نشكر SF 4206 ICORE (جامعة كاين) لاستخدام المرفق الخلوي. تلقى JC زمالات ما بعد الدكتوراه من CONSEIL دي Radioprotection D&#39;EDF وCONSEIL الإقليمي لباس نورماندي. وكانت تلك البيانات جزء من المشاريع الممولة من قبل الرابطة الوطنية مناهضة جنيه السرطان - مرافقة DE L&#39;أورني وآخرون دو كالفادوس.

1. إعداد C12FDG، Bafilomycin A1، والثقافة الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل مسحوق FDG C 12 في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى التركيز النهائي من 20 ملم. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية. DMSO ينبغي أن تستخدم مع شروط السلامة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل مسحوق A1 bafilomycin في DMSO إلى تركيز النهائي من 0.1 ملم. قسامة وتخزينها في - 20 درجة مئوية. Bafilomycin ينبغي أن تستخدم مع شروط السلامة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة RPMI 8226 خط الخلية، أو خطوط الخلايا الأخرى ملتصقة أم لا، في وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ المضادات الحيوية، عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تقدير عدد الخلايا اللازمة للتجربة. من أجل تسجيل عدد كاف من الأحداث خلال تحليل التدفق الخلوي، يطلب 5 × 10 5 خلايا. لتحديد النسبة المئوية للخلايا هرمة، هناك حاجة إلى ثلاث عينات الخلايا: عينة غير المسماة، الخلايا غير المعالجة ملطخة C 12 FDG، الخلايا المعالجة ملطخةC 12 FDG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذور الخلايا 24 ساعة قبل إجراء التجربة بحيث الخلايا في مراحل سجل من منحنى الانتشار الخلوي. </li></ol> 2. تحريض الشيخوخة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحث الشيخوخة للخلايا السرطانية وذلك بإضافة المخدرات chemotherapeutical. وينبغي تكييف تركيز الدواء ومدة العلاج إلى نوع من الخلايا التي تم اختبارها. تبدأ مع العلاج الموارد البشرية 48 في تركيز النهائي من 50 نانومتر دوكسوروبيسين لتركيز من الخلايا في حوالي 10 6 خلية / مل. لا تنسى أن تشمل عينة غير المعالجة (مراقبة سلبية). </li></ol> 3. Bafilomycin A1 معالجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق بقاء الخلية عن طريق خلط الخلايا مع التريبان الأزرق (V / V)، والدواء chemotherapeutical المستخدمة في الخطوة السابقة قد يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج الخلية. شغل في غرفة مالاسيه وحساب عدد الخلايا الزرقاء (الخلايا الميتة) والخلايا البيضاء (الخلايا الحية). إذا كانت النسبة المئوية للبقاء أقل من 70٪، قد تكون الخلايا الميتة REMاوفيد باستخدام عدة المناسبة لضمان عدم التحيز في التحليل اللاحق الخلايا الميتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام والثقافة، واستبدال من قبل وسائل الاعلام prewarmed ثقافة جديدة. علاج الخلايا مع تركيز النهائي من 100 نانومتر من bafilomycin A1. يستخدم Bafilomycin A1 لتحييد الحموضة الحمضية من الجسيمات الحالة. احتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. </li></ol> 4. C 12 FDG تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل C 12 FDG في prewarmed سائل الإعلام والثقافة الطازجة إلى تركيز النهائي من 2 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى مركب الخلايا في تركيز النهائي من 33 ميكرومتر واحتضان 2 ساعة على 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. إذا باستخدام الخلايا غير ملتصقة، الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية (قد يكون من سرعة إلى تعديل لنوع من الخلايا المستخدمة)، وغسل 2X مع برنامج تلفزيوني. Resuspend وبيليه الخلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة. إذا باستخدام الخلايا الملتصقة، وإزالة وسائل الاعلام وغسل 2X مع برنامج تلفزيوني. حصاد الخلايا الملتصقة باستخدام محلول التربسين وأجهزة الطرد المركزيالخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 ° C (سرعة قد يتعين تعديلها لنوع من الخلايا المستخدمة). Resuspend وبيليه الخلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة. في كلتا الحالتين، يجب أن يكون تركيز خلية حوالي 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء المشارك الوسم المناعي لمزيد من تميز السكان من خلايا هرمة. </li></ol> 5. تحليل التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة عداد الكريات تدفق باستخدام الخرز المكافحة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للتدفق عداد الكريات. لجميع الخطوات، 10 على الأقل 4 الأحداث يجب أن يتم تسجيلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل العينة الأولى التي تحتوي على خلايا غير المسماة. إعداد اثنين من المعلمة الرسم عرض القناة مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب قناة مبعثر (SSC). ضبط مضخم أنابيب (فرق إدارة المشاريع PMT) وتحديد المنطقة ذات الاهتمام استبعاد الخلايا الميتة والبقايا الخلوية يمكن أن تكون قد ظهرت أثناء إعداد العينة. بوابة هذه المنطقة من مصلحة في الرسم البياني، معلمة واحدة عرض FL1 على مقياس سجلللمحور X وعدد من الأحداث في المحور الصادي. إجمالي عدد الأحداث يمثل عدد الخلايا التي تم تحليلها. تعيين PMT بحيث تظهر الخلايا غير المسماة في العقد الأول على مقياس سجل من المحور س. تحديد تألق ذاتي للخلايا إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل العينة الثانية التي تحتوي على الخلايا غير المعالجة. على الرسم البياني-معلمة واحدة عرض FL1 (مضان من C 12 FDG)، ضع المؤشر بعد السكان المسمى الخافتة. وسوف تسمح هذه العتبة التمييز بين الخلايا غير هرمة (الخلايا المسمى خافت) وخلايا هرمة (الخلايا المسمى الزاهية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل العينة الثالثة التي تحتوي على الخلايا المعالجة. المسمى الزاهية الخلايا، أي خلايا هرمة تظهر فوق العتبة المحددة في الخطوة السابقة. تقييم النسبة المئوية للخلايا هرمة بقسمة عدد من الأحداث مشرق في العدد الإجمالي للأحداث. إذا لزم الأمر، وآخر من β-غالاكتوزيداز يمكن أيضا أن يقدر باستخدام مضان يعنيكثافة. </li></ol>

