المؤلفان بالشكر أنجيلا بوستا للحصول على المساعدة مع الزرد تربية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (AG-020591 إلى SVB و1K08AR054835 إلى JJD).

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الزرد وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة واللوائح، والهيئات التنظيمية. وقد وافق جميع الإجراءات استخدام الحيوان هو موضح في هذا المقال من قبل جامعة ميشيغان اللجنة على استخدام ورعاية الحيوانات (UCUCA). 1. جعل الحلقات خياطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لفصل خياطة غير معقمة (USP 10/0 حيدة النايلون، 3 رقائق) إلى ثلاثة فروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البدء في ربط عقدة مزدوجة الذراع في واحدة من فروع. وقف قبل تشديد عقدة تماما لجعل صغيرة حلقة (~ 1 ملم قطر) بدلا من عقدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص لقطع الدرز الزائدة من ذيول حلقة. ويرد مثال من حلقة انتهت في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حلقة على الجانب زجة من بعد أن لاحظ لاستخدامها لاحقا. وسوف تستخدم الحلقات خياطة لعقد اليرقات في مكان أثناء اختبار قوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،1-1،4 عند الضرورة. MAKه اثنين من الحلقات خياطة لكل يرقة التي سيتم اختبارها. </li></ol> 2. جعل الحل اختبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل Tyrodes حل بإضافة 7.977 غرام كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم 0.373 غرام، 0.265 غرام الكالسيوم ثنائي هيدرات كلوريد، 0.102 غرام هيدرات كلوريد المغنيسيوم، 0.048 غرام صوديوم فوسفات أحادى، 1.000 غرام بيكربونات الصوديوم، و0.037 ز ethylenediaminetetraacetic حامض الصوديوم تبلور الملح إلى 1،000 مل من المياه النقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك الحل حتى تذوب تماما الأملاح. ويمكن تخزين هذا الحل لمدة شهر على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.1 مل من 4 ملغ / مل تريكين، الذي أعد وفقا لالزرد كتاب 24، إلى 47.9 مل Tyrodes حل والمزيج. حماية هذا الحل من ضوء عن طريق تخزينه في زجاجة داكنة أو في زجاجة مغطاة بورق الألومنيوم. يجب أن يتم تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة وأدلى الطازجة كل يوم. </li></ol> 3. ربط اليرقة Aanesthetized إلى غرفة التجريبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;لى&gt; ضع جهاز الفحص (الشكل 2) على مسرح المجهر ستيريو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتوصيل محول القوة وكابلات تحكم طول لجهاز الفحص. بدوره على محول القوة. بدوره على وحدة تحكم طول بحيث يظل جامدة. (ملاحظة:. يوفر وحدة تحكم طول القدرة على تمدد أو تقصير إعداد العضلات خلال الانكماش ومع ذلك، لا يتم استخدام هذه الميزة للتحكم في طول الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة لذلك، وحدة تحكم طول يمكن اعتبار كمرفق جامدة النقطة التي شنت على نظام تحديد المواقع XYZ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ماصة نقل القابل للتصرف، وملء الغرفة التجريبية مع حل الاختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لالتقاط حلقة خياطة من قبل واحدة من ذيول وتعلقها على أنبوب محول القوة. شنق حلقة خياطة الثاني على أنبوب تعلق على وحدة تحكم طول. (ملاحظة: تجتاح حلقة خياطة على الجزء المنحني يمكن شبك خياطة والكمنولثحد ذاتها لكسر أثناء الخطوات اللاحقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ماصة نقل القابل للتصرف، ونقل اليرقة الزرد إلى طبق بتري صغيرة مليئة حل الاختبار. انتظر مخدر في حل اختبار (تريكين) نافذة المفعول (~ 1 دقيقة). مع ملقط، دفع بلطف الذيل والتحقق من أن يرقة هو تخدير بسبب عدم وجود لمسة أثار السباحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة الزجاج لنقل يرقة إلى الغرفة التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بواسطة بايعاز بلطف اليرقة مع ملقط مغلقة، وتوجيه الجزء الأمامي من اليرقة خلال الحلقة خياطة على أنبوب محول القوة. توجيه الجزء الأمامي من اليرقة خلال الحلقة خياطة على أنبوب. فهم على حد سواء ذيول حلقة خياطة مع ملقط وسحب منها في وقت واحد لإحكام حلقة خياطة الخلفي للكيس المح أو swimbladder (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملقط، عقد واحد خياطة الذيل حلقة وسحب، مما تسبب اليرقة إلى 90 درجة قطب حول الأنبوب حتى الجانب الوحشي من الوجه يرقةمتروك (الشكل 3B). إذا تم تشديد حلقة بما فيه الكفاية، وسوف يكون هناك بعض المقاومة إلى سحب، وينبغي اليرقة لا قطب بسهولة. إذا تم تشديد حلقة كثيرا، وسوف اليرقة لا قطب حول الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جهاز تحديد المواقع XYZ تعلق على طول تحكم، حرك أنبوب تحكم طول على طول محور X (التعاريف محور في الشكل 2A) وتحت الجذع والذيل من يرقة. ترك مسافة بين طرفي أنبوب تحكم طول وأنبوب محول القوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه حلقة خياطة أكثر من ذيل