The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

بيان الأخلاق: الإجراءات التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول تنطوي يعمل حصرا مع ذبابة الفاكهة السوداء البطن ولا تخضع لقوانين الرفق بالحيوان في ألمانيا. 1. إعداد وسائل الإعلام، أدوات، والذباب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعديل متاحة تجاريا المجفف المتوسطة النمو M3 دون بيكربونات البوتاسيوم 17. تنبيه: مهيج للعين والجلد. تكملة المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني، 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. استخدام مصل بقري جنيني اختبار الحشرات ثقافة المعطل الحرارة وحصول على أفضل النتائج. تصفية المتوسطة كاملة (المشار إليها فيما بعد باسم المتوسطة) خلال 0.2 ميكرون وحدة تصفية زجاجة أعلى وتخزينها في aliquots في -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، مرشح (فلتر 0.2 ميكرومتر حقنة غيض) المتوسط ​​مرة أخرى لإزالة الرواسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول الأسهم المانع للفحوصات الدوائية. Dissolلقد المواد الكيميائية في المذيب وتخزين المناسب في مأخوذة. على سبيل المثال، إعداد محلول المخزون من 28.69 ملي حمض اناكارديتش (تنبيه: مهيج للعين والجلد) في ديمثيلكبريتيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أدوات لتعطيل الخصيتين العذراء تشريح تشريح والخراجات واحدة. استخدام اثنين من الإبر الحادة والشديدة، بدلا من زوج من ملقط. القوة الشعرية التي تطور بين أحضان زوج من ملقط تشريح يجعل من الخراجات واحدة في المتوسط ​​كميات صغيرة من الصعب جدا. على سبيل المثال، استخدام غيض من الفولاذ المقاوم للصدأ دبوس الحشرات إدخالها على حامل حلقة التلقيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل الحصول على الشرانق العمر مناسب، كاليفورنيا. البذور 10 قارورة ثقافة كبيرة (مع أنابيب قطرها 4 سم) مع وجود عدد كاف من الذباب الكبار (حوالي 40-60 الذباب). لتحليل التبديل HP، استخدم الذباب معربا عن H2AvD-RFP وProtamineB-EGFP في نمطها الذاتية 12،16،22. احتضان قارورة تحت الظروف القياسية عند 25؛ درجة مئوية لمدة حوالي 4-5 أيام حتى الطور الثالث اليرقات الزحف صعودا وبدء التشرنق على جدران قارورة 25. </li></ol> 2. تمييز أو جمع الشرانق الأبيض قبل الحصول على شرانق عمره 24 ساعة لتشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاختبار تأثير بعض المواد الكيميائية على التبديل HP، تشريح الخصيتين العذراء في حوالي 24 ساعة APF 12. للحصول على الشرانق نظموا، واتخاذ مستعدة قارورة ثقافة ذبابة مع pupating اليرقات (انظر القسم 1.4) وتحديد أكبر عدد ممكن من البيض قبل الشرانق ممكن. قبل الشرانق خلال الخطوة الأولى في التشرنق كما تظهر بلا حراك، غير التغذية، اليرقات تقصير وليس مع الفتحات التنفسية مقلوبة وpuparium بيضاء اللون. يصبح puparium تان البني في غضون 30 إلى 60 دقيقة، مما يدل على المرحلة التالية من التنمية العذراء 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة مواقف ما قبل الشرانق مع علامة دائمة على السطح الخارجي للقارورة. احتضان قارورة عند 25 درجة مئوية لمدة حوالي 24 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك،اختيار قبل الشرانق من جانب قارورة مع فرشاة صغيرة مبللة مع العازلة PBS. ثم نقل ما قبل الشرانق الى جانب 50 مل أنبوب رد فعل الطازجة واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة حوالي 24 ساعة. </li></ol></li></ol> 3. تشريح العذراء الخصية في حوالي 24 ساعة بعد تشكيل Puparium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع عدة قطرات (حوالي 80 ميكرولتر لكل منهما) من المتوسط ​​على 10 سم ثقافة الخلية البلاستيك أو طبق بتري. باستخدام زوج من ملقط اسعة أو فرشاة مبللة المتوسطة، واختيار الشرانق في 24 ساعة APF مرحلة من قنينات المحتضنة (انظر القسم 2). نقل خادرة واحدة إلى كل قطرة من المتوسط ​​على الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتشريح، واستخدام المجهر ستيريو مجهزة إضاءة الألياف الضوئية. لا حرارة الخصيتين فوق RT أثناء تشريح لأن ذلك قد منع التنمية السليمة في الثقافة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الشرانق مع اثنين من أزواج من رقم 5 ملقط. مع زوج واحد، والاستيلاء على خادرة في معظم الخلفي لهاجزء (من الفتحات التنفسية الخلفي) والاحتفاظ بها في الموقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على الفتحات التنفسية الأمامية مع زوج آخر من ملقط وفتح الغطاء الخيشومي العذراء في نهايته الأمامية. تقشر حالة العذراء حتى يتعرض ما لا يقل عن جزء من القفص الصدري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في عقد خادرة في الموقف من نهايتها الأكثر الخلفية. للافراج عن الضغط الداخلي للخادرة، إدراج كل من أحضان زوج من ملقط في منطقة الرأس من خادرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزق خادرة مفتوحة عن طريق فتح ملقط ملقط والتحرك في الاتجاه الأمامي. تأكد من أن فتح ولدت مع هذه الحركة هو كبير ممكن في المحاولة الأولى. تجنب إتلاف خادرة في نهاية الخلفي لها قبل أن يتم الإفراج عن الضغط لأن ذلك قد يؤدي إلى الخصيتين يتم دفعها مباشرة من خلال فتحة صغيرة، وغالبا ما يجري تعطلت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نلاحظ أنه بمجرد أن يتم فتح خادرة، الضغوط الداخلية التي تم إصدارها من خادرة يضغط من تكتلات من خلايا الجسم من الدهون والأنسجة من خلال