<ol>
	<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li><li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+when+bad+things+happen+to+good+cells.">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li><li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy.">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li><li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints.">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li><li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo.">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li><li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis:+a+link+between+cancer+and+aging.">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li><li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li><li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment.">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li><li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li><li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+(beta)-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells.">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells.">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدمنا ​​هنا طريقة تعتمد على التدفق الخلوي لقياس الشيخوخة الخلوية في الخلايا السرطانية الحية. ويستند هذا الأسلوب على استخدام مركب نفاذية الغشاء، وC 12 FDG، وبالتالي يمكن استخدامها في أي نوع من أنواع الخلايا وبعد العلاجات المختلفة طالما يتم أخذ المجمع من قبل الخل...

منذ مطلع الستينات واكتشافه من قبل Hayflick ومورهيد، الشيخوخة لا يزال فضول الخلوية 1. الخلايا البشرية لا تتكاثر إلى ما لا نهاية، وبحلول الشيخوخة، Hayflick ومورهيد صاغ عملية الخلوية من الشيخوخة. الشيخوخة هو مستقر الخلية اعتقال دورة في الخلايا التي لا تزال نشطة عملية الأيض في مقابل الموت الخلوي. حتى الآن، وقد ثبت أن أربع آليات الخلوية للحث على الشيخوخة: تقصير التيلومير، الحمض النووي من التلف، اضطراب لونين، والتعبير غير طبيعي من الجينات المسرطنة مولد للتفتل 2. هذا يشير إلى أن الخلايا الطبيعية فحسب، بل أيضا الخلايا السرطانية قادرة على الخضوع الشيخوخة 3. كما واقع الأمر، عرضت خلايا السرطان الذين يخضعون الشيخوخة تشكل عائقا أمام مزيد من تطور الورم 4-5. ومع ذلك، فقد أشارت العديد من التقارير الآن إلى أنه، في ظل ظروف معينة، الشيخوخة الخلوية يمكن أيضا أن تعزز خباثة 6-7. دراسة الشيخوخة من سرطان سلLS على وشك أن تصبح الرغبة في أبحاث السرطان كما هو مستخدم حاليا أدوية العلاج الكيميائي يمكن أن يؤدي إلى الشيخوخة من الخلايا السرطانية في المختبر ليس فقط ولكن أيضا في الجسم الحي 8. مقايسة ماستر للتحقيق لوجود خلايا هرمة هو فحص β-غالاكتوزيداز في الرقم الهيدروجيني الحمضية. ويعكس هذا الاختبار النسيجية زيادة في نشوء حيوي الليزوزومية التي تحدث في معظم خلايا هرمة. لفترة وجيزة، الخارجية X-غال، وتطبيقها على الخلايا، هو المشقوق بواسطة β-غالاكتوزيداز