اليرقة وتشديد حلقة خياطة كما هو موضح سابقا (الشكل 3C). قد تحتاج إلى تدوير الجزء الخلفي من يرقة بحيث تواجه الجانب الوحشي حتى. تقليم ذيول حلقة خياطة (الشكل 3D). </li></ol> 4. اليرقة موقف في غرفة التجريبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل يرقة لمسافة مناسبة من أسفل غرفة لضمان ث يرقةيكون مريضا داخل &quot;العمل عن بعد&quot; من هدف مجهر مقلوب خلال الخطوات اللاحقة. لإنجاز هذا، استخدام أجهزة تحديد المواقع XYZ لخفض ببطء أنابيب (مع يرقة المرفقة) على طول محور Z-حتى أنابيب مجرد تلمس الجزء السفلي من الغرفة. ثم، ورفع أنابيب حتى اليرقة هو على مسافة مناسبة من أسفل غرفة (~ 100 ميكرون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جهاز تحديد المواقع XYZ تعلق على وحدة تحكم طول، وضبط أنبوب تحكم طول على طول المحور Y لمحاذاة المحور الطويل لليرقة مع محور طويل من الأنبوب محول القوة. </li></ol> 5. قوة سجل خلال الانكماش نشل القصوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جهاز الفحص إلى مرحلة مجهر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة حرارة غرفة إلى القيمة المطلوبة. للبدء، قم بتوصيل دائري ماء الحمام، ميزان الحرارة، وتحكم في درجة الحرارة لجهاز الفحص. بدوره على المكونات الضرورية وضبط الإعداد على درجة الحرارة مقاولاتoller حتى ميزان الحرارة تقارير القيمة المطلوبة. وقد تم جمع البيانات الواردة في هذه المقالة عند 25 درجة مئوية، ولكن يمكن أيضا أن إجراء قياسات في RT أو في 28.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الكابلات من محفز لجهاز الفحص. بدوره على السلطة إلى محفز ولكن لا تحفز اليرقة حتى الخطوة 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من اليرقة موازية للأسفل القاعة. من خلال الهدف 40X، عرض جزء من اليرقة بين نهايات الأنابيب. إذا موازية لأسفل، وسوف طرفي يرقة يكون في التركيز. إذا لزم الأمر، وضبط أنبوب محول القوة على طول المحور Z حتى طرفي هي في التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من أن طول اليرقة هو أقصر من المستوى الأمثل. بدوره على نظام قسيم عضلي طول الفيديو وتدوير كاميرا الفيديو مثل أن التصدعات موازية لجانبي الإطار الفيديو. هذا النظام يراقب تباعد العتابي من خلال تحليل الاختلافات في كثافة بكسل على طول كل صف أفقي من بكسل داخل المنطقة المعرفة من قبل المستخدم من الفائدة(ROI). وبلغ متوسط ​​النتائج لجميع الصفوف داخل ROI وذكرت مع تردد يعادل الفيديو معدل الإطار (≥ 80 ثانية -1). يتم استخدام تباعد العتابي كمؤشر على طول قسيم عضلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط المجهر التركيز على الألياف الطرفية ثم لاحظ طول قسيم عضلي المشار إليه. إذا لزم الأمر، استخدم جهاز تحديد المواقع XYZ تعلق على وحدة تحكم لضبط طول طول اليرقة (X-محور) حتى طول قسيم عضلي أقل من المستوى الأمثل (على سبيل المثال 1.90 ميكرون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التحفيز الحالية لتحسين قوة نشل. للبدء، تعيين الانتاج الحالي على محفز لحجم منخفض (مثل 100 مللي أمبير). يمكن أن تسبب مشجعا يدويا أو بواسطة جهاز كمبيوتر تشغيل برنامج ابفيف العرف. استثارة للعضلات نشل اليرقات مع نبض الحالية من 0.2 ميللي ثانية في المدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الذبذبات لتسجيل الإخراج القوة وقياس قوة نشل ذروة استخدام المؤشرات والذبذبات و. زيادة التيارزيادات بنسبة 50 مللي أمبير وقياس قوة نشل الذروة في كل مستوى الحالي. انتظر 30 ثانية بين تشنجات لمنع التعب. كما يزيد من التحفيز الحالية، قوة نشل الذروة يزيد عادة إلى حد أقصى ثم يتناقص تدريجيا. التيار الذي اليرقة يولد أعظم قوة هو التيار التحفيز الأمثل. تعيين السعة الحالية للتيار التحفيز الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جهاز تحديد المواقع XYZ، وضبط طول اليرقة (وبالتالي، طول قسيم عضلي) من أجل انتزاع قوة نشل أقصى. البرية من نوع اليرقات الزرد (3-7 DPF) توليد قوة نشل أقصى في أطوال قسيم عضلي من 2.10 ميكرومتر أو 2.15 ميكرومتر. ومع ذلك، فإن طول قسيم عضلي يمكن تعيين إلى 2.08 ميكرون إلى تجنب إجهاد الزائد على يرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استثارة للعضلات نشل اليرقات. استخدام الذبذبات لتسجيل استجابة القوة وحفظ السجل لتحليلها لاحقا. </li></ol> 6. قياس الأبعاد مع الجهاز العضلي اليرقة في طول الأمثل <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جهاز الفحص عودة إلى مجهر ستيريو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقياس العدسة، وقياس ارتفاع الجهاز العضلي كما ينظر اليها من الجانب. ثم، مع الحرص على عدم تغيير طول اليرقة، قطب اليرقة بنسبة 90 ° باستخدام ذيول حلقة خياطة من أجل عرض يرقة من القاع. قياس عرض عضلات كما ينظر إليها من الأسفل. أخذ القياسات في معلما التشريحية (على سبيل المثال افتتاح البولي التناسلي) (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الحلقات خياطة مع microblade للافراج عن يرقة من معدات الاختبار. </li></ol>