لاافتتاح RGE في منطقة الرأس. تحقق ما إذا كان قد تم دفع الخصيتين العذراء للخروج من الشرنقة مع هذه المواد؛ هذا يحدث في بعض الحالات. لا ترتبط الخصيتين إلى أي نوع من الأنسجة الأخرى في 24 ساعة APF وبالتالي يمكن بسهولة طرد من خادرة 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب الضغط على خادرة مع ملقط لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الخصيتين إذا كانت لا تزال في خادرة. زيادة حجم الفتحة باستخدام زوج واحد من ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم عقد خادرة في نهايته أكثر الخلفية. إغلاق الزوج الآخر من خط ملقط وبلطف من محتويات خادرة من الخلفية إلى الأمامية للافراج عن الخصيتين من خادرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخصيتين عن طريق سحب منها الى 200 ميكرولتر ماصة خفض مسبقا. محاولة نقل سوى كمية صغيرة جدا من المتوسط ​​إلى خفض عدد خلايا الجسم الدهون المحولة مع الخصيتين. وضع الخصيتين في المتوسط ​​في طبق ثقافة جديدة. غسل الخصيتين عدة مرات مع المتوسط ​​حتى خلية الجسم قليل من الدهون فقطتبقى ق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتصوير الحي، نقل الخصيتين إلى صحن ثقافة أسفل الزجاج مع المتوسطة واستخدام المجهر التصوير مقلوب. لفحوصات الدوائية، تابع الخطوة 5. </li></ol> 4. تشريح ذكر الخراجات خط جرثومة وتصوير لايف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل واحد أو أكثر من الخصية العذراء إلى صحن ثقافة أسفل الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ستيريو المجهر مع إضاءة بالألياف البصرية واثنين من الإبر الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر القسم 1.3) لتشريح الذكور الخراجات خط الجرثومية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع إبرة واحدة، في محاولة بعناية لأحدد خصية واحدة على نهاية الأمامية، أو الخلفية. لأنه عقد في الموقف. ادخال الإبرة الأخرى في الخصية وتعطيل غمد الخصية عن طريق تحريك الإبرة جانبية. سيتم اطلاق سراح العديد من الخراجات من الخصية بواسطة هذه الحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في عقد الخصية في موقف مع إبرة واحدة. خط برفق ما تبقى من الخراجات من الخصية مع الإبرة الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخراجات تجميعها منفصلة إما عن طريق جنتلاي تتحرك إبرة جانبية من خلال مجموعة من الخراجات أو عن طريق نقل الأكياس إلى طبق جديد مع الثقافة المتوسطة باستخدام ماصة غيض 200 ميكرولتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك الطبق الثقافة إلى مجهر مقلوب التصوير لتصوير حي من الخراجات واحدة. تفريق الخراجات مرة أخرى مع إبرة إذا لزم الأمر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مرحلة الخراجات باستخدام مراحل التباين ومضان المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على كيس من المرحلة المطلوبة. تأكيد التركيز ووضع الكيس في كثير من الأحيان خلال تجارب التصوير أطول، كما الخراجات لا تلتزم أسفل الطبق الثقافة، وبالتالي تميل إلى تعويم من التركيز. ملاحظة: طلاء الطبق مع بولي-L-يسين لتجميد يضر تطوير مبكرة الخراجات خط الجرثومية. بدلا من ذلك، الخراجات الفردية يمكن أن تكون معزولة. مع بعض الممارسة، فمن الممكن أن أخص بالذكر ورما معين عن طريق دفع برفق جدا مع الإبرة. هذا سيسمح نقل الخراجات واحدة لعبادة منفصلةأطباق لدى عودتهم مع ماصة باستير الزجاج مع طرف المطولة التي تناسبها في مجال الرؤية من المجهر. الخراجات معزولة ثم يمكن نقلها بسهولة في أطباق الثقافة حتى بعد حضانة طويلة الأجل. </li></ol></li></ol> 5. الدوائية الفحص سليمة مع العذراء الخصية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية مع 500 ميكرولتر من المتوسطة لتجربة واحدة من 12 مكررات. نقل العذراء واحد الخصية إلى كل بئر، وذلك باستخدام 200 ميكرولتر ماصة خفض مسبقا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من وجود protamines في الخصيتين المعزولة باستخدام المجهر مضان مقلوب. يجب أن يكون خاليا من الخصيتين إشارة ProtamineB-EGFP، مما يدل على أن التحول HP لم تتخذ مكان في أي من الخراجات. استبدال الخصيتين التي تظهر بالفعل الخراجات ProtamineB-EGFP إيجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى الآبار ال 12 الأولى، إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط ​​تحتوي المخفف مجمع المانع (حمض اناكارديتش) للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب(150 ميكرومتر) في 1 مل من المتوسط ​​لكل بئر. استخدام الآبار المتبقية وضوابط غير المعالجة. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة مع نفس الكمية من المذيبات المستخدمة كما هو الحال مع مركبات مثبطات. ملاحظة: إذا تم استخدام العديد من المركبات والمذيبات المختلفة، قد يكون أكثر كفاءة في استخدام الوسيلة وحدها، والتحكم واختبار تأثير زيادة تركيزات المذيبات في تجارب منفصلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق مرة أخرى لوجود protamines في الخصيتين المحتضنة كما هو موضح أعلاه. يجب الخصيتين السيطرة تظهر الآن الخراجات واحد أو أكثر ProtamineB-EGFP إيجابية، مما يشير إلى التحول من خلال التبديل HP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة مع طرف 200 ميكرولتر، نقل الخصيتين إلى بولي-L-يسين المغلفة الشرائح، واتخاذ الاستعدادات الاسكواش وصمة عار مع الأجسام المضادة الفلورسنت المناسبة كما هو موضح في مكان آخر 12،27،28. </li></ol>

