著者らは、ゼブラフィッシュの飼育の支援のためにアンジェラバスタに感謝します。この作品は、国立衛生研究所（AG-020591へSVBとJJDに1K08AR054835）によってサポートされていました。

注：ゼブラフィッシュを含むすべての手順は、関連ガイドライン、規制、規制当局に従って行われるべきである。この記事で示されているすべての動物の使用手順は、動物の使用とケアに関するミシガン大学委員会（UCUCA）によって承認された。 1。縫合糸ループを作る<ol><li> 3本鎖に非滅菌縫合糸（USP 10/0モノフィラメントナイロン、3プライ）を分離するためにピンセットを使用してください。 </li><li>ストランドのいずれかでダブルオーバーハンドノットを結ぶために始める。代わりに結び目の小さい（〜直径1mm）ループを作る完全に結び目を締める前に停止します。 </li><li>ループの尾から余分な縫合糸をカットするはさみを使用します。完成したループの例を図1に示されている。 </li><li>それはポスト後で使用するために注意してくださいの粘着面上にループを配置します。縫合糸ループは、力試験中に適所に幼虫を保持するために使用される。 </li><li>必要に応じて手順1.1から1.4を繰り返します。マックテストされる各幼虫の電子2縫合糸ループ。 </li></ol> 2。テストソリューションを作る<ol><li> 1,000 mlに7.977グラムの塩化ナトリウム、0.373グラム塩化カリウム、0.265グラムの塩化カルシウム二水和物、0.102グラムの塩化マグネシウム六水和物、0.048グラム一塩基性リン酸ナトリウム、1.000グラムの重炭酸ナトリウム、および0.037グラムエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物を添加してタイロード溶液を作る精製水。 </li><li>塩が完全に溶解するまで溶液をかき混ぜる。この溶液を4℃で一ヶ月保存することができる</li><li> 47.9ミリリットルのタイロード液とミックスに4 mg / mlのtricaineの2.1ミリリットル、ゼブラブック24に従って調製し、追加します。暗いガラス瓶やアルミ箔で覆われたガラスの瓶の中に格納することによって、光からの溶液を保護する。この溶液を室温で保存し、毎日新鮮なされるべきである。 </li></ol> 3。実験チャンバーにAanesthetized幼虫を結ぶ<ol> &lt;李は&gt;実体顕微鏡のステージ上に試験装置（ 図2）を配置します。 </li><li>試験装置に力変換器と長コントローラケーブルを接続します。力変換器の電源をオンにします。それはリジッド残るように、長さ、コントローラの電源を入れます。 （ 注：長さコントローラは収縮時筋標本を拡大または短縮する能力を提供するが、長さコントローラのこの機能は本明細書に記載された方法で使用されていないため、長制御部は、剛性の添付ファイルとして考えることができる。。点）XYZ位置決めシステムに取り付けられている。 </li><li>使い捨てトランスファーピペットで、試験溶液を用いた実験室を埋める。 </li><li>尾のいずれかの方法で縫合糸ループをピックアップし、力変換器のチューブの上にハングアップする鉗子を使用してください。長コントローラに接続されているチューブに第2の縫合糸ループを掛ける。 （ 注：湾曲部に縫合糸ループを把持すると、縫合糸とCAUをキンクすることができますそれは）は、後続のステップの間に壊れるに知ら。 </li><li>使い捨てトランスファーピペットで、試験溶液で満たさ小さなペトリ皿にゼブラフィッシュ幼虫を移す。効果（〜1分）を取るために試験溶液中の麻酔薬（tricaine）を待ちます。鉗子で、そっと尻尾を微調整し、幼虫は、タッチ誘発水泳の不足により麻酔であることを確認します。 </li><li>実験室に幼虫を転送するためにガラスピペットを使用してください。 </li><li>そっと閉じたピンセットで幼虫をナッジすることで、力変換器チューブに縫合糸ループを介して幼虫の前方部分を導く。チューブ上の縫合糸ループを介して幼虫の前方部分を導く。鉗子で縫合糸ループの尾の両方をつかみ、卵黄嚢やswimbladder（ 図3A）の後方に縫合糸ループを強化すると同時に、それらを引き出します。 </li><li>鉗子で、幼虫は幼虫の顔の側面まで、チューブの周りに90°旋回させ、つの縫合糸ループテールとプルを開催次第（ 図3B）。ループが十分に締め付けられていた場合は、プルに多少の抵抗があるだろう、幼虫は簡単に旋回するべきではありません。ループを締めつけていた場合、幼虫は管の周りに旋回しません。 </li><li>長コントローラに接続されたXYZ位置決め装置を使用して、X軸（ 図2Aにおける軸の定義）に沿って幼虫の胴と尾の下の長さコントローラ管を移動します。長コントローラ管と力変換器管の両端の間にスペースを入れてください。 </li><li>幼虫の尾以上縫合糸ループを導き、前述したように（ 図3C）縫合糸ループを締めます。側面が上を向くようにして、幼虫の後部に旋回する必要があるかもしれません。縫合糸ループの尾（ 図3D）をトリミングします。 </li></ol> 4。実験所における位置幼虫<ol><li>幼虫wを確実にするために、チャンバー下部から適切な距離に幼虫を移動病気で後続のステップの間に倒立顕微鏡対物レンズの &quot;作動距離&quot;内にある。これを達成するために、管はただチャンバの底部に接触するまで、徐々にZ軸に沿ってチューブ（添付の幼虫で）低下させるXYZ位置決め装置を使用する。幼虫は、チャンバ底（〜100μm）のから適切な距離になるまで続いて、チューブを引き上げる。 </li><li>長さコントローラに接続さXYZ位置決め装置を用いて、力変換器管の長軸との幼虫の長軸を整列させるY軸に沿って長さコントローラチューブを調整する。 </li></ol> 5。最大単収縮中に記録フォース<ol><li>倒立顕微鏡のステージに試験装置を移動します。 </li><li>所望の値にチャンバ温度を調整します。開始するには、試験装置に水浴循環装置、温度計、温度制御装置を接続する。必要なコンポーネントの電源を入れ、温度CONTR上の設定を調整温度計までoller所望の値を報告します。この記事に含まれるデータは、25°Cで収集されたが、測定も室温でまたは28.5で行うことができる℃の</li><li>刺激から試験装置にケーブルを接続します。刺激装置の電源をオンにしますが、ステップ5.6になるまで幼虫を刺激しない。 </li><li>幼虫は、チャンバ底に平行であることを確認してください。 40X客観通じ、管の端間の幼虫の一部を表示します。底部に平行な場合には、幼虫の両端が焦点になります。必要に応じて両端が焦点になるまで、Z軸に沿って力変換器チューブを調整する。 </li><li>幼虫の長さが最適よりも短くなっていることを確認します。ビデオサルコメア長システムの電源をオンにし、条痕は、ビデオフレームの側面と平行になるように、ビデオカメラを回転させます。このシステムは、近隣のユーザ定義領域内の各画素の水平方向の列に沿って画素の強度の変化を解析することにより、ストライエーションの間隔を監視する（ROI）。 