<ol>
	<li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo.">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).</li><li>Nixon, S. J., Wegner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease;+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning.">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14 (13), 1727-1743 (2005).</li><li>Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+&#945;2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin &#945;2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> PNAS. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Hirata, H., Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect,+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease.">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134, 2771-2781 (2007).</li><li>Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+myotubularin+function+results+in+t-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy.">Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372 (2009).</li><li>Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+zebrafish+feature+aspects+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+pathology.">Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 20 (12), 826-832 (2010).</li><li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies.">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum. Mol. Genet. 19 (4), 623-633 (2010).</li><li>Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUX4,+a+candidate+gene+for+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy,+causes+p53-dependent+myopathy+in+vivo.">DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo.</a> Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).</li><li>Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+dissection+of+laminin-receptor+interactions+in+dystrophic+zebrafish+muscle.">Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle.</a> Hum. Mol. Genet. , (1093).</li><li>Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> PNAS. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li><li>Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exon-skipping+strategies+for+Duchenne+muscular+dystrophy+utilizing+dystrophin-deficient+zebrafish.">Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish.</a> J. Cell Mol. Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).</li><li>Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Pax7+expressing+myogenic+cells+in+zebrafish+muscle+development,+injury,+and+models+of+disease.">Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease.</a> Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).</li><li>Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Kn&#246;ll, R., Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+integrin-linked+kinase+is+required+in+skeletal+muscles+for+strengthening+the+integrin-ECM+adhesion+complex.">Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex.</a> Dev. Biol. 318 (1), 92-101 (2008).</li><li>Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+function+for+perlecan+in+skeletal+muscle+and+cardiovascular+development.">A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development.</a> J. Cell Biol. 181 (2), 381-394 (2008).</li><li>Kim, H. R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protein+TGFBI+promotes+myofibril+bundling+and+muscle+fibre+growth+in+the+zebrafish+embryo.">The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).</li><li>Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHAP+is+a+newly+identified+Z-disc+protein+essential+for+heart+and+skeletal+muscle+function.">CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function.</a> J. Cell Sci. 123 (7), 1141-1150 (2010).</li><li>Huang, H., Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity,+uptake+kinetics+and+behavior+assessment+in+zebrafish+embryos+following+exposure+to+perfluorooctanesulphonicacid+(PFOS).">Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS).</a> Aquat. Toxicol. 98 (2), 139-147 (2010).</li><li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers.">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li><li>Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+of+the+environmental+pollutant+4-nonylphenol+in+zebrafish.">Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish.</a> Neurotoxicol. Teratol. 33 (6), 752-764 (2011).</li><li>Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+embryonic+red+and+white+muscle+fibers+during+fictive+swimming+in+the+developing+zebrafish.">Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 87 (3), 1244-1251 (2002).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135 (4), 1115-1127 (2012).</li><li>Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+skeletal+muscle+in+zebrafish+early+larvae.">Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae.</a> J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+weakness+during+tricaine+anesthesia.">Muscle weakness during tricaine anesthesia.</a> Comp Biochem Physiol Part C. 110 (3), 289-296 (1995).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+of+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