<ol>
	<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+cell+proliferation+and+differentiation+in+Drosophila+spermatogenesis.">Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).</li><li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+lessons+from+the+Drosophila+testis.">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).</li><li>Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+spermiogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).</li><li>Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can&#8217;t+live+without+them,+can+live+with+them:+roles+of+caspases+during+vital+cellular+processes.">Can&#8217;t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes.</a> Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).</li><li>Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histones+in+chromatin+remodelling+during+mammalian+spermiogenesis.">The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis.</a> Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).</li><li>Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+marmoset+(Callithrix+jacchus)+as+a+model+for+histone+and+protamine+expression+during+human+spermatogenesis.">The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis.</a> Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).</li><li>Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamines+and+spermatogenesis+in+Drosophila+and+Homo+sapiens.">Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens.</a> Spermatogenesis. 3 (2), (2013).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2013).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+from+a+nucleosome-based+to+a+protamine-based+chromatin+configuration+during+spermiogenesis+in+Drosophila.">Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila.</a> J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).</li><li>Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+acetylation+is+essential+to+proceed+from+a+histone-+to+a+protamine-based+chromatin+structure+in+spermatid+nuclei+of+Drosophila+melanogaster.">Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster.</a> Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).</li><li>Olivieri, G., Olivieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+nucleic+acid+synthesis+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).</li><li>Gould-Somero, M., Holland, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+RNA+synthesis+for+spermiogenesis+in+organ+cultures+ofDrosophila+melanogaster+testes.">The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).</li><li>Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-meiotic+transcription+in+Drosophila+testes.">Post-meiotic transcription in Drosophila testes.</a> Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).</li><li>Barckmann, B., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+levels+of+regulation+lead+to+protamine+and+Mst77F+expression+in+Drosophila.">Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila.</a> Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).</li><li>Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis+in+in+vitro+cultures.">The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C., Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Male+Meiosis+by+Phase-Contrast+and+Fluorescence+Microscopy.">Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy.</a> Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).</li><li>Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+Drosophila+spermatogonia+in+vitro.">Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro.</a> Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).</li><li>Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain-containing+protein+tBRD-1+is+specifically+expressed+in+spermatocytes+and+is+essential+for+male+fertility.">The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility.</a> Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).</li><li>Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+by+Drosophila+melanogaster+Protamines+and+Mst77F+of+Histones+during+Chromatin+Condensation+in+Late+Spermatids+and+Role+of+Sesame+in+the+Removal+of+These+Proteins+from+the+Male+Pronucleus.">Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+smooth+muscles+and+mononucleated+as+well+as+multinucleated+striated+muscles+develop+during+establishment+of+the+male+reproductive+organs+of+Drosophila+melanogaster.">Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).</li><li>Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Culture+of+Drosophila.">Laboratory Culture of Drosophila.</a> Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).</li><li>Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+ring+canals+in+the+male+germ+line+from+structural+components+of+the+contractile+ring.">Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring.</a> J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatocyte+growth+and+male+meiosis+in+Drosophila+melanogaster.">Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).</li><li>Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+testes+in+Drosophila.+I.+The+relation+between+vas+deferens+and+testis+within+various+species.">The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species.</a> J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).</li><li>Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+lineage+is+required+for+differentiation+and+not+maintenance+of+germline+stem+cells+in+Drosophila+testes.">Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes.</a> PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Braun, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+paternal+chromosomes+with+protamine.">Packaging paternal chromosomes with protamine.</a> Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).</li><li>G&#246;risch, S. M., Wachsmuth, M., T&#243;th, K. F., Lichter, P., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+increases+chromatin+accessibility.">Histone acetylation increases chromatin accessibility.</a> J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).</li><li>Demerec, M., Kaufmann, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).</li><li>Wang, W., Yoder, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pupal+Abdomen+Immunohistochemistry.">Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li><li>Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Quantitative+Nutritional+Requirements+of+Drosophila+Melanogaster.">The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).</li><li>Meynadier, G., Vago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).</li><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+acetyltransferase+activity+by+anacardic+acid+sensitizes+tumor+cells+to+ionizing+radiation.">Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation.</a> FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).</li><li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development.">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة.

