Nous remercions Lee Tuddenham (IBMC, Strasbourg) pour amplifier et titrant MCMV-Luc et Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) la permission d&#39;utiliser l&#39;animalerie de l&#39;Institut de virologie. Le soutien financier de l&#39;INSERM, Université de Strasbourg et l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) est reconnu. La participation initiale de Sonia Beroud et Laetitia Lelieur au cours de leur projet de master est également reconnu.

1. Préparation de la suspension virale <ol><li> Obtenir la souche Smith de MCMV exprimant la luciférase (MCMV-Luc 15) du laboratoire de Ulrich Koszninowski. Dans ce recombinant, le gène de la luciférase est insérée dans le locus du génome IE2 MCMV. </li><li> Pour amplifier MCMV-Luc, infecter une lignée murine de la moelle osseuse des cellules stromales (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) avec MCMV à différents multiplicité d&#39;infection (MOI, 0,001 à 1) 16. Pour ce faire, ajoutez le virus à des cellules cultivées dans un milieu sans sérum à 37 ° C. Après une heure, retirer le surnageant et le remplacer par du DMEM complété avec du sérum de veau foetal à 10% (FCS). Cinq jours plus tard, récolter le milieu de culture et des aliquotes de conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Titration de la suspension virale par dosage de plaque. <ol><li> Fractionner les cellules 3T3 (ATCC # CRL-1658) dans une plaque à 24 puits à 40.000 cellules / puits dans 1 ml de DMEM complété avec 10% de SVF contenant de la pénicilline (200 UI / ml) et steptomycin (200 mg / ml) Et incuber 24 heures à 37 ° C. </li><li> Préparer des dilutions en série (10 -1 à 10 -8) d&#39;une partie aliquote de MCMV suspension dans du DMEM et d&#39;infecter les cellules cibles (cellules 3T3) par 200 pl de la dilution après avoir enlevé le milieu de culture cellulaire. Incuber 1 heure à 37 ° C. Ajouter 1 ml de Haut Moyen (DMEM FCS à 3%, 2% (v / v) la gentamicine, 200 UI / ml de pénicilline, 200 mg / ml de streptomycine, 8 g / L carboxyméthylcellulose) et incuber 5 jours à 37 ° C. </li><li> Fixer les cellules en ajoutant 200 ul 10% de formaldéhyde (dilution de formaldéhyde avec de l&#39;eau doit être effectuée sous une hotte chimique pour éviter les inhalations toxiques) dans chaque puits et incuber 6 heures à température ambiante. Supprimer milieu de culture + fixateur par pipetage rupture et ajouter 200 de solution de coloration de cellules pi (1% de cristal violet (p / v) dans l&#39;éthanol à 20%). Avant utilisation, diluer 1 partie avec 9 parties d&#39;eau milli-Q. Incuber 2 min à température ambiante, laver la plaque 3-4x en le trempant dans l&#39;eau, laisser sécher et comptez le nombre de plaques avec une paire de jumelles. </li></ol></li> &lt;li&gt; Diluer MCMV-Luc dans DMEM à obtenir 50 PFU dans 50 pi et laisser sur la glace jusqu&#39;à utilisation ultérieure. Utiliser inoculum viral induit une létalité plus élevé avant que les nouveau-nés atteignent 2-3 semaines d&#39;âge. Dans notre expérience, 500 UFP induit de mortalité dans tous les nouveau-nés de 5 à 7 jours après l&#39;injection. </li></ol> 2. Injection des nouveau-nés <ol><li> Quand les nouveau-nés (de 4 à 20 heures des souris âgées) sont disponibles, de manipuler la litière et les excréments de la cage avec des gants avant de manipuler avec soin les chiots pour éviter toute contamination par des odeurs &quot;étrangers&quot; qui mettrait l&#39;accent sur la mère et induire le rejet des chiots . </li><li> Effectuer une injection intrapéritonéale en utilisant une seringue à insuline (29 G) comme indiqué sur la figure 1A. Tenez le nouveau-né avec la peau du dos. Avec face ventrale, introduire l&#39;aiguille sous la patte avant et poussez-le doucement sous la peau pour atteindre la cavité péritonéale (un peu moins de l&#39;ombilic). Nous injectons actuellement 1% de bleu de méthylène dilué dans du DPBS et surveillons la survie de pratique la technique avant d&#39;effectuer les infections virales. Comme le bleu de méthylène est clairement visible pendant le processus d&#39;injection, nous vous recommandons d&#39;effectuer cette injection de «formation» d&#39;abord pour assurer la livraison adéquate de la suspension virale dans la cavité intrapéritonéale. </li><li> Éliminer les minuscules gouttes de sang qui peuvent surgir et placer le nouveau-né de retour dans la cage. </li></ol> 