼스)의 0.3 MG를 받았다. 15 분 후, 동물은 IVIS (50)의 수집 챔버 (생체 내 이미징 시스템에서, 캘리퍼스)에서 복부 측면을 배치되었고, 모든 동물에 의?...

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Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 - 동물의 적응<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징 루시 페라 제 - 재조합 바이러스에 감염된 신생아의 시간 코스 분석을 수행 할 수 있습니다.

사용<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

14.8K 조회수.  Université de Strasbourg. 신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 - 동물의 적응 생체 내 이미징 루시 페라 제 - 재조합 바이러스에 감염된 신생아의 시간 코스 분석을 수행 할 수 있습?...

비디오: Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

림프구 확산을 모니터 Carboxyfluorescein 디아 세 테이트 Succinimidyl 에스터 (CFSE)의 사용

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Heterokaryon 형성의 두 가지 방법 HCV 제한 요소를 발견하기

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

신경 침윤성 Encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (IVIS) 검색에서

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

칸디다 알비칸스 위장관에서 최면 모포 발생을 연구하는 Ex vivo 분석

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

재발 성 에스케리치아 콜라 이 요로 감염 Gardnerella 질 방광 노출에 의해 유발 마우스에서

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...