يصف بروتوكول المعروضة اثنين من التطبيقات المختلفة على حد سواء على القدرة على تشريح الخصيتين ذبابة الفاكهة والخراجات واحد خط الجرثومية في مرحلة تنموية معينة، وعلى تطوير فيفو السابقين من هذه الخلايا والأنسجة في صحن الثقافة. طلب واحد هو التلاعب الدوائية من العمليات الحيوية خلال تطوير الحيوانات المنوية. الأهم من ذلك، هذا يسمح بالوصول إلى تكوين الحيوانات المنوية بعد الانتصافي الذي لا كسب بسهولة باستخدام تحليلات وظيفية على أساس الوراثة الطاير. التطبيق الآخر هو مراقبة مجهرية المعيشة وتطوير الخلايا التناسلية والخصيتين. خاصة هذا التطبيق الاستفادة من قدرة خلايا ذبابة الفاكهة والأعضاء في الثقافة من أجل البقاء والتطور في RT وتحت الغلاف الجوي العادي. وبالتالي، مجهر التصوير مقلوب مجهزة مرحلة ساخنة (التسخين لدرجة حرارة تربية القياسية من 25 درجة مئوية) كافية للحصول على نتائج ذات مغزى في التجارب الحية التصوير. وعلاوة على ذلكأكثر من ذلك، العديد من السلالات المعدلة وراثيا ذبابة معربا عن البروتينات الموسومة بروتين فلوري للتصوير الحية موجودة أو يمكن أن تنشأ بسهولة. للحصول على الخصيتين العذراء أو الخراجات خط الجرثومية من مرحلة تنموية محددة، فمن الأهمية بمكان أن واحد هو مألوف مع توقيت وضع ذبابة الفاكهة. التوقيت الدقيق لكل مرحلة قد تختلف بين المختبرات والظروف والثقافة، ويطير السلالات ويجب وضع تجريبيا. على النحو المبين أعلاه، وهذا مهم خاصة بالنسبة للفحوصات الدوائية، على سبيل المثال، استهداف التبديل HP. لمثل هذه التجارب، فإنه من المستحسن للتحقق دائما لspermatids مع إشارة ProtamineB-EGFP قبل الاختبار الفعلي المانع لأن توقيت يمكن أن تختلف قليلا حتى داخل احد السكان. بعد بروتوكول أعلاه يجب أن تمكن المجرب لتشريح الخصيتين من مراحل العذراء مبكرة كأجهزة سليمة خالية من تعلق أنسجة الجسم الدهنية. هذه الخصيتين، وحتى أكثر من ذلك، عزل جنرال الكتريكالخراجات خط RM-هشة جدا. وبالتالي، من الأهمية بمكان لتطوير البراعة اليدوية والخبرة اللازمة لمناولة ونقل الخصيتين والخراجات باستخدام ملقط، والإبر، والماصات. خاصة الدراسات التي تستهدف تطوير بعد الانتصافي الخلية الجرثومية الانتصافي وأوائل ستستفيد من هذا. في حين أنه من السهل نسبيا لتشريح الخراجات من spermatids أواخر مع سياط طويلة من الخصيتين الكبار، فمن الصعب الحصول على المراحل السابقة. تشريح هذه الأكياس من الخصيتين العذراء في وقت مبكر بعد هذا البروتوكول هو أكثر كفاءة بكثير. نضع في اعتبارنا أن في سلالة ذبابة المعتاد، فقط حوالي 50٪ من الشرانق سوف يكون من الذكور. لذلك، وإعداد لتشريح على الأقل ضعف عدد الشرانق حيث بلغ عدد الخصيتين المطلوبة. بدلا من ذلك، فمن الممكن لتحديد الذكور L3 اليرقات باستخدام مجهر ستيريو، كما يمكن التعرف على الخصيتين أجهزة مستديرة شفافة وجزءا لا يتجزأ في أنسجة الجسم الدهون الجانبية لليرقة سليمة 23،34، وجمعها في قارورة الثقافة الجديدة التي يمكناستخدامها لالتقاط ما قبل الشرانق للانطلاق والتشريح. ومن الممكن أيضا لتحديد الذكور قبل الشرانق 35. لاحظنا أن كلا من الخراجات خط الجرثومية المعزولة والخصيتين العذراء سليمة في الثقافة حساسة للضوء، كما تم أيضا ذكر سابقا 18. هذه الحساسية الخفيفة قد عقد أيضا لبعض المركبات الكيميائية المستخدمة في المقايسات الدوائية. لذا، فمن الأفضل للحفاظ على أطباق ثقافة مقايسة في الظلام أثناء الحضانة. وبالمثل، عند تخطيط التجارب الوقت الفاصل بين التصوير مع الخصيتين النامية، وخاصة الأكياس المعزولة، أن نضع