3. L&#39;imagerie in vivo <ol><li> Au jour 7, traiter les nouveau-nés avec la même prudence que mentionné précédemment. Injecter par voie intrapéritonéale d&#39;un mélange d&#39;anesthésiques (4 mg / ml de kétamine, 0,8 mg / ml de xylazine) et la luciférine (0,15 mg / g de poids corporel) dans 50 pi de chaque animal. Poids moyen des animaux est de 1-2 g et la dose d&#39;anesthésiques par animal: la kétamine 40 mg, xylazine 8 pg Attendez 12-15 min jusqu&#39;à ce que la luciférine atteint son maximum d&#39;émission. Cela doit être déterminé à l&#39;avance et dépend du fournisseur luciférine et le système d&#39;imagerie utilisée. </li><li> Alors que les chiots sont anesthetiZed, les marquer pour identification future et récolter un petit morceau de tissu qui peut ensuite être utilisé pour le génotypage avenir si les animaux mutants sont utilisés. </li><li> Placer les chiots dans le système de formation d&#39;image et d&#39;effectuer l&#39;acquisition de la lumière émise par l&#39;ensemble du corps. Sept jours après l&#39;infection, le virus s&#39;est reproduit en de nombreux exemplaires dans les organes cibles tels que le foie, les reins, les poumons et les glandes salivaires, par conséquent, la durée d&#39;exposition doit être court. Dans notre cas, nous procédons à l&#39;acquisition de 10 à 20 sec (figure 1B). La plate-forme dans la chambre de l&#39;acquisition de l&#39;appareil de formation d&#39;image doit être chauffé pour éviter un refroidissement excessif de la température corporelle de l&#39;animal anesthésié. En outre, il est utile d&#39;obtenir des images à faible résolution de plusieurs animaux dans une tour d&#39;acquisition et ensuite, passer à la plate-forme près de la lentille de la caméra afin de se concentrer sur une partie d&#39;un animal ou d&#39;un organe isolé après dissection. Le logiciel doit permettre des changements rapidesdes paramètres (temps d&#39;exposition, la distance échantillon / objectif, sensibilité), la quantification des régions définies d&#39;intérêt et l&#39;avenir exportation des images instantanées. </li><li> Pour acquérir signal lumineux de la tête seulement, couvrir le corps du nouveau-né couché latéralement avec un papier noir épais qui va masquer les photons émis au niveau des organes où la réplication virale élevée se produit (foie, poumons, glandes salivaires) et effectuer acquisition pendant 5 à 10 mn (figure 1C). Effectuer l&#39;acquisition de la face opposée de l&#39;animal dans les mêmes conditions. </li><li> Réintroduire les chiots dans la cage et placer une lampe chauffante sur le dessus pour éviter un refroidissement excessif des nouveau-nés anesthésiés. Surveiller régulièrement la récupération post-anesthésique. Avec la dose indiquée, l&#39;anesthésie dure actuellement 30 min. </li><li> Répétez la même procédure les jours de 9, 11 et 14. Les jours 11 et 14, de modifier la dose d&#39;anesthésiques (6 mg / ml de kétamine, 1,2 mg / ml de xylazine). </li></ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+control+murine+cytomegalovirus+replication+in+the+central+nervous+system+of+newborn+animals.">CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals.</a> J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).</li><li>Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+welfare+and+the+3Rs+in+European+biomedical+research.">Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).</li><li>Sacher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+types+in+cytomegalovirus+infection+in+vivo.">The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).</li><li>Lutarewych, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+murine+cytomegalovirus+in+a+continuous+bone+marrow-derived+stromal+cell+line+(M2-10B4).">Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4).</a> J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier compétition. Déclaration éthique Les animaux ont été maintenus dans des conditions exemptes d&#39;agents pathogènes dans l&#39;établissement de soins des animaux de l&#39;Institut d&#39;Immunologie et d&#39;Hématologie. Manipulation des souris et des procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la loi française sur la protection des animaux de laboratoire. La procédure a été approuvée par le service vétérinaire de la Préfecture du Bas-Rhin (France) sous le numéro d&#39;autorisation A-67-345.

