كيف تحافظ الخلايا على توازن البروتين ليست مفهومة جيدا في سياق الإجهاد الخلوي والشيخوخة. في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة بسيطة ودقيقة لحساب دوران البروتين ، وهو عنصر رئيسي في توازن البروتين في الخلايا الحية. يمنح Pulse SILAC المجرب القدرة على قياس دوران البروتين للبروتينات الفردية والبروتيوم بأكمله بطريقة عالية الإنتاجية تكون أيضا أكثر أصالة للأنظمة البيولوجية من الطرق الأخرى.
يمكن تطبيق مبادئ هذه الطريقة على أي نظام يمكن تصنيفه استقلابيا ، بما في ذلك الكائنات الحية بأكملها. يمكن أن تؤدي هذه الطريقة أيضا إلى رؤى حول الشيخوخة الخلوية والشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية. تحليل قياس الطيف الكتلي حساس للغاية لبعض الملوثات الكيميائية، مثل المنظفات.
استخدم كواشف LC-MS طوال هذا الإجراء لضمان جمع بيانات عالية الجودة. لبدء وضع العلامات الأيضية للخلايا ، استبدل الوسائط بثلاث لوحات لكل من الخلايا الشائخة والهادئة ب 30 ملليلتر من وسائط SILAC Light. بشكل منفصل ، استبدل الوسط بثلاثة ألواح قديمة وثلاث لوحات هادئة ب 30 ملليلتر من SILAC Heavy.
تنمو الخلايا لمدة ثلاثة أيام دون تغيير الوسط. لفصل الخلايا عن ألواح الاستزراع ، أضف خمسة ملليلترات من كاشف التربسين المسخن مسبقا إلى كل صفيحة واحتضن الألواح لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. في وقت لاحق ، أعد تعليق الخلايا المنفصلة في خمسة ملليلتر من نفس الوسائط المستخدمة في الزراعة إلى حجم إجمالي قدره 10 ملليلتر.
بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى الجليد وقم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 300 مرة G عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الكريات مرتين ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وإزالة supernatant قبل إعادة تعليق الكريات في 150 ميكرولتر من اليوريا الثمانية المولية الطازجة و 50 ملليمولار الأمونيوم بيكربونات العازلة. امزج محتوى الأنبوب عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
Aliquot 50 ميكروغرام من عينة البروتين في أنبوب جديد ويجلب عينات تصل إلى أحجام متساوية مع المخزن المؤقت للتحليل. ثم أضف ثنائي إيثيوثريتول إلى تركيز نهائي قدره 20 ملليمول إلى الأنبوب واحتضن العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز. اترك العينة لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل إضافة يودواسيتاميد إلى تركيز نهائي يبلغ 40 ملليمول واحتضانه في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
ثم قم بتخفيف العينة إلى أقل من اليوريا ذات المولي الواحد باستخدام مخزن مؤقت لبيكربونات الأمونيوم 50 ملليمولار. أضف ميكروغرام واحد من التربسين للحصول على 50 ميكروغرام من بروتين البدء أو بنسبة 1:50 التربسين إلى البروتين إلى العينة. احتضن العينة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لهضم البروتينات إلى ببتيدات.
في اليوم التالي ، أضف حمض الفورميك إلى 1٪ من حجم العينة لإخماد هضم البروتين. لتنظيف العينة، ضع خرطوشة استخراج ذات طور صلب على مشعب فراغ، باستخدام خرطوشة استخراج واحدة لكل عينة، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. بعد الاستخراج ، قم بإزالة عينات الببتيد من مشعب الفراغ وجففها تماما في مكثف فراغ.
يستغرق التجفيف حوالي ثلاث ساعات. بالنسبة لقياس الطيف الكتلي ، أو تحليل MS ، أعد تعليق عينة الببتيد بتركيز 400 نانوغرام لكل ميكرولتر في مخزن مؤقت لحمض الفورميك بنسبة 0.2٪. لإعادة إذابة الببتيدات ، اخلط العينة لمدة خمس دقائق.