ROI内のすべての行の結果を平均し、ビデオフレームレート（≥80秒-1）に相当する周波数で報告されている。ストライエーションの間隔は、筋節の長さの指標として用いられる。 </li><li>周辺の繊維に焦点を当て、指示されたサルコメア長さを注意する顕微鏡を調整します。必要であれば、筋節の長さ（ 例えば 、1.90ミクロン）最適未満になるまで幼虫の長さを調整する長さコントローラ（X軸）に取り付けられたXYZ位置決め装置を使用する。 </li><li>収縮力を最適化する電流刺激を調整します。開始するには、低振幅（ 例えば 100ミリアンペア）に刺激に出力電流を設定します。刺激器は、手動またはカスタムLabVIEWプログラムを実行するコンピュータによってトリガすることができる。持続期間は0.2ミリ秒のパルス電流と幼虫の筋肉のけいれんを引き出す。 </li><li>力出力を記録して、オシロスコープのカーソルを使用してピーク収縮力を測定するためにオシロスコープを使用してください。電流を増加50ミリアンペアの単位で、それぞれの現在のレベルのピーク収縮力を測定する。疲労を防ぐために、けいれんの間30秒待ちます。刺激電流が増加するにつれ、ピーク収縮力は、典型的には最大値まで増加し、その後徐々に減少する。幼虫が最大の力を発生する電流は、最適な刺激電流である。最適な刺激電流に電流振幅を設定します。 </li><li> XYZ位置決め装置を用いて、最大の収縮力を誘発するために、幼虫（従って、筋節の長さ）の長さを調整する。野生型のゼブラフィッシュの幼虫（3-7 DPF）が2.10μm以上2.15ミクロンのサルコメア長で最大収縮力を発生。しかしながら、筋節長さが幼虫に過剰な歪みを回避するために、2.08ミクロンに設定することができる。 </li><li>幼虫の筋肉の収縮を引き出す。力応答を記録し、その後の分析のための記録を保存するためにオシロスコープを使用してください。 </li></ol> 6。最適な長さで幼虫と筋肉組織寸法を測る<ol&gt; <li>ステレオ顕微鏡に戻って試験装置を移動します。 </li><li>側面から見た接眼スケールを用い、筋肉の高さを測定する。その後、幼虫の長さを変更しないように注意を取ることは、下から幼虫を表示するために縫合糸ループの尾を使用して90°幼虫を旋回。下から見た筋肉の幅を測定します。解剖学的ランドマーク（ 例えば生殖器の開口部）（ 図4）での測定を行う。 </li><li>試験装置から幼虫を解放するためにマイクロブレードと縫合糸ループをカットします。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo.">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).</li><li>Nixon, S. J., Wegner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease;+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning.">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14 (13), 1727-1743 (2005).</li><li>Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+&#945;2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin &#945;2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> PNAS. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Hirata, H., Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect,+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease.">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134, 2771-2781 (2007).</li><li>Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+myotubularin+function+results+in+t-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy.">Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372 (2009).</li><li>Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+zebrafish+feature+aspects+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+pathology.">Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 20 (12), 826-832 (2010).</li><li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies.">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum. Mol. Genet. 19 (4), 623-633 (2010).</li><li>Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUX4,+a+candidate+gene+for+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy,+causes+p53-dependent+myopathy+in+vivo.">DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo.</a> Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).</li><li>Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+dissection+of+laminin-receptor+interactions+in+dystrophic+zebrafish+muscle.">Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle.</a> Hum. Mol. Genet. , (1093).</li><li>Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> PNAS. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li><li>Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exon-skipping+strategies+for+Duchenne+muscular+dystrophy+utilizing+dystrophin-deficient+zebrafish.">Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish.</a> J. Cell Mol. Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).</li><li>Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Pax7+expressing+myogenic+cells+in+zebrafish+muscle+development,+injury,+and+models+of+disease.">Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease.</a> Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).</li><li>Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Kn&#246;ll, R., Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+integrin-linked+kinase+is+required+in+skeletal+muscles+for+strengthening+the+integrin-ECM+adhesion+complex.">Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex.</a> Dev. Biol. 318 (1), 92-101 (2008).</li><li>Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+function+for+perlecan+in+skeletal+muscle+and+cardiovascular+development.">A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development.</a> J. Cell Biol. 181 (2), 381-394 (2008).</li><li>Kim, H. R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protein+TGFBI+promotes+myofibril+bundling+and+muscle+fibre+growth+in+the+zebrafish+embryo.">The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).</li><li>Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHAP+is+a+newly+identified+Z-disc+protein+essential+for+heart+and+skeletal+muscle+function.">CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function.</a> J. Cell Sci. 123 (7), 1141-1150 (2010).</li><li>Huang, H., Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity,+uptake+kinetics+and+behavior+assessment+in+zebrafish+embryos+following+exposure+to+perfluorooctanesulphonicacid+(PFOS).">Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS).</a> Aquat. Toxicol. 98 (2), 139-147 (2010).</li><li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers.">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li><li>Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+of+the+environmental+pollutant+4-nonylphenol+in+zebrafish.">Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish.</a> Neurotoxicol. Teratol. 33 (6), 752-764 (2011).</li><li>Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+embryonic+red+and+white+muscle+fibers+during+fictive+swimming+in+the+developing+zebrafish.">Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 87 (3), 1244-1251 (2002).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135 (4), 1115-1127 (2012).</li><li>Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+skeletal+muscle+in+zebrafish+early+larvae.">Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae.</a> J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+weakness+during+tricaine+anesthesia.">Muscle weakness during tricaine anesthesia.</a> Comp Biochem Physiol Part C. 110 (3), 289-296 (1995).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+of+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