في اعتبارنا أن أوقات التعرض طويلة جدا و / أو معدلات عالية جدا أخذ العينات قد تحول دون تطوير فيفو السابقين. ينبغي تحديد معدل أخذ العينات المناسبة تجريبيا. العدوى البكتيرية و / أو الفطرية والإفراط في النمو في أطباق ثقافة يشكل مشكلة خطيرة. أطباق ثقافة المصابين عدد كبير جدا من البكتيريا لا تدعم فيفو السابقين ديفيlopment من الخصيتين والخراجات. ولذلك، فإن مستنبت وصف يحتوي البنسلين والستربتومايسين (راجع الخطوة 1.1)، ولكن خلال فترة الحضانة على المدى الطويل، يمكن أن تتحلل هذه المضادات الحيوية والنشاط التي قد تقلل. هذا يمكن أن يكون أحد الأسباب لفترة محدودة للبقاء (بحد أقصى 72 ساعة) من الخراجات مثقف لوحظ عند استخدام بروتوكول أعلاه. بعد هذا الإطار الزمني لا يمكن مدد استبدال العادية من مستنبت في أطباق. نستنتج أن هناك عوامل أخرى قد تؤثر على بقاء في الثقافة، مثل عدم وجود إشارات النمو من الأنسجة الأخرى من الجهاز التناسلي. من ناحية أخرى، والتنمية بعد الانتصافي هي ذبابة الفاكهة في أسرع منه في الثدييات. في ذبابة الفاكهة، تكون النطاف يستغرق حوالي 90 ساعة، والتبديل HP يقام بين 50 و 60 ساعة بعد الانقسام المنصف 9،12. وهكذا، فإن بقاء الوقت المعتاد لحوالي 48 ساعة يتحقق مع هذا البروتوكول هو مناسبة تماما لمتابعة العمليات التنموية المحورية في جمعية مهندسي البترولrmatogenesis، مثل الانقسامات الانتصافي أو التبديل HP. على الرغم من التلوث الجرثومي أو الفطري يمكن تجنبها باستخدام أدوات نظيفة وسائل الإعلام، وبروتوكول المقدمة لا الاستفادة من ظروف العمل معقمة بدقة بسبب الذباب وذبابة الخصيتين يحتوي بالفعل البكتيريا عندما المثارة في إطار الظروف القياسية. ومع ذلك، بعض التطبيقات لهذه التقنية الثقافة قد تستفيد من الذباب تشريح أو حتى أثار تحت ظروف معقمة (لبروتوكولات، انظر 17،36،37). المقايسات الدوائية تعتمد على استخدام مركبات كيميائية تعمل باسم مثبطات أو تفعيل الإنزيمات المختلفة. المركبات التي تستخدم عادة في مثل هذه التجارب كثيرا ما تختلف على نطاق واسع في خصوصية المستهدفة. وميزة، وهذا يوفر القدرة على استهداف الطبقات انزيم بأكملها، على سبيل المثال، مع حمض اناكارديتش تثبيط P300 / الجمارك وحماية الحدود، PCAF، وأفراد الأسرة MYST من القبعات 38. الجانب السلبي من هذا يمكن أن يكون بعيدا عن الهدف المحتمل أو الآثار السامة للخلايا inducإد من هذه المركبات. ولذلك، ينبغي اختبار كل مركب يستخدم في فحص الخصيتين مع العذراء أو الخراجات من أجل سمية الخلايا وتأثير محدد بتركيزات مختلفة. وعلاوة على ذلك، هناك اختلافات طفيفة في الظروف والثقافة، وتركيز مركب أو النشاط، والتغيرات في نفاذية الخلية قد يؤدي إلى تنوع الآثار التي يسببها. وبالتالي، فمن الضروري مراقبة نجاح العلاج في كل تجربة. على سبيل المثال، عندما كنا حمض اناكارديتش في 150 ميكرومتر، لاحظنا التغير الطفيف في قوة النمط الظاهري بين لونين التكثيف وأحيانا داخل بعض الخصيتين، في حين انخفض أستلة هيستون H4 باستمرار. وقد استخدمت المقايسات الدوائية مع الخصيتين ذبابة الفاكهة في الثقافة لتحليل آليات ما قبل وما بعد الانتصافي من الحيوانات المنوية 4،12،14،21. لأنه من الصعب الوصول إلى الحيوانات المنوية بعد الانتصافي مع الأدوات الوراثية لاستهداف اللاعبين مع ضروريهوظائف لتر قبل الانتصافي والانتصافي، وهذا النهج فيفو السابقين يشكل بديلا. وعلاوة على ذلك، من حيث المبدأ، يمكن تكييف طريقة لنبض مطاردة تجارب لمتابعة تطور الخلايا الجرثومية تعامل مع مرور الوقت. ومع ذلك، فإننا