ثم ، سونيك لمدة خمس دقائق في سونيكتور حمام مائي. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان ونقل المواد الفائقة الببتيد إلى قوارير MS. قدم العينات للتحليل البروتيني باستخدام مطياف الكتلة الترادفية الترادفية للكروماتوغرافيا السائلة ، أو LC-MS-MS.
استخدم الإعدادات الموصى بها للتحليل غير المستهدف بواسطة مرفق قياس الطيف الكتلي. قم بتحميل العينات على عمود تحليلي بمعدل تدفق يبلغ 400 نانولتر في الدقيقة لتزيل الببتيدات على مدى تدرج خطي مدته 90 دقيقة باستخدام مزيج من المذيبات العضوية وغير العضوية ، مع المذيبات العضوية التي تتراوح من 5 إلى 35٪ الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي في الوضع المعتمد على البيانات ، مع دورة مستمرة من عمليات مسح MS1 تليها 20 عملية مسح MS2 تعتمد على البيانات مع تجزئة HCD. حدد كميا مناطق ذروة الببتيد للببتيدات الثقيلة والخفيفة في أداة برنامج Proteome Quantitation.
ثم ، قم بتصدير مناطق ذروة الببتيد الثقيلة والخفيفة. لحساب عمر النصف للبروتين، افتح مصنف تحليل SILAC إلى الورقة الأولى المسماة Raw Data والصقها في معرفات UniProt وأسماء الجينات ومناطق الذروة الثقيلة والخفيفة في الأعمدة المشار إليها. بعد ذلك، افتح الورقة الرابعة المسماة تحليل وأزل الصفوف التي يشير فيها العمودان G وH إلى أن العينة خارج النطاق واحتفظ بالصفوف التي تقرأ داخل النطاق.
تم التحقق من صحة الأنماط الظاهرية الشائخة باستخدام نشاط بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة وتحليل RT-qPCR. بالنسبة لنشاط بيتا غالاكتوزيداز ، ظهرت الخلايا الشائخة باللون الأزرق ، في حين أن خلايا التحكم الهادئة لم يكن لها لون أو الحد الأدنى. في تحليل RT-qPCR ، أظهرت الخلايا الشائخة أعلى إنترلوكين-6 ، CXCL8 ، و CDKN1A-P21 mRNAs مقارنة بالخلايا الهادئة.
وعلى العكس من ذلك، كان مستوى ترميز اللامين B1 لعلامة الانتشار منخفضا أو غائبا في الخلايا الشائخة. كشفت كروماتوغرام الأيونات المستخرجة من الببتيدات عن النسبة النسبية لإشارات الببتيد الثقيلة والخفيفة. وتشير نسبة أقل من إشارات الببتيد الثقيلة بالنسبة للخلايا الشائخة الخفيفة إلى معدل دوران أبطأ للبروتين، وتشير إشارة الببتيد الثقيلة الأعلى بالنسبة للضوء إلى معدل دوران أسرع للبروتين.
أظهرت العينات غير المصنفة إشارة ببتيد ثقيلة قليلة أو معدومة. تم حساب نصف العمر ل 695 بروتينا تم تحديدها من تحليل مطياف الكتلة. تم الإبلاغ عن نصف العمر كنسبة سجل اثنين من الشيخوخة على الخلايا الهادئة ورسمت في مؤامرة بركان.
بعد حساب معدلات دوران البروتين في الخلايا الشائخة ، قد يكشف التحليل النهائي عن مسارات بيولوجية مرشحة تنظمها آليات البروتين. مهد Pulse SILAC الطريق للباحثين لدراسة ديناميكيات البروتين بدقة وإنتاجية غير مسبوقة ، مما مكننا من دراسة التغيرات في توازن البروتين في العديد من البروتينات الفردية.