يقيس هذا الأسلوب في توليد القوة أثناء نشل لتقييم وظيفة عضلة في عضلات الجذع من اليرقات الزرد. على الرغم من تقلصات كزازي يمكن استخلاصها في اليرقات الزرد (على سبيل المثال بنسبة 200 التحفيز البقول / ثانية لمدة 0.2 ثانية)، القوة كزازي الحد الأقصى هو فقط 10-15٪ أكبر من قوة نشل أقصى. ولذلك، فإن القوة المتولدة أثناء نشل هو مقياس معقول من القدرة على توليد قوة. ويفضل أكثر من تشنجات تقلصات كزازي بسبب تشنجات هي أقل احتمالا للتسبب تمزيق أو الانزلاق في العلاقات خياطة. من أجل توليد بيانات ذات مغزى مع هذه التقنية، ينبغي أن يتحقق قوة نشل أقصى لكل يرقة وينبغي التقليل من التباين بين المجموعات التجريبية. مع هذه الأهداف في الاعتبار، ونحن نقدم الاقتراحات التالية. الأول، اتخاذ الحذر عند ربط اليرقة إلى محول القوة وأنابيب تحكم طول. إذا يتم شد الحلقات خياطة جدامن ذلك بكثير، فإن خياطة قطع طريق الأنسجة العضلية. إذا لم يتم إحكام حلقات خياطة بما فيه الكفاية، والقوة المتولدة من يرقة لن تنتقل بالكامل إلى محول القوة. كلتا الحالتين، ولكن خصوصا الأخير، نقلل من قوة نشل أقصى. الثانية، منذ اختبار مجموعات تجريبية متعددة يمكن أن يستغرق عدة ساعات (20-30 دقيقة / يرقة)، بالتناوب بين المجموعات لأن يرقات سوف تستمر في النمو خلال فترة الاختبار. في حين أن بعض المعدات المذكورة أمر ضروري لقياس القوة نشل أقصى (على سبيل المثال محول القوة، مشجعا الحالية)، والبنود الأخرى ليست ضرورية على الإطلاق. وقسيم عضلي نظام طول الفيديو هو مرغوب فيه ولكن ليس المطلوب. وكبديل لذلك، سلسلة من تشنجات يمكن استخدامها للعثور على طول الأمثل، وخلالها يتم ضبط طول اليرقة حتى يتم تحقيق أقصى قدر من قوة نشل. نظام التحكم في درجة الحرارة هو أيضا ليس ضروريا على الاطلاق. التحكم في درجة الحرارة أمر بالغ الأهمية عندما MEAsuring حركية نشل، التي تعتبر حساسة للغاية لدرجة الحرارة، في حين أن قوة نشل أقصى ليست حساسة بشكل خاص للتغيرات طفيفة في درجة الحرارة ويمكن أن يقاس في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أنه بغض النظر عن درجة الحرارة في مقصورة خلال اختبار القوة، ينبغي الحفاظ على اليرقات في درجة الحرارة المثلى للنمو من 28.5 ° C 24 قبل فرض اختبار لانطلاق دقيقة. ويتم اختبار اليرقات في حل Tyrodes تحتوي على تريكين. نحن نستخدم 0.02٪ (W / V) تريكين، وتركيز أوصى للتخدير 24، للقضاء على تقلصات عفوية أثار من قبل الجهاز العصبي، وبالتالي منع التعب أثناء اختبار قوة. يسهل تريكين أيضا التعادل في خطوة ويقلل من وقت الاختبار الشامل. ومع ذلك، فإننا نلاحظ أن تريكين بما في ذلك في حل الاختبار باستمرار يقلل من قوة نشل أقصى ما يقرب من 30٪. كما لوحظ تأثير مماثل في العضلات الذيل الشرغوف، حيث tricaiشمال شرق خفض توليد قوة بعد أن منعت انتقال العصبية والعضلية، مما يوحي بأن تريكين له تأثير مباشر على العضلات 25. تريكين قد يقلل من استثارة الخلايا العضلية عن طريق الحد من تصرف الصوديوم عبر غشاء الخلية، كما هو الحال في الخلايا العصبية 26. خيارات أخرى لمنع تفعيل من قبل العصبونات الحركية هي D-توبوكورارين وα-بنغاروتوكسين ولكن، على عكس تريكين، هذه المركبات ليست قابلة للاختراق الجلد، ويجب أن يتم حقنه مباشرة في الرأس والحبل الشوكي، أو قلب 27. سوف تحتاج المحققين الفردية لتقييم ما إذا كان أو لا تريكين أمر مرغوب فيه لتطبيقها محددة. إذا تم تضمين تريكين في حل الاختبار، ويجب أن يكون تركيز متسقة بين التجارب والباحثين وينبغي التحقق من أن تأثير تريكين لا تختلف بين المجموعات التجريبية. وصفنا هذه الطريقة ليرقات لا تزيد أعمارهم عن 3 DPF وقديمة قدم 7 DPF. على الرغم من ألياف العضلات يبدو أن فوnctional في أقرب وقت 17 ساعة بعد الإخصاب، عندما تبدأ حركات عفوية ذيل 27، وطول قصيرة من الذيل قبل يعيق 3 DPF ربط اليرقة إلى معدات الاختبار. نحن عادة لا اختبار اليرقة بعد 7 DPF منذ العديد من النماذج المرض لا يعيش لفترة أطول بكثير من هذا الوقت. إذا اختبار اليرقات خارج 5 DPF، ويجب أن تغذى اليرقات. وقد لاحظنا أن اليرقات unfed ديك العضلات الصغيرة وتوليد قوة نشل أقل من الحد الأقصى لتغذية اليرقات، على الأرجح بسبب تناقص الكيس المحي. وبالتالي قد يكون من المرغوب فيه لاختبار اليرقات بين 3-5 DPF، لتجنب متغير إضافية من التغذية الخارجية. وباختصار، نحن تصف طريقة الكمي وموثوق بها لقياس قوة جيل خلال انكماش نشل القصوى من الزرد العضلات الجذع اليرقات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم الصحة العامة للعضلة اليرقات الزرد وعلى وجه التحديد المعلومات حول وظيفة العضلات. بالإضافة إلى توفير المعلومات حولحجم توليد القوة، وهذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة حركية جيل القوة أو تكييفها لدراسة العضلات والتعب 22. على الرغم من أننا وصف هذه التقنية للاستخدام مع البرية من نوع اليرقات، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في يرقات المعدلة وراثيا أو ليرقات تعامل مع العقاقير أو المواد السامة، لتوصيف نماذج مرض في العضلات وتقييم العلاجات، أو لدراسة تنمية العضلات، اصابة في العضلات، أو العضلات المتصلة السمية الكيميائية.

