نود أن نشكر توماس Lecuit (SQH-Utrophin :: خط GFP)، ومركز بلومنجتون المالية، والدراسات هجين البنك التنموي للمواد. نشكر كذلك جميع أعضاء مختبر بوق للمناقشات وانتقادات مفيدة للمخطوطة. بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الأموال بدء من قسم التشريح وبيولوجيا الخلية MCB-1158527، وجامعة ولاية ايوا أيد هذا العمل. المعاهد الوطنية للصحة دكتوراه مسبقا تدريب المنحة الدوائية العلوم T32GM067795 بدعم AJS. وقدم دعم تخزين البيانات عن طريق تكنولوجيا المعلومات والاتصالات، والتي يتم تمويلها من خلال CTSA بدعم من المركز الوطني لبحوث الموارد والمركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم والمعاهد الوطنية للصحة، من خلال منحة UL1RR024979.

1. إعداد ذبابة الفاكهة الى المرحلة قبل عزل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل عجينة الخميرة الرطب من خلال الجمع بين 50 غرام من الخميرة الجافة النشطة مع 90 مل من الماء المقطر. تخلط مع ملعقة من الجمع بين. السماح للخليط الوقوف لمدة 30 دقيقة قبل ~ تقييم الاتساق. يجب أن يكون التناسق فقط سميكة بما فيه الكفاية على الانضمام إلى جانب قنينة يطير ولكن ليس الجري الجانب. لتحقيق الاتساق المطلوب قد يكون من الضروري أن تضيف ما يصل الى 10 مل من الماء إضافية أو كمية صغيرة من الخميرة الجافة. تخزين في حاوية مغطاة في 4 درجات مئوية. الخميرة تخزين يمكن استخدامها ل~ 1-2 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع &lt;24 ساعة الذباب البالغين من العمر (الذكور والإناث) من المورثات المطلوبة ووضعها في قارورة مع الطعام ذبابة بالإضافة إلى عجينة الخميرة الرطب طخت على الجانب من القارورة. ودرجة الحرارة التي يتم الاحتفاظ الذباب تختلف تبعا للتجربة. للتجارب روتينية، تتم المحافظة على الذباب في درجة حرارة الغرفة. في حين أن التجارب التي الجين هويجري بإفراط (overexpressed) باستخدام نظام UAS/GAL4 15 مايو تتطلب الحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية أو أعلى، حسب الاقتضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توفير الذباب مع مسحة من معجون الخميرة الطازجة يوميا لمدة 2 ايام. ملاحظة: كما يتم تنظيم التنمية جريب بإحكام من قبل الحالة التغذوية للالطاير الإناث، فمن الضروري توفير الطاير مع الخميرة الغنية بالمغذيات عجينة لمدة 36 ساعة على الأقل قبل تشريح. </li></ol> 2. عزل أقام ذبابة الفاكهة مسام أواخر منتصف إلى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لوسائل الإعلام أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة (~ 30 دقيقة). إذا كان بصيلات نظموا ذاهبون لاستخدامها في المختبر لفحوصات التنمية، طازجة إعداد IVEM وسائل الإعلام (وسائل الإعلام غريس الحشرات، و 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني، و 1X البنسلين / الستربتوميسين). إذا كان بصيلات نظموا ذاهبون لاستخدامها في مرنا أو البروتين العزلة استخدام الحشرات إما نعمة أو IVEM سائل الإعلام. هام: درجة الحرارة وسائل الإعلام أمر بالغ الأهمية. إذا كان الإعلام هو الباردة على انها ستغيركل من الأكتين وcytoskeletons أنيبيب والتنمية كتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذباب في القارورة yeasted عن طريق حقن ثاني أكسيد الكربون غاز 2 وتضع الأنثى 3-5 الذباب على وسادة تحت ذبابة CO 2. هام: لا تترك الإناث أكثر مما يمكن تشريح في فترة زمنية 10 دقيقة على لوحة الطاير ومدد التعرض لأول أكسيد الكربون يمكن أن يسبب العقم 2 