저자는 제브라 피쉬 사육에 대한 지원은 안젤라 부스타 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (AG-020591에 SVB와 JJD에 1K08AR054835)에 의해 지원되었다.

참고 : 제브라 피쉬와 관련된 모든 절차는 관련 지침, 규정 및 규제 기관에 따라 수행되어야한다. 이 문서에 표시된 모든 동물 사용 절차는 동물의 사용 및 관리에 미시간위원회의 대학 (UCUCA)에 의해 승인되었다. 1. 봉합 루프를 만들 <ol><li> 세 가닥으로 비 멸균 봉합 (USP 10 / 0 모노 필라멘트 나일론, 3 개 가닥)을 분리하는 집게를 사용합니다. </li><li> 가닥 중 하나를 두 번 돌린 매듭을 시작합니다. 대신 매듭의 작은 (~ 1mm 직경) 루프를 만들기 위해 완전히 매듭을 체결하기 전에 중지합니다. </li><li> 루프 꼬리에서 초과 봉합사를 잘라 가위를 사용합니다. 완성 된 루프의 예는 그림 1에 표시됩니다. </li><li> 이 포스트 나중에 사용하기 위해 참고의 끈끈한면에 루프를 배치합니다. 봉합 루프는 강제 테스트 중에 장소에서 유충을 보유하는 데 사용됩니다. </li><li> 반복 필요에 따라 1.1-1.4 단계를 반복합니다. 막테스트 할 각 유충의 전자 두 봉합 루프. </li></ol> 2. 테스트 솔루션을 <ol><li> 의 1,000 ml로 7.977 g 나트륨 염화물, 0.373 g 염화 칼륨, 0.265 g의 염화 칼슘 이수화 물, 0.102 g 염화 마그네슘 육수화물, 0.048 g 나트륨 인산, 1.000 g 나트륨 중탄산염, 그리고 0.037 g 에틸렌 산 나트륨 소금 수화물을 추가하여 Tyrodes 솔루션을 물을 정화. </li><li> 염이 완전히 용해 될 때까지 저어. 이 솔루션은 4 ° C.에서 한 달 동안 저장 될 수있다 </li><li> 47.9 ML의 Tyrodes 솔루션과 믹스 4 밀리그램 / ML tricaine의 2.1 ML, Zebrafish의 책 24에 따라 제조를 추가합니다. 어두운 유리 병 또는 알루미늄 호일로 덮여 유리 병에 저장하여 빛으로부터이 솔루션을 보호합니다. 이 솔루션은 상온에서 보관하고 매일 신선한 만든되어야한다. </li></ol> 3. 실험 챔버에 Aanesthetized 유충을 연결 <ol> &lt;리&gt; 장소 스테레오 현미경의 무대에 시험 장치 (그림 2). </li><li> 시험 장치에 힘 변환기와 길이 컨트롤러 케이블을 연결합니다. 힘 센서의 전원을 켭니다. 그것은 엄격한 유지되도록 길이 컨트롤러를 켭니다. (참고 :.. 길이 컨트롤러가 수축하는 동안 근육의 준비를 늘리거나 줄일 수있는 기능을 제공하지만, 길이 컨트롤러의이 기능이 여기에 설명 된 방법에 사용하지 않는 때문에, 길이 컨트롤러는 단단한 첨부 파일로 생각할 수 있습니다 점) XYZ 위치 시스템에 장착. </li><li> 처분 할 수있는 이동 피펫, 시험 용액으로 실험 챔버를 입력합니다. </li><li> 꼬리 중 하나를 사용하여 봉합 루프를 선택하고 힘 센서 튜브에 걸고 집게를 사용합니다. 길이 컨트롤러에 연결된 튜브에 두 번째 봉합 루프를 건다. (참고 : 곡선 부분에 봉합 루프를 잡으면 봉합 및 CAU를 꼬 수 있습니다가) 다음 단계에서 휴식 SE. </li><li> 처분 할 수있는 이동 피펫, 시험 용액으로 채워진 작은 페트리 접시에 zebrafish의 유충을 전송합니다. 효과 (~ 1 분) 걸릴 테스트 솔루션 (tricaine)에서 마취 기다립니다. 집게로 조심스럽게 꼬리를 조금씩 이동하고 유충 터치 유발 수영의 부족으로 마취 있는지 확인합니다. </li><li> 실험 챔버에 유충을 전송하는 유리 피펫을 사용합니다. </li><li> 부드럽게 닫힌 집게로 유충을 이끌어 의해, 힘 센서 튜브의 봉합 루프를 통해 유충의 앞쪽 부분을 안내합니다. 튜브 봉합 루프를 통해 유충의 앞쪽 부분을 안내합니다. 집게와 봉합 루프 꼬리를 모두 잡고 난황 또는 swimbladder (그림 3A) 후방 봉합 루프를 강화하는 동시에 당깁니다. </li><li> 포셉 한 봉합 루프 꼬리를 잡고 당겨 유충 얼굴의 측면 측면까지 관의 주위에 90 °를 회전하는 유충의 원인의 최대 (그림 3B). 루프가 충분히 체결 한 경우, 풀에 약간의 저항이있을 것이다 유충은 쉽게 회전하지 않아야합니다. 루프가 너무 체결 한 경우, 유충은 관 주위에 회전하지 않습니다. </li><li> 길이 컨트롤러에 연결된 XYZ 위치 장치를 사용하여 X 축 (그림 2A의 축 정의)을 따라 유충의 트렁크와 꼬리 아래 길이 컨트롤러 튜브를 이동합니다. 길이 컨트롤러 튜브의 끝과 힘 센서 튜브 사이의 공간을 두십시오. </li><li> 유충의 꼬리에 봉합 루프를 안내하고 이전에 (그림 3C) 기술로 봉합 루프를 조입니다. 당신은 측면면이 위로 향하도록 유충의 후방 부분을 회전해야 할 수 있습니다. 봉합 루프 꼬리 (그림 3D)를 트리밍합니다. </li></ol> 4. 실험 챔버에 위치 유충 <ol><li> 유충 승을 보장하기 위해 챔버 바닥으로부터 적절한 거리에 유충을 이동아픈 이후 단계에서 거꾸로 현미경 목표의 &quot;작동 거리&quot;에서합니다. 이 작업을 수행하려면, 튜브 그냥 챔버의 바닥에 닿을 때까지 천천히 Z-축을 따라 튜브 (첨부 유충)와 낮은 XYZ 위치 장치를 사용합니다. 