この方法では、ゼブラフィッシュの幼虫の体幹筋の筋機能を評価するために収縮時に力発生を測定します。強直収縮がゼブラフィッシュ幼生（0.2秒の期間200刺激パルス/秒によって）に誘発することができますが、最大の強縮力は最大収縮力よりも10〜15％大きい。したがって、単収縮時に発生する力は、能力を発生させる力の合理的な尺度である。けいれんは、リッピングや縫合の絆で滑りが発生する可能性が低いので、けいれんをテタヌス収縮よりも好ましい。 この手法の意味のあるデータを生成するために、最大の収縮力が各幼虫に対して達成すべきであると実験群との間のばらつきが最小化されるべきである。念頭に置いてこれらの目標により、我々は次の提案を提供しています。力変換器と長コントローラチューブに幼虫を結ぶときに最初に、世話をする。縫合糸ループがあまりに締められている場合あまり、縫合糸は、筋肉組織を切断します。縫合糸ループが十分に締め付けられていない場合には、幼虫が発生する力は完全に力変換器に伝達されない。両方の状況が、特に後者は、最大収縮力を過小評価する。幼虫は、テスト期間中に開発していきますので、第二に、複数の実験群のテスト以来、グループ間で交互に数時間（20〜30分/幼虫）、取ることができます。 前述の機器の一部が最大収縮力の測定（ 例えば力変換器、現在の刺激）のために不可欠である一方、他の項目は絶対に必要ではありません。ビデオサルコメア長システムが望ましいが、必須ではありません。代替として、痙攣一連の最大収縮力が達成されるまで、幼虫の長さを調整する時に最適な長さを見つけるために使用することができる。温度制御システムは、必ずしも必要ではない。時測定温度制御が重要である最大収縮力は温度の小さな変化に特に敏感ではなく、室温で測定することができるのに対し、温度に非常に敏感であるジューリング収縮動態、。かかわらず、室内の温度の力試験中、幼虫の前に正確なステージングのテストを強制的に28.5°C 24の最適な成長温度に維持されなければならないことに留意されたい。 幼虫tricaineを含むタイロード溶液中でテストされます。私たちは神経系により誘発される自発的な収縮をなくすため、力のテスト中に疲労を防止するために、（w / v）のtricaine、麻酔24に推奨濃度は0.02％を使用しています。 Tricaineはまた、タイでのステップを容易にし、全体的なテスト時間を短縮します。しかし、我々は、試験溶液中にtricaineを含むことは常に約30％の最大収縮力を減少させることを観察する。同様の効果がtricaiここで、オタマジャクシ尾筋で観察されている神経筋伝達が遮断された後にneがtricaine 25が筋肉に直接影響を有することを示唆して、力発生を減少させた。それは神経細胞26の場合と同様にTricaineは、細胞膜を横切っナトリウムコンダクタンスを減少させることによって筋細胞の興奮性を低減することができる。運動ニューロンによる活性化を阻止するためのその他のオプションは、D-ツボクラリン及びα-ブンガロトキシンですが、tricaineとは異なり、これらの化合物は、皮膚浸透性ではなく、頭部、脊髄、心臓27に直接注入しなければなりません。個々の研究者はtricaineが彼らの特定のアプリケーションのために望ましいかどうかを評価する必要があるでしょう。 tricaineがテストソリューションに含まれている場合tricaineの効果が実験群間で変化しないことを確認する必要があり、濃度が実験や研究者の間で一貫している必要があります。 我々は3 DPFとして若く7 DPFと同じくらい古いように幼虫のためにこの方法を説明する。筋線維は、カンフーのように見えますが3 DPFは、テスト機器に幼虫を結ぶ妨げ前に自発テールの動きが27、尾の短い長さを開始17時間後の受精、早けれnctional。多くの疾患モデルは、この時間よりもはるかに長く生きていけないので、我々は一般的に7 DPF後に幼虫のテストは行わないでください。 5 DPF超え幼虫をテストする場合は、幼虫を供給すべきである。私たちは、未吸血幼虫が減少卵黄嚢が原因そう、小さい筋肉を持って飼育幼虫未満最大収縮力を発生することを観察した。したがって、外部給電の追加変数を避けるために、DPF 3-5間の幼虫をテストすることが望ましい場合がある。 要約すると、我々は、ゼブラフィッシュ幼虫の体幹筋肉の最大単収縮時の力の生成を測定するための定量的かつ信頼性のある方法が記載されている。この方法は、ゼブラフィッシュ幼生筋肉の全体的な健康状態を評価するために使用され、特に筋肉の機能に関する情報を提供することができます。についての情報を提供することに加えて力発生の大きさは、この技術は、力発生の動態を研究するために、または筋肉疲労22を研究するために適合させることに使用することができる。我々は、野生型幼虫で使用するためにこの技術を説明するが、この方法は、筋肉損傷は、筋疾患モデルを特徴付けるや治療を評価する、または筋肉の発達を研究するために、遺伝的に改変された幼虫又は薬物または毒物で処理した幼虫のために使用することができる、または筋肉関連の化学毒性。

ヤングゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の幼虫、3-7日後に受精（DPF）は、ますます骨格筋研究のために有用な生物として認識されている。若い幼虫は、研究筋肉損傷12を薬や治療戦略10-11を評価し、モデルの人間の筋肉の疾患1-9に使用されている、筋肉の発達13-16を理解し、筋肉関連の化学毒性17-19を調査。これらの分野における代表的な研究では、健康的な筋肉が遺伝子操作や毒物への曝露によって異常なレンダリングされる度合いを調べ、いくつかの研究では、異常な筋肉が治療に反応する程度を調べます。これらの研究の成功に不可欠な、正確に筋肉の状態を評価する機能です。 ゼブラフィッシュ幼生の筋肉の状態を評価するために使用できるさまざまな方法がありますが、いくつかは、筋機能に関する直接的な情報を提供します。筋肉の健康は通常appearancによって評価されとして9,15,16,18を免疫組織染色6,8,11、、光学顕微鏡3,13、電子顕微鏡3,4,14,16、または複屈折7,9,11によって評価電子、しかし、これらの技術は提供する形態学的情報のみ。トランクとテール変位と遊泳速度4,17は運動機能を評価しますが、彼 ​​らはまた、神経入力、エネルギー代謝、およびその他のプロセスを反映しているので、これらは、筋機能の直接的な対策ではありません。 対照的に、収縮時力発生を測定する筋肉機能の直接評価を提供し、全体的な筋肉の正常性の尺度を表す。このアプローチの利点は、追加された簡単なデータ分析と定量的な結果が含まれています。このビデオの記事では、我々はより多くの研究者が研究に筋肉の健康の既存の施策を補完するために、このメソッドを使用することを願って、幼虫の筋肉による力発生を測定するための詳細な手順を提供します。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;この方法の全体的な目標は、ゼブラフィッシュ幼生体幹筋肉の収縮時の力の生成を測定することである。この目標を達成するために、ゼブラフィッシュの幼虫を麻酔し、食塩水で満たされたチャンバーに入れている。幼虫の前端は、力変換器に接続されており、幼虫の後端は、長さ·コントローラーに接続されています。筋肉の活性化は、電場刺激することによって達成され、刺激電流と幼虫の長さは、最大収縮力を生成するように調整される。等尺性単収縮が誘発され、力応答の分析のために記録される。 明確にするために、この手法は、水泳中に幼虫の筋肉によって生成された力を測定していません。幼虫の両端には、機器に接続されており、幼虫は麻酔ままなので、それがテスト中に運動を開始することはできませんので。また、電界刺激億を誘導するために同時にすべての筋線維を活性化する当然20を発生するものではないateral収縮、。したがって、むしろ水泳中に生成された実際の力を測定するよりも、この技術は幼虫の筋肉の力発生機能を決定します。 我々は、マルチminicore疾患22のゼブラフィッシュモデルにおける筋肉の機能に酸化防止剤治療の効果を評価するために、並びに、ネマリンミオパチー21のゼブラフィッシュモデルにおける筋力低下を示すために、この技術を使用している。その他筋機能19環境汚染物質の影響を調べるために同様の手法23を使用している。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonsterile-suture</td>
			<td>Ashaway Line &amp; Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td>USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vannas</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td>Illuminated with Fostec EKE ACE I light source</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>400A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Length controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>318B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>XYZ positioning devices</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Cut end to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-11YZ </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Axiovert 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Water bath circulator</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Alpha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>701C</td>
			<td>High-power, follow stimulator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Video sarcomere length system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>900B-5A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Nicolet Technologies</td>
			<td>ACCURA 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-13</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data analysis software (Signo)</td>
			<td>Alameda Applied Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae

ゼブラフィッシュの幼虫は筋肉の発達、筋肉疾患、筋肉関連の化学毒性のモデルを提供しますが、関連する研究は、多くの場合、筋肉の健康の機能的な措置を欠いている。このビデオの記事では、我々はゼブラフィッシュ幼生体幹筋の収縮時に力発生を測定する方法を示しています。力の測定は、塩溶液で満たされたチャンバー内に麻酔をかけ幼虫を置くことによって達成される。幼虫の前端は、力変換器に接続されており、幼虫の後端は、長さ·コントローラーに接続されています。等尺性単収縮は、電場刺激によって誘発され、力応答を分析のために記録される。収縮時の力発生は、全体的な筋肉の健康の尺度を提供し、特に筋機能の尺度を提供します。我々は、野生型幼虫で使用するために、この手法を説明したが、この方法は、遺伝子的に修飾された幼虫、または薬物または毒物で処理した幼虫で使用することができる筋肉の疾患モデルを特徴付けるとトリートメントを評価したり、筋肉の発達、けが、または化学毒性を研究するために。

健康な野生型ゼブラフィッシュの幼虫では、筋線維は、それらの間に大きな隙間なく互いに平行であると明らかに条痕を（ 図5A）が必要です。破棄されるべきである、またはそのような一戸建て繊維（ 図5B）のような明らかな損傷で、これらの特徴を示さない野生型のゼブラフィッシュの幼虫。 単一ゼブラフィッシュの幼虫のためのピーク電流収縮力に対する刺激の代表的なプロットを図6に示す。 3-7 DPFの間に、野生型ゼブラフィッシュの幼虫のために、最適な刺激電流は3 DPFの幼虫は一般に6-7 DPFの幼虫よりも大きな電流刺激を必要とすると、一般的にmAの400-600の間にある。 生力データ（ステップ5.8の間に収集された）データ解析ソフトウェアを用いて処理し、分析しなければならない。まず、力レコードのベースラインはゼロに設定される。第二に、力変換器の出力電圧は、力（mまで変換されるN）（ロードセルの検量線を生成するために製造業者の取扱説明書を参照）。単一の幼虫の最大単収縮中に収集された代表的な力応答は、 図7に示されている。データ解析ソフトウェアは、力応答のピーク力および他の特徴を測定するために使用することができる。 最大筋の収縮からのピーク力データの代表的セットは、 図8Aに示されている。年上の幼虫は若い幼虫よりも力を発生させると0.9〜1.7 MNに野生型3-7 DPFの幼虫の範囲の典型的なピーク収縮力値。ピーク収縮力の違いは成長と発展（ 図8）、またはそのような病理21,22遺伝子変異に関連するような異常のプロセスのような通常のプロセスに起因することができます。 筋断面積（CSA）による正規化がピーク収縮力の違いは、単にのdiffereことになっている程度を決定することができる<html>筋肉21,22のサイズのNCES。 CSA =π（/ 2）（B / 2）、底部から見た側から見た筋肉の高さであり、Bは、筋肉の幅である：筋CSAは次式を用いて推定することができると楕円形の断面が想定されます。 3-4 DPFの幼虫は一般に5-7 DPFの幼虫より小さいCSA値を示すとの0.027から0.034ミリメートル2〜野生型3-7 DPFの幼虫の範囲、の典型的なCSA値。最大筋の収縮からの正規化ピーク力データの代表的セットは、 図8Bに示されている。 4-7 DPFの幼虫は一般に3 DPFの幼虫よりも大きい値を示したと34から51 MN / mmの2〜野生型3-7 DPFの幼虫の範囲の典型的な正規化されたピークの収縮力値。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig1.jpg" /> 図1。縫合糸ループ。縫合糸ループの尾に矢印ポイント。 ve_content &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2.jpg" /> 図2。ラベルされたコンポーネントを持つ（A）試験装置。実験室の（B）のクローズアップビュー。透明な底の（a）は実験室。（b）の力変換器（C）長さ·コントローラ。（d）の XYZ位置決め装置。 X、Y、およびZ軸は右上隅に定義されている。熱電モジュールを利用して（e）の温度制御システム。チューブは、熱電モジュールの冷却水の流れを収容する。（f）のステンレス鋼の管は、変換器を強制的に取り付けられている。（g）のステンレス鋼チューブの長さがコントローラに接続されている。（h）に温度計マイクロ。（i）はプラチナ平行平板電極の長さに及ぶザ室。プラチナプレートは、高2.5ミリメートル、厚さ0.255ミリメートルです。