يتم التعرف على نحو متزايد الشباب الزرد (دانيو rerio) اليرقات، 3-7 أيام بعد الإخصاب (DPF)، كما كائن مفيد للبحوث العضلات والهيكل العظمي. وتستخدم اليرقات الشباب إلى نموذج الإنسان مرض في العضلات 1-9، وتقييم العقاقير والاستراتيجيات العلاجية 10-11، الدراسة 12 اصابة في العضلات، فهم العضلات التنمية 13-16، والتحقيق في العضلات المتصلة السمية الكيميائية 17-19. دراسات نموذجية في هذه المناطق فحص الدرجة التي يتم تقديمها العضلات صحية غير طبيعية من خلال التلاعب وراثية أو التعرض للسميات، وبعض الدراسات دراسة الدرجة التي يستجيب العضلات غير طبيعية للعلاج. بالغ الأهمية لنجاح هذه الدراسات هو القدرة على تقييم دقيق الصحية العضلات. في حين أن هناك مجموعة متنوعة من الطرق المتاحة لتقييم صحة العضلات في اليرقات الزرد، وعدد قليل تقديم معلومات مباشرة حول وظيفة العضلات. عادة ما يتم تقييم الحالة الصحية للعضلات من قبل appearancه، وفقا لتقييم تلطيخ النسيجية 6،8،11، المناعية 9،15،16،18، المجهر الضوئي 3،13، والإلكترون المجهري 3،4،14،16، أو الانكسار 7،9،11، ولكن هذه التقنيات توفير المعلومات الصرفية فقط. الجذع والتشريد الذيل وسرعة السباحة 4،17 تقييم وظيفة الحركة، ولكن هذه ليست التدابير المباشرة من وظيفة العضلات نظرا لأنها تعكس أيضا المدخلات العصبية، والتمثيل الغذائي والطاقة، وغيرها من العمليات. في المقابل، قياس توليد القوة خلال الانكماش يوفر التقييم المباشر من وظيفة العضلات ويمثل مقياسا لصحة العضلات بشكل عام. فوائد إضافية من هذا النهج يشمل تحليل البيانات واضحة والنتائج الكمية. في هذه المقالة الفيديو، ونحن نقدم إجراءات مفصلة لقياس توليد القوة من قبل العضلات اليرقات، على أمل أن المزيد من الباحثين سوف تستخدم هذا الأسلوب لتكمل التدابير القائمة من صحة العضلات في أبحاثهم. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; ويتمثل الهدف العام من هذا الأسلوب هو لقياس قوة الجيل أثناء انقباض عضلة الجذع الزرد اليرقات. لتحقيق هذا الهدف، اليرقة الزرد هو تخدير، ووضع في غرفة مليئة محلول ملحي. ويرتبط نهاية الأمامي من اليرقة إلى محول القوة وقيدت نهاية الخلفي من يرقة إلى وحدة تحكم طول. ويتم إنجاز تنشيط العضلات عن طريق تحفيز الحقل الكهربائي، ويتم ضبط الحالي التحفيز وطول اليرقة لإنتاج قوة نشل أقصى. وأثارت انكماشا نشل متساوي القياس ويتم تسجيل استجابة قوة للتحليل. أن تكون واضحة، وهذا الأسلوب لا يقيس القوات التي تولدها عضلات اليرقات أثناء السباحة. لأن ترتبط طرفي اليرقة إلى معدات ولأن يرقة يبقى تخدير، فإنه لا يمكن الشروع في الحركة أثناء الاختبار. وعلاوة على ذلك، والتحفيز حقل ينشط جميع ألياف العضلات في نفس الوقت للحث على مليارانكماش ateral، الذي ليس هو ما يحدث بشكل طبيعي 20. لذلك، بدلا من قياس القوى الفعلية المتولدة أثناء السباحة، وهذا الأسلوب يحدد قدرة توليد قوة عضلات اليرقات. وقد استخدمنا هذه التقنية لإثبات ضعف العضلات في نموذج الزرد من اعتلال عضلي خيطي 21، وكذلك لتقييم تأثير العلاج المضادة للأكسدة على وظيفة العضلات في نموذج الزرد من مرض متعدد minicore 22. وقد استخدمت تقنية مماثلة الآخرين 23 لدراسة الآثار المترتبة على الملوثات البيئية على وظيفة العضلات 19.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonsterile-suture</td>
			<td>Ashaway Line &amp; Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td>USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vannas</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td>Illuminated with Fostec EKE ACE I light source</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>400A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Length controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>318B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>XYZ positioning devices</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Cut end to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-11YZ </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Axiovert 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Water bath circulator</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Alpha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>701C</td>
			<td>High-power, follow stimulator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Video sarcomere length system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>900B-5A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Nicolet Technologies</td>
			<td>ACCURA 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-13</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data analysis software (Signo)</td>
			<td>Alameda Applied Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae

اليرقات الزرد تقديم نماذج من تنمية العضلات، وأمراض العضلات والعضلات المتصلة السمية الكيميائية، ولكن غالبا ما تفتقر إلى الدراسات ذات الصلة تدابير وظيفية للصحة العضلات. في هذه المقالة الفيديو، ونحن يبرهن على وجود طريقة لقياس قوة الجيل أثناء انقباض عضلة الجذع الزرد اليرقات. يتم إنجاز قياسات القوة عن طريق وضع اليرقة تخدير في غرفة مليئة محلول ملحي. ويرتبط نهاية الأمامي من اليرقة إلى محول القوة وقيدت نهاية الخلفي من يرقة إلى وحدة تحكم طول. وأثارت انكماشا نشل متساوي القياس عن طريق تحفيز الحقل الكهربائي ويتم تسجيل استجابة قوة للتحليل. جيل القوة خلال الانكماش يوفر مقياسا لصحة العضلات عموما وعلى وجه التحديد على قدر من وظيفة العضلات. على الرغم من أننا وصف هذه التقنية للاستخدام مع البرية من نوع اليرقات، ويمكن استخدام هذه الطريقة مع يرقات المعدلة وراثيا أو مع يرقات تعامل مع العقاقير أو المواد السامة،لتوصيف نماذج مرض في العضلات وتقييم العلاجات، أو لدراسة تنمية العضلات، والإصابة، أو السمية الكيميائية.