유충은 챔버 바닥 (~ 100 μm의)에서 적절한 거리입니다 때까지, 튜브를 올립니다. </li><li> 길이 컨트롤러에 연결된 XYZ 위치 장치를 사용하여, 힘 센서 튜브의 긴 축 유충의 긴 축을 정렬 Y 축 방향 길이 컨트롤러 튜브를 조정합니다. </li></ol> 5. 최대한 트 위치 수축하는 동안 레코드 포스 <ol><li> 거꾸로 현미경의 무대에 시험 기기를 이동합니다. </li><li> 원하는 값으로 챔버의 온도를 조정합니다. 시작하려면, 물 목욕 순환 장치, 온도계 및 시험 기기에 온도 컨트롤러를 연결합니다. 필요한 구성 요소의 전원을 켜고 온도 contr를에 설정을 조정온도계까지 oller 원하는 값을보고합니다. 이 문서에 포함 된 데이터는 25 ° C에서 수집되었지만, 측정은 RT이나 28.5에서 만들 수 있습니다 ° C. </li><li> 시험 기기에 자극에서 케이블을 연결합니다. 자극기의 전원을 켭니다하되, 단계 5.6까지 유충을 자극하지 않습니다. </li><li> 유충은 실 바닥과 평행해야합니다. 40X 목표를 통해 튜브의 끝 사이의 유충의 부분을 볼 수 있습니다. 바닥에 평행 한 경우, 유충의 양쪽 끝이 초점이 될 것입니다. 필요한 경우 양쪽의 초점이 될 때까지, Z-축 힘 센서 튜브를 조정합니다. </li><li> 유충의 길이가 최적보다 짧은 있는지 확인합니다. 비디오 근절 길이 시스템의 전원을 켜고 강선은 비디오 프레임의 측면에 평행 한 비디오 카메라와 같은 회전합니다. 이 시스템은 또한 사용자 정의 영역 내에서 각 픽셀 가로 행을 따라 픽셀의 강도 변화를 분석하여 횡문의 간격을 모니터링(ROI). ROI 내의 모든 행에 대한 결과는 평균과 비디오 프레임 속도 (≥ 80 초 -1)에 해당하는 주파수로보고됩니다. 횡문 간격은 근절 길이의 지표로 사용된다. </li><li> 현미경 주변 섬유에 집중하고 지시 근절의 길이를주의 할을 조정합니다. 필요한 경우, 근절 길이 (예를 들어, 1.90 μm의) 최적 이하가 될 때까지 유충의 길이를 조정하는 길이 컨트롤러 (X-축)에 부착 된 XYZ 위치 장치를 사용하십시오. </li><li> 트 힘을 최적화하는 전류 자극을 조정합니다. 시작하려면, 낮은 정도 (예를 들어, 100mA)로 자극에 대한 출력 전류를 설정합니다. 자극은 수동으로 또는 사용자 정의 LabVIEW 프로그램을 실행하는 컴퓨터에 의해 트리거 될 수 있습니다. 지속 시간이 0.2 밀리의 전류 펄스 애벌레 근육의 경련을 유도. </li><li> 힘 출력을 기록하고 오실로스코프의 커서를 사용 피크 트 힘을 측정하기 위해 오실로스코프를 사용합니다. 전류를 증가50mA의 단위로 각 전류 레벨에서 피크 트 힘을 측정합니다. 피로를 방지하기 위해 경련 사이에 30 초를 기다립니다. 자극 전류가 증가함에 따라, 피크 트의 힘은 일반적으로 최대로 증가하고 서서히 감소한다. 유충은 큰 힘을 생성하는 전류는 최적의 자극 전류이다. 최적의 자극 전류 전류 진폭을 설정합니다. </li><li> XYZ 위치 장치를 사용하여 최대 트의 힘을 유도하기 위해 유충 (따라서, 근절 길이)의 길이를 조정합니다. 야생 유형 zebrafish의 유충 (3-7 DPF)는 2.10 μm의 또는 2.15 ㎛의 근절 길이에서 최대 트 힘을 생성합니다. 그러나, 근절 길이는 유충에 과도한 부담을 피하기 위해 2.08 μM로 설정할 수 있습니다. </li><li> 애벌레 근육의 경련을 유도. 강제 응답을 기록하고 후속 분석을 위해 레코드를 저장하도록 오실로스코프를 사용합니다. </li></ol> 6. 최적의 길이로 유충과 근육 크기를 측정 <ol&gt; <li> 스테레오 현미경으로 다시 테스트 장치를 이동합니다. </li><li> 접안 렌즈의 배율을 사용하여 측면에서 볼 때 근육의 높이를 측정합니다. 그런 다음, 유충의 길이를 변경하지 돌보는, 90으로 유충을 회전 ° 아래에서 애벌레를보기 위해 봉합 루프 꼬리를 사용하여. 아래에서 볼 때 근육의 폭을 측정합니다. 해부학 적 랜드 마크 (예 : 비뇨 생식기 개구부) (그림 4)에서 측정을 가져 가라. </li><li> 시험 장비의 유충을 풀어 microblade로 봉합 루프를 잘라. </li></ol>

<ol>
	<li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo.">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).</li><li>Nixon, S. J., Wegner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease;+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning.">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14 (13), 1727-1743 (2005).</li><li>Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+&#945;2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin &#945;2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> PNAS. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Hirata, H., Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect,+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease.">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134, 2771-2781 (2007).</li><li>Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+myotubularin+function+results+in+t-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy.">Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372 (2009).</li><li>Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+zebrafish+feature+aspects+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+pathology.">Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 20 (12), 826-832 (2010).</li><li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies.">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum. Mol. Genet. 19 (4), 623-633 (2010).</li><li>Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUX4,+a+candidate+gene+for+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy,+causes+p53-dependent+myopathy+in+vivo.">DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo.</a> Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).</li><li>Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+dissection+of+laminin-receptor+interactions+in+dystrophic+zebrafish+muscle.">Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle.</a> Hum. Mol. Genet. , (1093).</li><li>Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> PNAS. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li><li>Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exon-skipping+strategies+for+Duchenne+muscular+dystrophy+utilizing+dystrophin-deficient+zebrafish.">Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish.</a> J. Cell Mol. Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).</li><li>Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Pax7+expressing+myogenic+cells+in+zebrafish+muscle+development,+injury,+and+models+of+disease.">Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease.</a> Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).</li><li>Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Kn&#246;ll, R., Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+integrin-linked+kinase+is+required+in+skeletal+muscles+for+strengthening+the+integrin-ECM+adhesion+complex.">Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex.</a> Dev. Biol. 318 (1), 92-101 (2008).</li><li>Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+function+for+perlecan+in+skeletal+muscle+and+cardiovascular+development.">A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development.</a> J. Cell Biol. 181 (2), 381-394 (2008).</li><li>Kim, H. R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protein+TGFBI+promotes+myofibril+bundling+and+muscle+fibre+growth+in+the+zebrafish+embryo.">The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).