المخصب في الجسيمات الحالة من خلايا هرمة، مما أدى إلى اللون الأزرق 9. ويمكن بعد ذلك كميا خلايا هرمة الأزرق تحت المجهر حقل مشرق. على الرغم من شعبية جدا، الفحص β-غالاكتوزيداز يعرض العوائق الرئيسية. أولا، يتم تنفيذ هذا الاختبار على خلايا ثابتة. الثاني، هو مضيعة للوقت لأنه يعني لقياس درجة من الشيخوخة عن طريق عد عدد كبير كبير من خلايا هرمة تحت المجهر. ثالثا، هذا الاختبارليست حساسة مثل التمييز بين خلايا هرمة وغير هرمة يعتمد كليا على المراقب. نناقش هنا ل، وسريعة، وحساسية مقايسة على أساس الخلوي غير المستغلة لتقييم وجود خلايا هرمة الحية. ويستند هذا الاختبار على التحلل من جزيء نفاذية الغشاء، و5 dodecanoylaminofluorescein دى β-D-galactopyranoside (C 12 FDG)، بواسطة β-غالاكتوزيداز المخصب في خلايا هرمة. بعد التحلل والإثارة ليزر، وC 12 FDG تنبعث مضان أخضر، وبالتالي يمكن الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي 10، 11. الكشف عن خلايا هرمة عبر التدفق الخلوي يوفر ميزة كبيرة من كونها سريعة وحساسة. وبالإضافة إلى ذلك، والكشف عن خلايا هرمة بواسطة التدفق الخلوي يمكن أن يقترن مع الكشف عن علامات الخلوية الأخرى. هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لكشف خلايا هرمة ضمن مجموعة من السكان من الخلايا السرطانية تعامل مع العلاج الكيميائي ويمكن وضعها بشكل روتينيحتى على أقسام الأنسجة، بعد الخلوية التفكك، في العيادة.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-dodecanoylaminofluorescein di-&beta;-D-galactopyranoside </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-2893</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RPMI 1640 cell culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA Laboratories GmBH</td>
			<td>A15 101</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5290-018</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a sensitive method to quantify senescent cancer cells

الخلايا البشرية لا تتكاثر إلى ما لا نهاية. عند الإشارات الخارجية و / أو الجوهرية، قد تموت الخلايا أو إدخال مستقر الخلية اعتقال دورة تسمى الشيخوخة. وقد تبين أن العديد من الآليات الخلوية، مثل تقصير التيلومير والتعبير غير طبيعي من الجينات المسرطنة مولد للتفتل، أن تسبب الشيخوخة. لا يقتصر الشيخوخة للخلايا الطبيعية، وقد تم الإبلاغ أيضا عن الخلايا السرطانية إلى senesce. وقد ثبت أن الأدوية Chemotherapeutical للحث على الشيخوخة في الخلايا السرطانية. ومع ذلك، فإنه لا تزال موضع جدل ما إذا كانت الشيخوخة يمنع تكون الأورام أو يروج. كما أنه قد يكون في نهاية المطاف المريض محددة، سيتم قريبا المطلوبة طريقة سريعة وحساسة لتقييم الشيخوخة في الخلايا السرطانية. وتحقيقا لهذه الغاية، ومعيار فحص β-غالاكتوزيداز، والطريقة المستخدمة حاليا، ويعرض العوائق الرئيسية: فهو مضيعة للوقت وغير حساسة. نقترح هنا تدفق مقايسة على أساس الخلوي لدراسة الشيخوخة على لىهاء الخلايا. هذا الاختبار يوفر ميزة كونها سريعة وحساسة، ويمكن أن يقترن إلى الوسم المناعي من مختلف العلامات الخلوية.