En utilisant la technologie d&#39;imagerie in vivo pour surveiller MCMV-Luc diffusion chez la souris nouveau-nés, nous avons pu observer la propagation du virus dans le cerveau des animaux mutants, par opposition au type sauvage. En outre dissection de l&#39;animal et de l&#39;imagerie ex vivo du cerveau a confirmé la présence du virus de luminescence dans le système nerveux central. En outre, nous avons également procédé à l&#39;immunohistochimie (non représenté) sur coupes fines ce...

Cytomégalovirus humain (HCMV/HHV-5) est un membre de la famille β-herpesvirus. HCMV est très répandue, pathogène opportuniste qui est généralement acquise en début de vie comme une infection asymptomatique 1. Comme tous les virus de l&#39;herpès, HCMV persiste pendant toute la vie de l&#39;hôte dont le système immunitaire contrôle étroitement la réplication virale. Les épisodes de réactivation virale surviennent surtout chez les personnes immunodéprimées comme les patients transplantés recevant des médicaments pour prévenir le rejet du greffon 2. Chez les adultes, HCMV a également été liée à glioblastomes 3. En outre, HCMV est un agent pathogène important pour les nouveau-nés avec une immunité immature 4-6. La primo-infection dans le développement du fœtus ou nouveau-né peut avoir de graves conséquences. HCMV infection est la cause infectieuse la plus fréquente des malformations congénitales et des troubles de l&#39;enfance dans les pays développés. On estime que l&#39;incidence de l&#39;infection néonatale HCMV affecte 0,5-1% of toutes les naissances vivantes dont 5-10% vont souffrir de symptômes sévères tels que la microcéphalie ou hypoplasie cérébelleuse. En outre, 10% des nourrissons infectés par une infection virale subclinique se développer plus tard des séquelles entraînant un retard mental, perte, défauts visuels ou de la saisie et de l&#39;épilepsie 7,8 auditive. Contrairement aux autres herpèsvirus humains tels que l&#39;herpès simplex 1 (HSV-1/HHV-1) qui peut être inoculé à des souris par différentes voies d&#39;injection 9, la réplication du cytomégalovirus est spécifique à l&#39;espèce. Cette fonctionnalité a gravement entravé les enquêtes de HCMV pathogenèse qui sont effectuées dans différents modèles animaux (souris, rat, cochon Guinée, le singe rhésus) et leurs CMV spécifiques de l&#39;hôte d&#39;origine respectifs. Tous les VMC présentent des similitudes importantes dans la taille du génome et de l&#39;organisation, le tropisme tissulaire et la régulation de l&#39;expression des gènes. Ils induisent également des pathologies similaires dans leur hôte respectif. Malgré la diversité génomique êtreentre HCMV et souris cytomégalovirus (MCMV) (50% des ORF présents dans le virus humain sont identifiés dans le CMV murin), le modèle de la souris s&#39;est récemment révélé être avantageux, surtout parce que les souches mutantes peuvent être testés pour leur capacité à contrôler virale la réplication in vivo. Cela a conduit à un crible génétique qui a permis d&#39;estimer le nombre de gènes de souris exprimés au stade adulte qui composent le &quot;résistome&quot; à ce virus 10. Au total, cela indique que les souris infectées par MCMV représentent un modèle intéressant pour l&#39;étude des interactions hôte-virus chez les adultes. L&#39;exploration de l&#39;infection congénitale à CMV est plus complexe parce que les différences dans l&#39;organisation de la couche placentaire entre l&#39;homme et la souris nuisent à la transmission mère-fœtus de l&#39;infection virale chez la souris. Récemment, l&#39;injection directe de MCMV dans le placenta à jour 12.5 de gestation a permis infection du cerveau de souris nouveau-nés qui ont conduit à la dépréciation audience 11. Cependant, la plupart investigations utilisent désormais injection intrapéritonéale de 4-20 hr-nés âgés de fournir dissémination virale systémique pouvant conduire à une infection hématogène du cerveau, un modèle qui est plus pertinent que celui d&#39;une injection intracrânienne. Ce protocole a fourni d&#39;importantes informations sur la pathogenèse CMV et plus particulièrement, il a été démontré que l&#39;infection par MCMV de nouveau-nés résultats de la réplication virale dans les cellules neuronales et gliales situées dans les foyers inflammatoires qui sont infiltrés par des cellules mononucléaires comme les macrophages 12. Ce rapport décrit également la morphogénèse altérée du cervelet accompagné d&#39;une diminution granulaire prolifération des neurones et de la migration et de l&#39;induction de plusieurs gènes d&#39;interféron-stimulés. Le rôle essentiel des cellules T CD8 + pour le contrôle de MCMV dans le système nerveux central a également été rapporté par le même groupe 13. Un aspect important à considérer lors de l&#39;analyse de l&#39;effet pathologique d&#39;un microbe est la dynamique de l&#39;infecterd&#39;ions. Dans le cas de MCMV, il est particulièrement important d&#39;explorer et de quantifier la progression de la diffusion du virus dans le cerveau en développement afin de comprendre et d&#39;anticiper l&#39;ampleur des futurs blessures neurobiologiques. Traditionnellement, la quantification de la progression d&#39;une infection nécessite le sacrifice régulier des animaux infectés de titrer l&#39;agent pathogène dans les tissus, tels que le cerveau, qui sont autrement inaccessibles. Ce type de protocole est maintenant contestée par l&#39;amélioration nécessaire du bien-être animal et les 3R (Réduire, Refine, Replace) principes 14. L&#39;utilisation des technologies d&#39;imagerie in vivo peut permettre une réduction drastique du nombre d&#39;animaux qui sont nécessaires dans des expériences d&#39;infection in vivo. Ici, nous présentons et décrivons une analyse temps-courant de la diffusion du virus dans le cerveau lors de intrapéritonéale MCMV-Luc injection pour les nouveau-nés de souris. En utilisant les mêmes animaux, nous avons suivi et surveillé in vivo les sites d&#39;intense viréplication ral au cours d&#39;une période de 2 semaines.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3523A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319112</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4897</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CentraVet</td>
			<td>Ket 201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine/Vetranal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>P0436500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>gentamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>carboxymethylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4888</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3886</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IVIS 50</td>
			<td>Caliper/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of in vivo imaging to monitor the progression of experimental mouse cytomegalovirus infection in neonates