</li><li>Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHAP+is+a+newly+identified+Z-disc+protein+essential+for+heart+and+skeletal+muscle+function.">CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function.</a> J. Cell Sci. 123 (7), 1141-1150 (2010).</li><li>Huang, H., Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity,+uptake+kinetics+and+behavior+assessment+in+zebrafish+embryos+following+exposure+to+perfluorooctanesulphonicacid+(PFOS).">Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS).</a> Aquat. Toxicol. 98 (2), 139-147 (2010).</li><li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers.">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li><li>Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+of+the+environmental+pollutant+4-nonylphenol+in+zebrafish.">Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish.</a> Neurotoxicol. Teratol. 33 (6), 752-764 (2011).</li><li>Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+embryonic+red+and+white+muscle+fibers+during+fictive+swimming+in+the+developing+zebrafish.">Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 87 (3), 1244-1251 (2002).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135 (4), 1115-1127 (2012).</li><li>Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+skeletal+muscle+in+zebrafish+early+larvae.">Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae.</a> J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+weakness+during+tricaine+anesthesia.">Muscle weakness during tricaine anesthesia.</a> Comp Biochem Physiol Part C. 110 (3), 289-296 (1995).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+of+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 방법은 zebrafish의 애벌레의 몸통 근육의 근육 기능을 평가하는 트하는 동안 힘 생성을 측정합니다. 파상풍의 수축이 (0.2 초 동안 200 자극 펄스 / 초만큼 예) zebrafish의 유충에 이끌려 할 수 있지만, 최대 파상풍의 힘은 최대 트의 힘보다 단지 15 % 크다. 따라서, 트 중에 생성 된 힘은 힘 생성 능력의 합리적인 기준입니다. 경련이 추출하거나 봉합 관계에서 미끄러지 일으킬 가능성이 있기 때문에 경련은 파상풍의 수축을 선호합니다. 이 기술 의미있는 데이터를 생성하기 위해 최대 트의 힘은 각 유충을 위해 달성해야하며, 실험 집단 간의 변화는 최소화되어야한다. 이러한 목표를 염두에두고, 우리는 다음과 같은 제안을 제공합니다. 힘 변환기와 길이 컨트롤러 튜브에 유충을 묶는 때 먼저주의하십시오. 봉합 루프가 너무 죄면많이 봉합은 근육 조직을자를 것이다. 봉합 루프가 충분히 조여지지 않은 경우, 유충에 의해 생성되는 힘은 완전히 힘 센서로 전송되지 않습니다. 두 경우 모두,하지만 특히 후자는 최대 트의 힘을 과소 평가하는 경향이있다. 유충은 테스트 기간 동안 개발을 계속하기 때문에 둘째, 여러 실험 그룹 테스트 이후 그룹 사이에 대체 몇 시간 (20-30 분 / 애벌레)이 걸릴 수 있습니다. 언급 된 장비의 일부는 최대 연축 힘의 측정 (예를 들어, 힘 센서, 전류 자극기)에 필수적이지만, 다른 항목은 절대적으로 필요하지 않습니다. 비디오 근절 길이 시스템은 바람직하지만, 필요하지 않습니다. 대안으로, 기라의 시리즈는 최대 트 힘이 달성 될 때까지 유충의 길이가 조정되는 동안 최적의 길이를 찾을 수 있습니다. 온도 제어 시스템은 절대적으로 필요하지 않습니다. 온도 제어 때 MEA 중요합니다최대 트 힘은 온도의 작은 변화에 특히 민감하지 않고 상온에서 측정 할 수있는 반면, 온도에 매우 민감한 가감하는 트 속도론. 