في صحية من النوع البري اليرقات الزرد، يجب أن تكون الألياف العضلية موازية لبعضها البعض دون ثغرات كبيرة بينها وبين ديك التصدعات واضح (الشكل 5A). يجب التخلص من النوع البري اليرقات الزرد التي لا تظهر هذه الميزات، أو يعانون من تلف واضح مثل ألياف منفصلة (الشكل 5B)،. ويرد مؤامرة ممثل القوة نشل الذروة مقابل التحفيز الحالية ليرقة واحدة الزرد في الشكل (6). لمن النوع البري اليرقات الزرد بين 3-7 DPF، والحالي التحفيز الأمثل هو عادة بين 400-600 مللي أمبير، مع 3 DPF اليرقات التي تتطلب عموما أكبر التحفيز الحالية من 6-7 يرقات DPF. البيانات قوة الخام (التي تم جمعها خلال الخطوة 5.8) لابد من معالجتها وتحليلها مع برامج تحليل البيانات. أولا، يتم تعيين خط الأساس من المحضر قوة الى نقطة الصفر. ثانيا، يتم تحويل الجهد الناتج من محول القوة لإجبار (مN) (انظر تعليمات الشركة الصانعة لإنشاء منحنى المعايرة لمحول القوة). ويرد ردا قوة ممثل جمعها خلال انكماش نشل القصوى من يرقة واحدة في الشكل 7. برامج تحليل البيانات يمكن أن تستخدم لقياس ذروة القوة والميزات الأخرى للاستجابة قوة. يتم عرض مجموعة تمثيلية من بيانات القوى الذروة من تقلصات نشل القصوى في الشكل 8A. نموذجي ذروة القيم قوة نشل لمن النوع البري 3-7 DPF مجموعة اليرقات 0،9-1،7 مليون، مع اليرقات الأكبر سنا توليد المزيد من القوة من اليرقات الأصغر سنا. يمكن أن الاختلافات في قوة نشل الذروة يكون راجعا إلى العمليات العادية مثل النمو والتنمية (الشكل 8) أو عمليات غير طبيعية مثل الجينات علم الأمراض المتصلة طفرة 21،22. تطبيع من قبل العضلات منطقة مستعرضة (CSA) يمكن استخدامها لتحديد الدرجة التي الاختلافات في قوة نشل الذروة هي ببساطة بسبب اح<html> الامتحانات التنافسية الوطنية في حجم عضلات 21،22. ويمكن تقدير CSA العضلات باستخدام الصيغة: CSA = π (A / 2) (ب / 2)، حيث A هو ارتفاع الجهاز العضلي كما ينظر اليها من الجانب، B هو عرض عضلات كما ينظر إليها من أسفل، ويفترض على المقطع العرضي بيضاوي الشكل. القيم النموذجية لCSA البرية من نوع 3-7 DPF مجموعة اليرقات 0،027-0،034 مم 2، 3-4 مع يرقات DPF تظهر عموما القيم CSA أصغر من 5-7 يرقات DPF. يتم عرض مجموعة تمثيلية من تطبيع بيانات القوى الذروة من تقلصات نشل القصوى في 8B الشكل. نموذجي تطبيع الذروة القيم قوة نشل لمن النوع البري 3-7 DPF مجموعة اليرقات 34-51 مليون / مم 2، 4-7 مع يرقات DPF تظهر عموما القيم أكبر من 3 DPF اليرقات. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig1.jpg" /> الشكل 1. نقطة حلقة خياطة. سهام إلى ذيول حلقة خياطة. ve_content &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2.jpg" /> الشكل 2. (A) جهاز الفحص مع مكونات المسمى. (ب) آراء عن قرب للغرفة التجريبية (أ) غرفة التجريبية مع أسفل شفافة. (ب) محول القوة. (ج) وحدة تحكم طول. (د) أجهزة تحديد المواقع XYZ. يتم تعريف X، Y، Z والفؤوس في الزاوية اليمنى العليا. (ه) نظام التحكم في درجة الحرارة باستخدام وحدات الحرارية. أنابيب يستوعب تدفق المياه للتبريد وحدات الحرارية. (و) غير القابل للصدأ أنابيب الصلب تعلق لإجبار محول. (ز) غير القابل للصدأ أنابيب الصلب المرفقة إلى وحدة تحكم طول. (ح) مسبار مجهري ميزان الحرارة. (ط) البلاتين أقطاب لوحة موازية، والتي تمتد على طول الغرفة. لوحات البلاتين 2.5 ملم عالية و0.255 مم. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3.jpg" /> الشكل (3). ربط اليرقة إلى الغرفة التجريبية. (A) اليرقة تعادل في في نهاية الأمامي ولكن ليس استدارت حتى الآن 90 درجة. (B) اليرقة بعد استدارت 90 °. (C) اليرقة تعادل في في نهاية الخلفي ولكن ليس استدارت حتى الآن. (D) بعد اليرقة يتم قطع ذيول حلقة استدارت وخياطة. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4.jpg" /> الشكل 4. قياسات مستعرضة تقدير المنطقة. الجهاز العضلي كما ينظر اليها من (A) والجانب (B) </stron<html> ز&gt; أسفل. موضع الحانات الحمراء تشير إلى موقع افتتاح البولي التناسلي. طول الحانات الحمراء تشير إلى ارتفاع وعرض الجهاز العضلي كما ينظر اليها من الجانب وأسفل على التوالي. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5.jpg" /> الشكل 5. عرض الوحشي من الزرد اليرقات عضلات الجذع. (A) الأنسجة السليمة. (B) الأنسجة مع تلف واضح. يتم وضع علامة التقلصات الناتجة عن مفارز الألياف مع العلامات النجمية. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig6.jpg" /> الشكل (6). مؤامرة ممثل القوة نشل الذروة مقابل التحفيز الحالية. التيار التحفيز الأمثل هو 500 مللي أمبير. E = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig7.jpg" /> الرقم 7. وقد أثارت سجل القوة ممثل للانكماش نشل واحدة. هذا الانكماش مع نبض التحفيز في 0 مللي ثانية. قوة ذروة 1.56 مليون. <img alt="الرقم 8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8.jpg" /> الرقم 8. بيانات القوى ممثل 3-7 DPF اليرقات. (A) بيانات القوى الذروة من تقلصات نشل القصوى. (B) بيانات القوى الذروة من تقلصات نشل القصوى لتطبيع CSA. كانوا من كبار السن اليرقات (6-7 DPF) بنك الاحتياطي الفيدرالي Hatchfry Encapsulon الصف 0 مع سبيرولينا (الفضي المختبرات) اعتبارا من يوم 5 DPF. الوسائل + يتم الإبلاغ عن الانحرافات المعيارية مع N = 5 في كل مجموعة. يشار إلى مجموعات مختلفة بشكل ملحوظ من 3 يرقات DPF (*) و 4 يرقات DPF (#) (أنوفا، P &lt;0.05). الزيادة الكبيرة في قوة تطبيع بين 3 و 4 DPF (B) يدل على وجود زيادة في القوة الجوهرية قدرة توليد خلال هذه الفترة الزمنية، في حين وتعزى الزيادة في القوة بين 4 و 6-7 DPF (A) إلى النمو على أساس لا تغيير 4-7 DPF في قوة تطبيع.