وقد استخدم المايلوما المتعددة، وهو الورم الخبيث الدم، لتقييم الشيخوخة الناجمة عن إجراء chemotherapeutical. للقيام بذلك كان يعالج خط خلية MM المتاحة تجاريا (RPMI 8226) لأيام 2 مع دوكسوروبيسين، وهو دواء chemotherapeutical. وبعد ذلك تعرض الخلايا لعلاج bafilomycin A1 وكذلك حضنت مع C 12 FDG. وقد تم ت...

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells at JoVE.com

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

سواء الشيخوخة يمنع تكون الأورام أو يروج تبقى مثيرة للجدل. منذ المخدرات chemotherapeutical يمكن أن تحفز الخلايا السرطانية إلى senesce، ودراسة الشيخوخة أمر ضروري لاقتراح علاجات جديدة. ومع ذلك، فإن معيار وتستخدم على نطاق واسع فحص β-غالاكتوزيداز يعرض العوائق الرئيسية. نقترح هنا تدفق فحص السريع وحساسة القائم على الخلوي لتحديد الشيخوخة.

طريقة حساسة لقياس خلايا السرطان هرمة

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

a-sensitive-method-to-quantify-senescent-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

20.5K Views.  Université de Caen Basse-Normandie. سواء الشيخوخة يمنع تكون الأورام أو يروج تبقى مثيرة للجدل. منذ المخدرات chemotherapeutical يمكن أن تحفز الخلايا السرطانية إلى senesce، ودراسة الشيخوخة أمر ضروري لاقتراح علاجات جديدة. ومع ذلك، فإن معيار وتستخدم على نطاق واسع فحص β-غالاكتوزيداز يعرض العوائق الرئيسية. نقترح هن...

Video: A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. Conventional methods assess neurological deficits and electrophysiology and quantitative sensory testing quantifies functional alterations to detect neuropathy. However, the earliest damage appears to be to the small fibres and yet these tests primarily assess large fibre dysfunction and have a limited ability to demonstrate regeneration and repair. The only techniques which allow a direct examination of unmyelinated nerve fibre damage and repair are sural nerve biopsy with electron microscopy and skin-punch biopsy. However, both are invasive procedures and require lengthy laboratory procedures and considerable expertise. Corneal Confocal microscopy is a non-invasive clinical technique which provides in-vivo imaging of corneal nerve fibres. We have demonstrated early nerve damage, which precedes loss of intraepidermal nerve fibres in skin biopsies together with stratification of neuropathic severity and repair following pancreas transplantation in diabetic patients. We have also demonstrated nerve damage in idiopathic small fibre neuropathy and Fabry's disease.

Corneal Confocal microscopy is a non-invasive clinical technique which may be used to quantify C fibre damage to diagnose and stratify patients with increasing neuropathic severity.

متحد البؤر المجهري القرنية : رواية غير الغازية تقنيات لقياس الصغيرة الأمراض الليفية في اعتلال الأعصاب المحيطية

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

في الوقت الحقيقي المعاوقة الكهربائية تقنية تستند إلى قياس غزو أحادي الطبقة الخلية البطانية من قبل خلايا السرطان

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

برغي دليل بسيط أسلوب للدراسات طعم أجنبي داخل الجمجمة في الفئران

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

ثلاثة الثقافات الأبعاد: أداة لدراسة الهندسة المعمارية عادي عنيبية مقابل التحول السرطاني للخلايا الثدي

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

طريقة الحصول على خلايا سرطان المبيض الابتدائية من العينات الصلبة

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الخمول نموذج من الاستروجين تراعي سرطان الثدي في نخاع العظام: أداة للدراسات الآلية الجزيئية والجيل الفرضية

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

الاستفادة من الفحص لينة آجار مستعمرة تشكيل لالتعرف مثبطات Tumorigenicity في خلايا سرطان الثدي

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.