والموت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء بئر واحدة من لوحة 9 بقعة مع وسائل الإعلام ووضعه على رأس السطح الداكن (قطعة من زجاج شبكي أسود يعمل بشكل جيد). تركز نطاق تشريح على الجزء السفلي من البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط دومون # 5 التقاط أنثى واحدة بيد واحدة (وهذا هو الأفضل القيام باستخدام يدك المهيمنة). غالبا ما يكون أسهل لالتقاط الإناث على الأجنحة والساقين والصدر أو البطن للانتقال. يغرق الأنثى في وسائل الإعلام مليئة جيدا. ضبط بؤرة المجهر عند الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الزوج الثاني من ملقط عقد في اليد غير السائد، والاستيلاء على الإناث في نهاية الأمامي من البطنبحيث يتم وضع نهاية الخلفي نحو يدك المهيمنة (الشكل 2A). تأكد للحفاظ على الطاير المغمورة في وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع يدك المهيمنة، استخدم ملقط للاستيلاء على بشرة في الجزء 2 المصطبغة معظم الخلفي ومزق بعيدا عن بقية البطن (أرقام 2B-C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط في اليد المهيمنة، الضغط بلطف نهاية الأمامي من البطن حتى المبيضين الظهور (أرقام 2D-E). إذا لزم الأمر، ووضع ملقط بين اثنين من المبيضين وتسحبهم من الذبيحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما نقل المبيضين لبئر جديد مع وسائل الإعلام الجديدة (الشكل 2F) أو إزالة الذبيحة إلى Kimwipe أو منشفة ورقية. هذا مهم بشكل خاص إذا كان يتم عزل بصيلات من أجل التنمية في المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر حتى تم عزلها 3-5 أزواج من المبيضين. ملاحظة: ويتكون كل مبيض ~ 16 ovarioles أو سلاسل من النضج بصيلات بالتتابع. كل ovarioleويرد ضمن غمد العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملازم دبوس والإبر زودت معهم، وسحب بلطف بعيدا المبيض عن طريق تشغيل الإبر بين ovarioles (الشكل 2G). وهذا في بعض الأحيان الإفراج عن بصيلات الفردية كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب ovarioles الفردية والمراحل المورفولوجية تمييزها بسهولة التنمية جريب يكون الآن مرئية (الشكل 2G، مازحت بصرف النظر المبيض). الرجوع إلى الأرقام 1 و 2H للاختلافات المورفولوجية التي يمكن استخدامها للتمييز بين المراحل المختلفة. لعزل بصيلات التي تقع ضمن ovarioles سليمة والواردة في غمد العضلات لا يزال، استخدام إبرة لخفض عبر ovariole في الجزء الأمامي من بصيلات السابقة وفي الخلفي من جريب التالية المسام من الفائدة على الفور. وهذا كسر غمد العضلات ويمكن الآن بصيلات الاهتمام بعيدا أن تقطع بعيدا عن بصيلات المجاورة دون الإضرار بها. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما يتم فصل مراحل الفردية، نقل بصيلات من الفائدة، وذلك باستخدام ماصة الزجاج، وإلى بئر جديدة مع وسائل الإعلام الجديدة. هذا مهم خصوصا عندما عزل بصيلات من أجل التنمية في المختبر. ملاحظة: من المهم للضغط على لمبة ماصة قبل دخول وسائل الاعلام لمنع فقاعات الهواء من إعادة توزيع بصيلات الاهتمام في جميع أنحاء البئر. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان بصيلات يتم التمسك ماصة الزجاج، ويمكن precoated ماصة مع 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA) من قبل pipetting الحل BSA صعودا وهبوطا عدة مرات والشطف مع وسائل الاعلام تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم عزل ما يكفي من بصيلات، والمضي قدما مع التجارب اللاحقة. </li></ol> 3. في المختبر تطوير S10B مسام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل بصيلات S10B باستخدام بروتوكول مرحلة العزلة (الخطوة 2) في وسائل الإعلام IVEM. تأكد من أن يتم نقل بصيلات بسرعة بعيدا عن الحطام. كما سوف تستمر هذه بصيلات إلى أن تنضج، فمن IMPOrtant أن S10Bs يتم جمعها لمدة 30-60 دقيقة ثم توضع في وسائل الإعلام نضوج في الاختيار. ملاحظة: S10B بحاجة إلى أن تميز بعناية من بصيلات S10A (الشكل 1C مقارنة 1B)، وسوف بصيلات S10A لا تنضج في وسائل الإعلام الثقافة IVEM. في كل S10A وبصيلات S10B، ويتألف نصف طول خلايا الممرضة، والنصف الآخر هو البويضة، ولكن في S10B طول جريب هو مساوية لبصيلات S14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الزجاج، ونقل 30 ~ بصيلات S10B في بئر من 24 لوحة جيدا زراعة الأنسجة. ملاحظة: تأكد للتحقق من أن كل من بصيلات نقله هي S10B ولم تنضج لS11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 ميكرولتر من وسائل الإعلام نضوج لكل بئر، أي وسائل الإعلام بالإضافة إلى IVEM الكواشف الدوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الزجاج انسحبت *، وإزالة وسائل الإعلام بقدر من البئر (الخطوة 3.2) ممكن، وبسرعة إضافة وسائط نضوج في الاختيار. ملاحظة: من الضروري استخدام الزجاج سحبت نقطةETTE كما بصيلات نظموا يمكن اتخاذها بسهولة مع أي الماصات الزجاج أو نصائح ماصة مع Pipetman. * لجعل ماصات سحبت: 1) تسخين جزء رقيقة طويلة، الماصات الزجاج في لهب الموقد بنسن فقط حتى يبدأ الزجاج لتخفيف؛ 2) التحرك فورا ماصة للخروج من اللهب وسحب أفقيا لرسم ماصة في أنبوب فاينر، 3) كسر لتوليد نقطة غرامة. تنبيه: استخدام حماية العين كأجزاء من الزجاج قد يطير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،4 عن العديد من الآبار كما يتطلب التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح المسام لتطوير ل&gt; 10 ساعة لتصبح النتيجة تقدم التنموية تحت نطاق تشريح. ملاحظة: عادة ما يتم تسجيل التجارب في اليوم التالي لإتاحة الوقت الكافي للبصيلات لتطوير. S10B هو ~ 5 ساعة، S11 هو ~ 30 دقيقة، S12 هو ~ 2 ساعة، وS13 هو ~ 1 ساعة في مدة عند 25 درجة مئوية 1 والتنمية في درجة حرارة الغرفة وسوف يستغرق وقتا أطول قليلا. تجارب مماثلة لتلك التي وصفها لبصيلات S10B يمكن أن يكونتنفيذها باستخدام بصيلات S11-S13. </li></ol> 4. عزل مرحلة للتصوير لايف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل بصيلات مرحلة متأخرة (S10B-14) يعبر عن علامة فلوري الاختيار باستخدام بروتوكول مرحلة العزلة (الخطوة 2) في وسائل الإعلام IVEM، بسرعة التحرك بصيلات بعيدا عن الحطام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بصيلات الاهتمام في وسائل الإعلام الجديدة ومن ثم نقل بواسطة الزجاج ماصة لوحة بيتري أسفل ساترة. الحرص على إضافة وسائل الإعلام بحيث يصل فقاعات في منطقة أسفل ساترة ولكن لا تمتد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة أطول الأفلام مرور الزمن، فمن الضروري في بعض الأحيان للحفاظ على الرطوبة داخل لوحة بيتري بإضافة طوى Kimwipe، مبلل بالماء، إلى حافة داخل لوحة بيتري. وضع غطاء على القمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصورة على مجهر مقلوب. سوف القرار مفصلة تتطلب متحد البؤر المجهري. فمن الضروري لتحقيق التوازن بين وتيرة التصوير، وقوة الإضاءة، وطول التصوير، وهذا سوف تحتاج إلى أن يعمل بشكل مستقل خارج عن كل لترأداة abeling والعملية التنموية. </li></ol> 5. عزل مرحلة لإعداد مرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل بصيلات المرحلة الفردية باستخدام بروتوكول مرحلة العزلة (الخطوة 2) مع وسائل الإعلام إما نعمة أو IVEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الزجاج، ونقل مراحل الفرد من الاهتمام إلى آبار جديدة مع وسائل الإعلام، بل هو ممكن لجمع مراحل متعددة في آن واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء مرات جمع أقل من 1 ساعة. نقل بصيلات، وذلك باستخدام ماصة الزجاج، وإلى 1.5 مل أنابيب microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لفترة وجيزة في الأنبوب-ميكروسنتريفوج مصغرة لتكوير كل من المسام. باستخدام ماصة الزجاج سحبت (انظر الخطوة 3.4) إزالة بعناية كل من وسائل الإعلام. ملاحظة: في حالة استخدام حجم ميكروسنتريفوج كامل، وتدور باستمرار بصيلات على سرعة منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من Trizol وتطحن باليد ل~ 20 ثانية باستخدام مدقة البلاستيك. تدور باستمرار في كامل السرعة في microcentrifuge والتحرك Trizol إلى 1.5 مل microfuge أنبوب جديد والحرص على عدم تعكير صفو أي د مكعباتebris. المحل في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5،1-5،5 حتى تم الحصول على ما يكفي من بصيلات للتجربة. بشكل روتيني، ~ 75 S10B، ~ 75 S12، S14 و~ 100 ~ بصيلات تسفر عن 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد العينات على الجليد. الجمع بين العينات، حسب الاقتضاء، في واحدة microfuge أنبوب وتبرزي حجم Trizol تصل إلى 800 ميكرولتر. المضي قدما في عزل الحمض النووي الريبي وفقا لتوجيهات من قبل الشركة المصنعة. هام: تذكر أن الدناز علاج الحمض النووي الريبي معزولة مع ريبونوكلياز الدناز الحرة. </li></ol> 6. عزل لمرحلة التنشيف الغربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن كتلة الحرارة إلى 100 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل بصيلات المرحلة الفردية باستخدام بروتوكول مرحلة العزلة (الخطوة 2) مع وسائل الإعلام إما نعمة أو IVEM. ملاحظة: من الضروري لتحديد تجريبيا كم من مرحلة جريب خاصة وهناك حاجة لمراقبة كل بروتين معين. وأعرب عن البروتينات عالية 1-3 بصيلات S10B / جيد بما فيه الكفاية لرؤية إشارة قوية على لطخة غربية. ومع ذلك، فمن المهم لجعلعينة تمثيلية، على أن بصيلات من الإناث متعددة. وبالتالي، وعادة ما جمعت 15-20 بصيلات مرحلة معينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بصيلات، وذلك باستخدام ماصة الزجاج، إلى أنبوب microfuge 1.5 مل. تدور لفترة وجيزة في ميكروسنتريفوج-مصغرة لتكوير بصيلات (انظر الخطوة 5.4). إزالة بعناية جميع وسائل الإعلام باستخدام ماصة الزجاج سحبت (انظر الخطوة 3.4) وإضافة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X و 50 ميكرولتر من العازلة 2X Laemmli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن باليد ل~ 20 ثانية مع مدقة البلاستيك. ملاحظة: المطاحن البلاستيك يمكن إعادة استخدامها لطحن عينات الغربية عن طريق الغسيل والتعقيم لهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي العينات لمدة 10 دقيقة في كتلة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البرد لفترة وجيزة على الجليد وتدور في كامل السرعة لمدة 15 ثانية في microcentrifuge. إما تحميل على الفور على هلام SDS-PAGE أو تخزينها في -20 درجة مئوية. ملاحظة: إذا تم تخزين العينات، وتذكر أن reboil العينات قبل تحميل على هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تحليل لطخة غربية التالية البروتوكولات القياسية. </li></ol>