에 관계없이 강제 테스트 중에 챔버 온도, 유충 ° C 24 전에 강제로 28.5의 최적 성장 온도에서 유지되어야합니다 정확한 스테이징 테스트. 애벌레는 tricaine을 포함 Tyrodes 솔루션에서 테스트됩니다. 우리는 신경 시스템에 의해 유발 자발적인 수축을 제거하고, 따라서 힘 테스트 과정에서 피로를 방지하기 위해 (W / V) tricaine, 마취 24에 권장되는 농도 0.02 %를 사용합니다. Tricaine 또한 타이에 단계를 용이하게하고 전체 테스트 시간을 줄일 수 있습니다. 그러나, 우리는 테스트 솔루션에 tricaine을 포함하여 지속적으로 약 30 %의 최대 트 힘을 감소 시킨다는 것을 관찰합니다. 비슷한 효과는 tricai 곳, 올챙이 꼬리 근육에서 관찰되었다신경 근육 학 전송이 차단 된 후 네브래스카 tricaine 근육 25에 직접적인 영향을 가지고 제안, 힘 생성을 감소시켰다. 이 신경 세포 26에서와 같이 Tricaine는 세포막을 통해 나트륨 전도도를 감소시켜 근육 세포의 흥분을 줄일 수 있습니다. 의 motoneurons에 의해 활성화를 차단하는 다른 옵션은 D-tubocurarine 및 α-bungarotoxin하지만, tricaine는 달리,이 화합물은 피부 투과하지 않으며 머리, 척수, 심장 27에 직접 주입해야합니다. 개별 연구자 tricaine가 특정 응용 프로그램에 대한 바람직한 여부를 평가해야합니다. tricaine이 테스트 솔루션에 포함되어있는 경우 tricaine의 효과는 실험군 사이에 차이가 없는지 확인한다 농도는 실험과 연구 사이에 일관성이 있어야합니다. 우리는 3 DPF로 젊고 7 DPF만큼이나 오래된으로 유충이 방법을 설명합니다. 근육 섬유는 푸 것으로 보이지만3 DPF의 테스트 장비에 유충을 묶는 방해하기 전에 자연 꼬리 운동이 27, 꼬리의 짧은 길이 시작 17 시간 후 수정, 빠르면 nctional. 많은 질병 모델이 시간보다 더 오래 생존하지 않기 때문에 우리는 일반적으로 7 DPF 후 유충을 테스트하지 않습니다. 5 DPF 이외의 유충을 테스트하는 경우 유충이 공급되어야한다. 우리는 unfed 유충 가능성이 먹은 애벌레 감소 난황으로 ​​인해보다 작은 근육이 덜 최대 트 힘을 생성하는 것을 관찰했다. 따라서 외부 먹이의 추가 변수를 방지하기 위해, 3-5 DPF 사이의 유충을 테스트하는 것이 바람직 할 수 있습니다. 요약하면, 우리는 zebrafish의 애벌레 몸통 근육의 최대 트 수축시 힘 생성을 측정하기위한 정량적하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 zebrafish의 애벌레 근육의 전반적인 건강을 평가하는 데 특히 근육의 기능에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 에 대한 정보를 제공 할뿐만 아니라힘 세대의 크기는,이 기술은 힘 세대의 동력학을 연구하는 22 개 피로 근육을 연구에 적용 할 수 있습니다. 우리는 야생 형 유충과 사용 방법을 설명하지만,이 방법은 근육 질병 모델의 특성 및 치료를 평가하거나, 근육 발달, 근육 부상 또는 공부를 위해 유전자 변형 유충 또는 약물이나 독성 물질로 치료 유충 사용할 수 있습니다 근육 관련 화학 물질의 독성.

젊은 제브라 피쉬 (Danio rerio) 유충, 3-7 일로 포스트 수정 (DPF)는 점점 골격 근육 연구를위한 유용한 유기체로 인식됩니다. 어린 유충이 모델 인간의 근육 질환 1-9에 사용되는, 약 및 치료 전략 10-11, 연구 근육 부상 12 평가 개발 13-16 근육을 이해하고, 근육 관련 화학 물질의 독성 17-19를 조사합니다. 이 지역의 전형적인 연구는 건강한 근육 유전자 조작이나 독성 물질에 노출에 의해 비정상적으로 렌더링되는 정도를 검사하고 어떤 연구는 비정상적인 근육 치료에 반응하는 정도를 검사합니다. 이러한 연구의 성공에 중요한 정확하게 근육의 상태를 평가하는 기능입니다. zebrafish의 애벌레의 근육 상태를 평가 할 수있는 다양한 방법이 있지만, 몇몇은 근육의 기능에 대한 직접적인 정보를 제공합니다. 근육 건강은 일반적으로 appearanc에 의해 평가된다같은 9,15,16,18를 면역 염색 학적 염색 6,8,11, 광학 현미경 3,13, 전자 현미경 3,4,14,16, 또는 복굴절 7,9,11에 의해 평가 전자,하지만, 이러한 기술 제공 형태 정보 만. 트렁크와 꼬리 변위 및 속도 4,17가 운동 기능을 평가하지만, 그들은 또한 신경 입력, 에너지 대사, 및 다른 프로세스를 반영 때문에 이러한 근육 기능을 직접 측정하지 않습니다 수영. 반면, 수축시 힘 생성을 측정하는 것은 근육 기능의 직접적인 평가를 제공하고 전반적인 근육 건강의 척도를 나타냅니다. 이 방법의 추가적인 장점은 단순 데이터 분석 및 정량 결과를 포함. 이 비디오 문서에서는, 우리는 더 많은 연구자들이 연구에 근육 건강 기존의 조치를 보완하기 위해이 방법을 사용하는 희망, 애벌레 근육에 힘 생성을 측정하기위한 자세한 절차를 제공합니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;이 방법의 전반적인 목표는 zebrafish의 애벌레 몸통 근육의 수축시 힘의 생성을 측정하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해, zebrafish의 유충은 마취와 소금 용액으로 채워진 챔버에 배치됩니다. 