Watch this Scientific Journal Video about Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

قياسات القوة يمكن أن تستخدم لإظهار التغيرات في وظيفة العضلات نتيجة للتنمية، والإصابة، والمرض، والعلاج أو السمية الكيميائية. في هذا الفيديو، ونحن يبرهن على وجود طريقة لقياس قوة خلال انكماش القصوى من الزرد العضلات الجذع اليرقات.

قياس القوة خلال تقلص العضلات لتقييم وظيفة في يرقات اسماك الزرد

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

force-measurement-during-contraction-to-assess-muscle-function

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Views.  University of Michigan. قياسات القوة يمكن أن تستخدم لإظهار التغيرات في وظيفة العضلات نتيجة للتنمية، والإصابة، والمرض، والعلاج أو السمية الكيميائية. في هذا الفيديو، ونحن يبرهن على وجود طريقة لقياس قوة خلال انكماش القصوى من الزرد العضلات الجذع اليرقات.

Video: Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

عالية الدقة قياس سلوك رائحة يحركها يرقات ذبابة الفاكهة في

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

باستخدام optokinetic استجابة لدراسة وظيفة البصرية من الزرد

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

في الوريد من يرقات اسماك الزرد Microinjections لدراسة إصابة الكلى الحاد

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Microgavage من يرقات اسماك الزرد

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

طرق لتقييم التحت خلوية من المقصورات في العضلات<em&gt; C. ايليجانس</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

عالية الدقة قياس التنفس لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في Permeabilized وخلايا سليمة

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...