لم تختبر بعد هذا الاحتمال. الاستفادة من وقت مبكر الخصيتين العذراء هي ميزة في المقايسات الدوائية. أولا، يمكن للغمد الخارجي رقيقة من الخصيتين العذراء الشابة (حوالي 24 ساعة APF) تسمح تحسين نفاذية من المركبات الكيميائية. ثانيا، عند دراسة HP التبديل بعد الانتصافي، الخصيتين العذراء تشريح في 24 ساعة APF من خط الطيران معربا عن بروتامين-GFP تمكين قراءات مباشرة ما إذا كان تأثر التبديل HP أم لا. حتى الآن، وقد وضعت عدة بروتوكولات لخارج الحي زراعة الأعضاء والأنسجة بما في ذلك الخصيتين والخراجات خط الجرثومية ذبابة الفاكهة (على سبيل المثال، انظر 4،14،17،20،39،40). وسيلة زراعة والظروف العامة المستخدمةفي البروتوكول المقدمة هنا تم تأسيسها في عام 1979 17. وقد تم تكييف نظام الثقافة في وقت لاحق في الجسم الحي التصوير آلية الفردية في الخراجات ما بعد الانتصافي أواخر معزولة عن الخصيتين الكبار 4. سابقا، كنا قد ذكرت أن هذه الظروف أيضا أن تدعم بقاء وتمايز الخلايا الجرثومية الانتصافي وبعد الانتصافي مبكرة في الخراجات من أجل حوالي 48 ساعة 12. على النقيض من نظم الاستزراع الأخرى 19 كان توقيت التنموي لوحظ في هذه الثقافات يتفق تقريبا مع توقيت تحديده من عينات ثابتة (لمزيد من التفاصيل، انظر 12). H2AvD-RFP وبروتامين-GFP مضان إشارات يمكن استخدامها لتصور التشكل وتكوين الكروماتين النووي للخلايا الجرثومية في الثقافة. وجدنا أن لتحديد واضح لمراحل النمو في الثقافة، وهذا هو المفيد على معايير أخرى، مثل اللف الخراجات. الأهم من ذلك أن بروتوكول المقدمة لا تشمل إضافة ذبابة تحويلةract عوامل النمو الأخرى أو غيرها من مصل بقري جنيني. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا هنا أن الظروف متوافقة مع التصوير المجهري مضان من الانقسامات الانتصافي فيفو السابقين في الثقافة. ويمكن الحصول على صور لقرار معقول في وسيلة سهلة الاستخدام التي تدعم التنمية على المدى الطويل. هذا هو على النقيض من بروتوكولات تمكين المدى القصير (حوالي 3 ساعة) الملاحظات في زيت Voltalef 41،42. الإجراءات المذكورة أعلاه للزراعة والعلاج الدوائي من الخصيتين العذراء واحدة الذكور الخراجات خط الجرثومية قابلة للتكيف بسهولة إلى العديد الجيني، جينية، بيولوجية الخلية، أو أسئلة التنموية التي يمكن بحثها في ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية. ويشمل ذلك خصوصا الأبحاث التي تركز على الخلايا الجذعية خط الجرثومية. وقد تبين أن تنمية الخلايا الجذعية يمكن أن تتبعها التصوير الحي من البالغين مثقف الخصيتين 20،43. ومع ذلك، فإن حركة تمعجية من الخصية الناضجة sheatح يتداخل مع الحصول على الصور. لذلك، ويتم التصوير باستخدام إما مجزأة 43 الخصيتين أو عدد من التجارب أجريت التصوير لابد من زيادة لحساب مجموعات البيانات المفقودة 20. الخصيتين العذراء في وقت مبكر (24 ساعة APF) لم ترفق بعد مع خلايا العضلات. حتى قليلا تظهر الخصيتين القديمة (36-45 ساعة APF) لإظهار بعض الحركات تحوي (قارن الشكل 3 والفيديو التكميلي 1). وبالتالي، يمكن زراعة الخصيتين العذراء الشابة كأجهزة سليمة تخدم كبديل. وعلاوة على ذلك، يتقن مرة واحدة، والقدرة على تشريح الخصيتين العذراء وسوف في نهاية المطاف معزولة الخراجات خط الجرثومية تسمح تطبيقات أخرى باستخدام الأكياس واحدة كمصدر للمتجانس، ولو صغيرة، والسكان الخلية. على سبيل المثال، بالتالي فمن الممكن أن تؤدي RT-QPCR لتحليل التنظيم النسخي من جينات معينة خلال مراحل محددة من الحيوانات المنوية، كما سبق أن برهنت <suص 15&gt;.