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3.jpg" /> 図3。実験室に幼虫を結ぶ。前方終わりには縛られませんまだ90°旋回（）幼虫が。旋回90°後（B）の幼虫。（C）幼虫は、後端にに縛らまだ旋回しない。（D）幼虫の後旋回と縫合糸ループ尾がトリミングされています。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4.jpg" /> 図4。断面積の推定のための測定。筋肉組織（）側および（B）から見た</stronG&gt;ボトム。赤いバーの配置は、泌尿生殖器の開口部の位置を示す。赤いバーの長さは、それぞれ側面図および底面から見た筋肉の高さと幅を示している。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5.jpg" /> 図5。ゼブラフィッシュ幼生トランク筋肉組織の側面図。明らかにダメージがある（A）健康な組織。（B）組織。繊維分遣起因する拘縮はアスタリスクでマークされています。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig6.jpg" /> 図6。ピーク収縮力に対する刺激電流の代表的なプロットは。最適な刺激電流は、500 mAです。 図7。単一の単収縮のための代表的な力レコード。この収縮は0ミリ秒で刺激パルスで誘発された。ピーク力は1.56 MNです。 <img alt="図8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8.jpg" /> 図8。 3-7 DPFの幼虫から描写力のデータ（）の最大筋収縮力のピークデータ。CSAに正規化最大筋収縮から（B）ピーク力のデータ。年上の幼虫（6-7 DPF）が5 DPFから始まるスピルリナを与えHatchfry Encapsulonグレード0（アージェントラボラトリーズ）であった。手段は、+標準偏差は、各グループ内でN = 5で報告されている。 3 DPFの幼虫（*）および4 DPFの幼虫（＃）と有意に異なる基（ANOVA、P &lt;0.05示されている）。図4及び6-7 DPF（A）との間の力の増加がないにしていなかっ成長に起因しているのに対し、図3及び図4 DPF（B）との間の正規化された力の有意な増加は、この期間中に本質的な力発生能力の増加を示す正規化された力の4〜7 DPFから変更。

Watch this Scientific Journal Video about Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

力の測定は、開発、傷害、疾病、治療または化学毒性による筋機能の変化を示すために使用することができる。このビデオでは、我々は、ゼブラフィッシュ幼生体幹筋の最大収縮時の力を測定する方法を示しています。

ゼブラフィッシュ幼生における筋機能を評価するために、収縮時の力測定

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

force-measurement-during-contraction-to-assess-muscle-function

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K ビュー.  University of Michigan. 力の測定は、開発、傷害、疾病、治療または化学毒性による筋機能の変化を示すために使用することができる。このビデオでは、我々は、ゼブラフィッシュ幼生体幹筋の最大収縮時の力を測定する方法を示しています。

ビデオ: Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

生物学

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

ゼブラフィッシュ幼生のMicrogavage

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法<em&gt; C。エレガンス</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

インフィールドアプリケーションの設計およびアプタマー金ナノ粒子基づく比色アッセイの開発

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...