<ol>
	<li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).</li><li>Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filament+cables+in+Drosophila+nurse+cells+are+composed+of+modules+that+slide+passively+past+one+another+during+dumping.">Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping.</a> J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).</li><li>Horne-Badovinac, S., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transit:+epithelial+morphogenesis+in+the+Drosophila+egg+chamber.">Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber.</a> Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).</li><li>McCall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggs+over+easy:+cell+death+in+the+Drosophila+ovary.">Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary.</a> Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).</li><li>Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+shell+game:+patterning+genes+and+morphological+change.">The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change.</a> Trends Genet. 21, 346-355 (2005).</li><li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+II.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49, 411-424 (2006).</li><li>Tootle, T. L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pxt:+a+cyclooxygenase-like+facilitator+of+follicle+maturation.">Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation.</a> Development. 135, 839-847 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Fascin+is+a+novel+downstream+target+of+prostaglandin+signaling+during+actin+remodeling.">Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Bianco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+modes+of+guidance+signalling+during+collective+migration+of+border+cells.">Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells.</a> Nature. 448, 362-365 (2007).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kelso, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flytrap,+a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster.">Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+eggshell+production:+identification+of+new+genes+and+coordination+by+Pxt.">Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt.</a> PLoS. One. 6, e19943 (2011).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li></ol>