تطوير الخلايا الجرثومية الذكور لكثير من الأنواع هي عملية متتابعة. ويتميز هذا من خلال سلسلة من الأحداث الحاسمة التي يبلغ ذروته في تشكيل الحيوانات المنوية شكليا وepigenetically درجة عالية من التخصص. في ذبابة الفاكهة السوداء، خط الخلايا الجذعية الجرثومية في طرف الفجوة الخصية غير متماثلة لتؤدي إلى خلية جذعية جديدة وspermatogonium، أي خلية ابنة ملتزمة التمايز (انظر الشكل 1 لمحة عامة) 1،2 . وspermatogonium يخضع أربع جولات من الانقسامات الإنقسامية و، مع بداية الانقسام الاختزالي، تسمى مرحلة النمو الهائل والنشاط النسخي مرحلة خلية نطفية. الخلايا الناشئة من spermatogonium واحد البقاء على اتصال مع بعضها البعض وتطوير كحزمة واحدة متزامنة ملفوفة من قبل اثنين من الخلايا الجسدية لهيكل يشار إلى الكيس. بعد الانتهاء من الانقسام المنصف، مورفولوجيا الخلايا الجرثومية الذكور تماماتنظيم (كما هو موضح تخطيطي في الشكل 1). في البداية، spermatids مستديرة استطال لتشكيل هيكل رئيس الهيدروديناميكية، والسوط يتطور. في نهاية المطاف، يتم فصل الخلايا المنوية عن بعضها البعض من قبل، آلية معقدة تسمى الخلايا المرتبطة الفردية 3-5. في كثير من الأنواع، بما في ذلك ذبابة الفاكهة السوداء وأنواع الثدييات، والتغيرات المورفولوجية للخلايا الجرثومية تكون مصحوبة إعادة ترتيب جينية لافت للفرداني الذكور خط الجرثومية الكروماتين، دعا التبديل هيستون، لبروتامين (HP التبديل) 6-9. ربما تقريبا يتم تجريد جميع هيستون الكنسي والعديد من الجزيئات هيستون-البديل من الحمض النووي ويتم استبدال البروتينات الأساسية الصغيرة، وprotamines، مما أدى إلى بروتامين النواة هيكل مدمج للغاية محددة إلى لونين من الحيوانات المنوية الناضجة. الخصائص العامة للتبديل HP هي رانه استبدال الهستونات الكنسي أول من المتغيرات هيستون، ثم البروتينات الانتقالية، وأخيرا protamines. كل هذا يرافقه العديد من التغييرات على علامات جينية، مثل زيادة في مستويات أستلة هيستون H4 قبيل إزالة هيستون 7،10 - 12. معظم، إن لم يكن كلها، من العمليات المذكورة أعلاه ضرورية لتطوير ناضجة، الحيوانات المنوية خصبة بشكل كامل. وهذا صحيح ليس فقط في ذبابة الفاكهة ولكن أيضا في البشر، كما أسهم الحيوانات المنوية الثدييات قدرا كبيرا من التشابه مع 1،8،9 نظام اللافقاريات. دراسة تطور الخلايا الجرثومية الذكور مما يسهل إلى حد كبير في نظام نموذجي ذبابة الفاكهة. الذباب يمكن الوصول إليها غاية وراثيا. جيل من المسوخ وكذلك إنشاء سلالات ذبابة معربا عن الجينات الانصهار أو يبني تدخل RNA يأخذ القليل من الجهد. ومع ذلك، في دراسة الحيوانات المنوية بعد الانتصافي، واستخدام المسوخ وأدوات بسيطة د الوراثية قد تصل الى حد. في ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية، النسخ توقف تماما تقريبا مع دخول الانقسامات الانتصافي. وهكذا، ويستند تكوين الحيوانات المنوية بعد الانتصافي أساسا على قمع من mRNAs translationally وتخزينها توليفها في الطور الأول الانتصافي الموسعة 13-16. لذا، أدوات مثل التدخل RNA أو استخدام طفرات غير مشروطة ليست مناسبة لدراسة تحديدا الأدوار بعد الانتصافي من المنتجات الجينات التي تلبى أيضا المهام الأساسية في التنمية الخلية الجرثومية قبل الانتصافي أو الانتصافي. ميزة واحدة من ذبابة الفاكهة التي يمكن استغلالها في مثل هذه الحالات هي قدرة الخصيتين سليمة تشريح وحتى الخراجات من الخلايا الجرثومية لتطوير فيفو السابقين في مستنبت 4،12،17 - 20. تشريح وزراعة الخصيتين أو الخراجات خط الجرثومية يسمح الملاحظة المجهرية ليس فقط من تطوير خلايا جرثومية في الخلايا الحية، ولكنيسوتو استخدام المقايسات الدوائية مع، على سبيل المثال، مثبطات انزيم المجمعات مثل acetyltransferases هيستون (القبعات)، deacetylases هيستون (HDACs)، topoisomerases، أو proteasome. وبالتالي، فمن الممكن للتلاعب وظائف الأنزيمية خلال تكوين الحيوانات المنوية بعد الانتصافي ورصد النتائج التنموية بغض النظر عن وظائف الجنينية، قبل الانتصافي، أو الانتصافي 4،12. في المقايسات الدوائية، ونحن سبق تحليلها توطين تعتمد على أستلة من بروتين bromodomain خلال الطور الأول الانتصافي فضلا عن أهمية مستويات هيستون أستلة لHP التبديل جينية في الحيوانات المنوية بعد الانتصافي باستخدام مثبطات معينة تستهدف القبعات وHDACs 12،21. وجاء استهداف التبديل HP في هذه المقايسات الممكن باستخدام سلالة ذبابة تعبر عن الجينات الانصهار histone2AvD-RFP وprotamineB-EGFP 12،22 في أنماط الذاتية، وملاحظة أنوspermatids الأولى في الخصيتين العذراء تمر من خلال التبديل HP بين 24 و 48 ساعة APF 12. بروتوكول قدم يصف تشريح الخصيتين والخراجات من ذبابة الفاكهة الشرانق، والظروف والثقافة، ومقايسة الدوائية مع الخصيتين العذراء سليمة. لهذا الغرض، يتم تشريح الخصيتين العذراء في حوالي 24 ساعة بعد تشكيل puparium (APF) (أنظر الشكلين 1 و 2). في هذا الوقت، لم تقدم الخصيتين وصلات إلى الأنسجة الأخرى، وتحيط به فقط غمد الخارجي رقيقة، والذي يسمح أفضل الاختراق من قبل مركبات مثبطات 23،24. الخصيتين هي الأجهزة bean- أو على شكل الكمثرى التي يمكن اتخاذها بسهولة في الثقافة. يتم تشريح هذه الخصيتين، مثقف، وتعامل مع مثبطات معينة. بعد ذلك، يتم رصد آثار مثبطات المناعي باستخدام تحليل والفحص المجهري مضان من البروتين الانصهار التعبير، والمقارنة بين morphol النوويةogy من الخلايا الجرثومية المعالجة إلى أن الخلايا الجرثومية غير المعالجة. الشروط الواردة في هذا البروتوكول أيضا يسمح التصوير المباشر لتطوير الخصيتين والخراجات خط الجرثومية في الثقافة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Anacardic acid</td>
			<td style="width:105px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:99px;">172050</td>
			<td style="width:247px;">brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-acetyl-Histone H4</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-598</td>
			<td>brand: Upstate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioObserver.Z1 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont 5-Inox forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fiber optical&#160; illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inoculation loop or pin holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5018</td>
			<td rowspan="2" style="width:247px;">In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5014</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plates, 24-wells</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>351147</td>
			<td>brand: Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen Strep</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td>brand: Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stemi SV6 binocular</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