Cytomégalovirus humain (HCMV ou HHV-5) est un agent pathogène mortelle, chez les personnes immunodéprimées. Lors de l&#39;infection congénitale ou néonatale, le virus peut infecter et de se répliquer dans le développement du cerveau, ce qui peut induire des lésions neurologiques graves, y compris la surdité et le retard mental. En dépit de la gravité potentielle des symptômes, les options thérapeutiques sont limitées par l&#39;absence d&#39;un vaccin et l&#39;absence d&#39;un traitement antiviral spécifique. En outre, une description précise des événements moléculaires qui se produisent au cours de l&#39;infection du système nerveux central (SNC) fait encore défaut depuis observations proviennent principalement de l&#39;autopsie des enfants infectés. Plusieurs modèles animaux, comme les macaques rhésus CMV, ont été mis au point et fourni des indications importantes sur la pathogenèse CMV dans le SNC. Cependant, en dépit de sa proximité avec l&#39;évolution des humains, ce modèle a été limitée par la procédure d&#39;inoculation intracrânienne utilisé pour infecter les animaux et les inconvénientsistently induire une infection du système nerveux central. En outre, les considérations éthiques ont favorisé le développement de modèles alternatifs, parmi lesquels l&#39;infection néonatale de souriceaux nouveau-nés par le cytomégalovirus de la souris (MCMV) a récemment permis des avancées significatives. Par exemple, il a été signalé que l&#39;injection intrapéritonéale de MCMV à Balb / c nouveau-nés conduit à l&#39;infection de neurones et les cellules gliales dans des zones spécifiques du cerveau. Ces résultats suggèrent que l&#39;inoculation expérimentale de souris pourrait récapituler les déficits induits par l&#39;infection à CMV chez les enfants. Néanmoins, une analyse dynamique de l&#39;infection par MCMV des nouveau-nés est difficile à réaliser parce que la méthode classique nécessite le sacrifice d&#39;un nombre important d&#39;animaux à différents points dans le temps d&#39;analyser la charge virale et / ou les paramètres liés au système immunitaire. Pour contourner cet obstacle et permettre futures enquêtes sur les animaux mutants rares, nous avons appliqué la technologie d&#39;imagerie in vivo pour effectuer une analyse temps-courant de l&#39;viraL diffusion dans le cerveau lors de l&#39;injection périphérique d&#39;une MCMV recombinant exprimant la luciférase de C57BL / 6 nouveau-nés.

Une expérience représentative est illustrée à la figure 1. Lors de l&#39;injection intrapéritonéale de 50 PFU de MCMV-Luc (groupe A montre une injection similaire menée au bleu de méthylène pour visualiser la voie sous-cutanée de l&#39;aiguille), les nouveau-nés ont été anesthésiés et reçues simultanément 0,3 mg du substrat luciférase (Luciferin, Caliper). Quinze minutes plus tard, les animaux ont été placés face ventrale dans la chambre de l&#39;acquisition de la SIIV 50 (système ...

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Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Le cytomégalovirus (HCMV) infection humaine des nouveau-nés représentent une cause importante de déficience mentale, mais les événements moléculaires conduisant à la pathogenèse induite par le virus sont encore mal compris. Pour étudier la dynamique de l&#39;infection du cerveau, nous avons adapté animal entier<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie d&#39;effectuer une analyse temps-cours des nouveau-nés infectés par un virus recombinant luciférase.

Utilisation d&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie à suivre la progression de cytomégalovirus souris une infection expérimentale chez les prématurés

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

14.8K vues.  Université de Strasbourg. Le cytomégalovirus (HCMV) infection humaine des nouveau-nés représentent une cause importante de déficience mentale, mais les événements moléculaires conduisant à la pathogenèse induite par le virus sont encore mal compris. Pour étudier la dynamique de l'infection du cerveau, nous avons adapté animal entier In vivo Imagerie d'effectuer une analyse temps-cours des nouveau-nés infectés par un virus recombinant luciférase.