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

وتتكون بصيلات ذبابة الفاكهة فقط عدد قليل من أنواع الخلايا، مما يجعلها مثالية لكلا المورفولوجي والتحليلات الجزيئية. وعلاوة على ذلك، ونظرا لهيكل المبيض، فمن السهل نسبيا الحصول على أعداد كبيرة من مراحل محددة للتنمية جريب مع نطاق تشريح المشتركة والحد الأدنى من ال?...

ويتكون كل من المبيض ذبابة الفاكهة ~ 16 ovarioles، أو سلاسل من بالتتابع تستحق غرف البيض أو بصيلات. ويتكون كل جريب من بويضة واحدة، 15 خط الجرثومية المستمدة ممرضة أو دعم الخلايا، والخلايا الجسدية ~ 650 تسمى خلايا بصيلات (الشكل 1A). ينقسم ذبابة الفاكهة oogenesis إلى 14 مراحل محددة شكليا التنمية 1. ويلاحظ كل مرحلة من مراحل التنمية جريب عدة مرات ضمن ذبابة واحدة، مما يجعل من السهل نسبيا لعزل عدد كبير من بصيلات مرحلة محددة. في منتصف إلى أواخر مراحل oogenesis (مراحل 10B-14) بشكل خاص مناسبة تماما للمرحلة العزلة (الشكل 1). في المرحلة 10B (S10B)، هو ممدود بصيلات بالكامل (أي طوله يساوي ذلك من المرحلة 14 (S14) جريب، انظر الشكل 1 والشكل 2H) ويتكون نصف طول المسام من خلايا ممرضةفي حين أن النصف الآخر هو البويضة (الشكل 1C). في هذه المرحلة الخضوع لخلايا ممرضة مثيرة الأكتين إعادة عرض، وتعزيز الأكتين القشرية وتوليد حزم متوازية من خيوط الأكتين 2. في الوقت نفسه، يبلغ عدد سكانها خلايا بصيلات، ووصف الخلايا الجاذبية، تهاجر بين الخلايا ممرضة والبويضة، ومجموعتين من الخلايا الظهرية جريب تصبح محددة للخضوع الهجرة لتشكيل الزوائد الظهرية والأجهزة التنفسية أنبوبي لالجنين 3 . الخلايا ممرضة ثم العقد (S11)، والضغط محتوياتها حشوية إلى البويضة في عملية تسمى خلية ممرضة الإغراق، والتي تنص على البويضة مع العوامل اللازمة لذلك لاستكمال مرحلة التطور الجنيني (1D الشكل). الخلايا ممرضة ثم الخضوع لموت الخلايا (S12-S13) 4، وتفرز خلايا بصيلات ونمط قشر البيض 5 (أرقام 1E-G). وهكذا، فإن نهاية oogenesis غنية مع إنمائية هامةعمليات التخلق د. بصيلات معزولة منتصف إلى أواخر مرحلة (S10B-S14) يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من الأغراض، بما في ذلك تحليل الجزيئي. على سبيل المثال، مرنا من بصيلات نظموا يمكن أن تكون معزولة عن RT-PCR، ميكروأري، أو تحليلات الحمض النووي الريبي وما يليها. هذا يسمح احد للنظر في التعبير الجيني داخل نافذة التنموية قصيرة، مع عدد قليل من أنواع الخلايا الحالية، وتحديد كيفية تغير التعبير الجيني عن طريق الاضطرابات إما دوائية أو وراثية. ويمكن أيضا أن تستخدم مرحلة العزلة للنظر في البروتينات بواسطة النشاف الغربية. مثل هذا التحليل مهم لأنه يسمح احد لقياس مستوى البروتين التعبير في البرية من نوع مقابل المسوخ في مراحل معينة. في حين يمكن للمرء أن استخدام مناعي يحلل لتحقيق نتائج مماثلة، الكمي لمضان هو أقل قوة بسبب المتطلبات الصارمة أن كل بكسل تكون ضمن مجموعة خطية من الكشف 6. بالإضافة إلى ذلك، قد يوفر تحليل لطخة غربية معلومات أخرى، مثل هذاو إذا تم تعديل البروتين posttranslationally أو ما يعبر عنه من الإسوي لصق محددة. ويمكن أيضا أن تستخدم مراحل معزولة لمزيد من تنقية البروتين، بما في ذلك تجزئة التحت خلوية أو coimmunoprecipitation. ويمكن أيضا مرحلة محددة جريب العزلة استخدامها لفي المختبر فحوصات التنمية 7 و 8 الحية التصوير. ستواصل معزولة بصيلات S10B-S13 S14 لتطوير لفي وسائل الإعلام ثقافة بسيطة (انظر أدناه). من المهم أن نلاحظ أن بصيلات S10A لن تقدم من خلال خلية ممرضة الإغراق باستخدام الظروف الثقافة مناقشتها في هذه المخطوطة. وقد استخدمنا S10B في المختبر فحوصات التنمية لتحديد دور البروستاجلاندين، سواء دوائيا وراثيا، في تنظيم الأكتين إعادة عرض باستخدام خلية ممرضة الإغراق والتنمية للقراءة عموميات 7،9. وبالمثل، فإن مراحل لاحقة من التطور ويمكن أيضا أن تكون معزولة لتحديد آثار العلاجات الدوائية أو رجل الوراثيةipulations على عمليات معينة مثل الهجرة الجاذبية الخلية، الظهرية أطرافهم الهجرة / تشكيل 10، وموت الخلايا ممرضة. مثل هذه المقايسات يمكن استخدامها لأداء شاشات التفاعل المهيمنة أو المقايسات، على سبيل المثال، في حين تغاير الزيجوت لطفرات في PXT أو fascin وحده لن يكون له تأثير على S10B التنمية في المختبر، وبصيلات من heterozygotes المزدوجة خلية ممرضة المعرض إلقاء العيوب وكتلة في التنمية 9. بالإضافة إلى ذلك، لأن S10B-13 يمكن أن تتطور في الثقافة، وجميع العمليات التي تحدث خلال هذه الفترة يمكن ملاحظة من قبل الحية التصوير. هذا التصوير لا يمكن أن يؤديها مجرد استخدام الضوء المرسل (إذا كان أحد لا يهتم إلا تغييرات في التشكل الإجمالي) أو مع المجهري متحد البؤر باستخدام الذباب المعدلة وراثيا معربا عن تحقيقات الفلورسنت أو بصيلات ملطخة الأصباغ التصوير الحي. يتم استخدام التصوير الحي للمضي قدما إلى حد كبير فهمنا من العمليات التنموية. في الواقع، تخيل العيشز من بصيلات مرحلة متأخرة توسعت المعرفة الهجرة الظهرية أطرافهم، مثالا tubulogenesis 10. ونحن نتوقع أن تصوير حي لعمليات مرحلة متأخرة إضافية، بما في ذلك ديناميات الأكتين خلال خلية ممرضة الإغراق، وتقديم رؤى جديدة في هذه الأحداث التنموية. من المهم أن نلاحظ أنه في حين سوف S10A والمراحل الأولى من التنمية جريب لا تزال تتطور لتصبح S14 في الثقافة، ويعيش التصوير من الأحداث التي وقعت خلال تلك المراحل للتنمية هو ممكن باستخدام ظروف ثقافة بديلة 11-14 (انظر مناقشة لمزيد من المعلومات). هنا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لعزل بصيلات مرحلة متأخرة لأي تطوير في المختبر والعيش التصوير، أو التحليلات الجزيئية (مرنا والبروتين العزلة).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