خلال تكوين الحيوانات المنوية في الثدييات وذبابة الفاكهة في البطن، والخلايا الجرثومية الذكور في تطوير سلسلة من العمليات التنموية الأساسية. ويشمل هذا التمايز من السكان الخلايا الجذعية، والتضخيم الإنقسامية، والانقسام المنصف. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا الجرثومية بعد الانتصافي الخضوع لعملية إعادة تشكيل جذرية المورفولوجية، فضلا عن إعادة تشكيل جينية العالمية من خط الجرثومية الكروماتين على مفتاح هيستون، لبروتامين. دراسة دور البروتين في الحيوانات المنوية بعد الانتصافي باستخدام الطفرات الوراثية أو أدوات أخرى غالبا ما تعيقها الجنينية الأساسية، قبل الانتصافي، أو وظائف الانتصافي من البروتين قيد التحقيق. يمكن حجب النمط الظاهري بعد الانتصافي من المسخ مثل هذا البروتين من خلال كتلة التنموي سابق، أو تفسير النمط الظاهري يمكن أن يكون معقدا. الكائن نموذج ذبابة الفاكهة السوداء البطن يقدم تجاوز لهذه المشكلة: الخصيتين سليمة وحتى الخراجات من الخلايا الجرثومية تشريح من الشرانق في وقت مبكر قادرة على تطوير فيفو السابقين في مستنبت. الاستفادة من مثل هذه الثقافات يسمح التصوير المجهري المعيشة الخلايا الجرثومية في الخصية والخراجات خط الجرثومية. الأهم من ذلك، أصبحت الخصيتين المزروعة والخلايا الجرثومية أيضا الوصول إلى مثبطات الدوائية، مما يسمح التلاعب من خلال وظائف الأنزيمية الحيوانات المنوية، بما في ذلك مراحل ما بعد الانتصافي. يصف بروتوكول المعروضة كيفية تشريح وزراعة الخصيتين العذراء والخراجات خط الجرثومية. يتم توفير المعلومات حول تطور الخصيتين العذراء والشروط الثقافة جنبا إلى جنب مع بيانات التصوير المجهر من الخصيتين الحية والخراجات خط الجرثومية في الثقافة. نحن أيضا وصف مقايسة الدوائية لدراسة الحيوانات المنوية بعد الانتصافي، ومن أمثلته مقايسة استهداف التبديل هيستون، لبروتامين باستخدام مثبطات حمض أسيتيل هيستون اناكارديتش. من حيث المبدأ، يمكن تكييف هذه الطريقة لزراعة معالجة العديد سأسئلة البحث ذر في تكوين الحيوانات المنوية قبل وبعد الانتصافي.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment at JoVE.com

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

فيفو السابقين الثقافة من ذبابة الفاكهة العذراء خصية واحدة ذكر الخراجات جرثومة خط: تشريح، التصوير، والمعالجة الدوائية

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

ex-vivo-culture-drosophila-pupal-testis-single-male-germ-line-cysts

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.3K Views.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Video: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

التصوير من خلال حالة العذراء من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

فيفو السابقين الثقافة من الفأر الجنينية بالبشرة والتصوير لايف للهجرة أرومة ميلانينية

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

في فيفو حقن مكروي و Electroporation ماوس الخصية

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.