ذبابة الفاكهة oogenesis أو تطوير جريب وقد استخدم على نطاق واسع للمضي قدما في فهم العمليات البيولوجية التنموية والخلايا المعقدة. وتصف هذه الورقة أساليب كيفية عزل بصيلات مرحلة منتصف إلى أواخر (المرحلة 10B-14) والاستفادة منها لتقديم رؤى جديدة في الأحداث الجزيئية والمورفولوجية التي تحدث خلال نوافذ ضيقة من الوقت التنموية. بصيلات معزولة يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من أساليب فنية تجريبية، بما في ذلك في المختبر فحوصات التنمية، التصوير الحية، وتحليل مرنا التعبير وتحليل لطخة غربية البروتينات. سوف بصيلات في المرحلة 10B (S10B) أو في وقت لاحق استكمال التطوير في الثقافة، وهذا يسمح لأحد أن الجمع بين اضطرابات وراثية أو دوائية مع تطوير في المختبر لتحديد الآثار المترتبة على مثل هذه التلاعبات على العمليات التي تحدث خلال فترات محددة من التنمية. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذه المسام تطوير في الثقافة، هي مناسبة بشكل مثالي لأنها دراسات التصوير الحي، والتي غالبا ما تكشف عن آليات جديدة التي تتوسط الأحداث المورفولوجية. ويمكن أيضا أن تستخدم بصيلات معزولة عن التحليلات الجزيئية. على سبيل المثال، والتغيرات في التعبير الجيني التي تنجم عن الاضطرابات الوراثية يمكن تعريف للنوافذ التنموية المحددة. بالإضافة إلى ذلك، ومستوى البروتين، والاستقرار، و / أو تعديل ما بعد النقل الدولة خلال مرحلة معينة من التنمية جريب يمكن فحص من خلال تحليل لطخة غربية. وبالتالي، والعزلة مرحلة محددة من بصيلات ذبابة الفاكهة يوفر مصدرا غنيا للمعلومات في عمليات الحفاظ على نطاق واسع للتنمية والتشكل.

عندما عزل مراحل معينة من التنمية جريب ذبابة الفاكهة فمن الضروري أن يكون قادرا على التمييز بدقة المراحل المورفولوجية المختلفة. وهذا هو التحدي نوعا ما لS10A وS10B، مثل خلايا البويضة وممرضة لكل يستغرق نصف طول المسام في هذه المراحل (الشكل 1B مقارنة 1C). ?...

Watch this Scientific Journal Video about The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation at JoVE.com

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

العزلة مرحلة محددة من منتصف إلى أواخر بصيلات ذبابة الفاكهة مفيد لمجموعة متنوعة من الأغراض. مثل بصيلات تطوير في الثقافة، والذي يسمح للتلاعب الجيني و / أو الدوائية أن تقترن في المختبر فحوصات التنمية والتصوير الحي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام بصيلات للدراسات الجزيئية، مثل عزل مرنا والبروتين.

الأداة المساعدة لمرحلة محددة في منتصف إلى أواخر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; جريب عزل

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

the-utility-stage-specific-mid-to-late-drosophila-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K Views.  University of Iowa Carver College of Medicine.  العزلة مرحلة محددة من منتصف إلى أواخر بصيلات ذبابة الفاكهة مفيد لمجموعة متنوعة من الأغراض. مثل بصيلات تطوير في الثقافة، والذي يسمح للتلاعب الجيني و / أو الدوائية أن تقترن في المختبر فحوصات التنمية والتصوير الحي. بالإضافة إلى ذلك،...

Video: The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

استهدفت التعبير عن GFP في بصيلات الشعر عن طريق خارج الجسم تنبيغ الفيروسية

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

بطاقات المواد الفلورية ذبابة الفاكهة</emهياكل القلب>

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

عزل القائم على تقارب من معلم النواة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة لتحليل التعبير الجيني

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

عزل الأطفال حديثي الولادة خارج الكبد Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...