유충의 앞쪽 끝은 힘 센서에 연결되어 유충의 뒤쪽 끝은 길이 컨트롤러에 연결됩니다. 근육의 활성화는 전기장 자극에 의​​해 수행되고, 자극 전류와 유충의 길이는 최대 트 힘을 생산하기 위해 조정됩니다. 사시 트 위치 수축 이끌어되고 강제 응답은 분석을 위해 기록됩니다. 명확하게,이 기술은 수영하는 동안 애벌레 근육에 의해 생성 된 힘을 측정하지 않습니다. 유충의 양쪽 끝이 장비에 연결되어 유충 마취 남아 있기 때문에이 테스트 기간 동안 운동을 시작할 수 있기 때문이다. 또한, 현장 자극 억을 유도하는 동시에 모든 근육 섬유를 활성화자연스럽게 20 발생하는 것이 아니다 ateral 수축. 따라서 오히려 수영 중에 발생하는 실제 힘을 측정하는 것보다,이 기술 애벌레 근육의 힘 생성 능력을 결정합니다. 우리는 근육 nemaline 근병증 (21)의 제브라 피쉬 모델에서 약점뿐만 아니라, 멀티 MINICORE 질환 (22)의 제브라 피쉬 모델에서 근육 기능에 항산화 치료의 효과를 평가하는을 설명하는이 기술을 사용했습니다. 기타 근육 기능 19 환경 오염 물질의 영향을 조사하기 위해 유사한 기술 23를 사용했습니다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonsterile-suture</td>
			<td>Ashaway Line &amp; Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td>USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vannas</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td>Illuminated with Fostec EKE ACE I light source</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>400A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Length controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>318B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>XYZ positioning devices</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Cut end to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-11YZ </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Axiovert 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Water bath circulator</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Alpha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>701C</td>
			<td>High-power, follow stimulator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Video sarcomere length system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>900B-5A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Nicolet Technologies</td>
			<td>ACCURA 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-13</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data analysis software (Signo)</td>
			<td>Alameda Applied Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae

Zebrafish의 유충은 근육 발달, 근육 질환 및 근육 관련 화학 물질의 독성 모델을 제공하지만, 관련 연구는 주로 근육의 건강 기능성 조치를 부족합니다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 zebrafish의 애벌레 몸통 근육의 수축시 힘의 생성을 측정하는 방법을 보여줍니다. 힘의 측정은 소금 용액으로 채워진 챔버로 마취 유충을 배치하여 수행됩니다. 유충의 앞쪽 끝은 힘 센서에 연결되어 유충의 뒤쪽 끝은 길이 컨트롤러에 연결됩니다. 사시 트 위치 수축 전기장 자극으로 이끌어되고 강제 응답은 분석을 위해 기록됩니다. 수축시 힘 생성은 전반적인 근육 건강의 측정을 제공하며, 특히 근육 기능의 측정을 제공합니다. 우리는 야생 형 유충과 사용 방법을 설명하지만,이 방법은 유전자 변형 유충이나 약물이나 독성 물질로 치료 애벌레와 함께 사용할 수 있습니다근육 질병 모델의 특성 및 치료를 평가하거나, 근육 발달, 부상 또는 화학 물질의 독성을 연구한다.

건강한 야생 유형 zebrafish의 유충에서 근육 섬유 하나 사이에 큰 격차없이 서로 평행해야하며 분명 강선을 (그림 5A)이 있어야합니다. 이러한 기능을 전시, 또는 분리 된 섬유 (그림 5b)와 같은 명백한 손상하지 않는 야생형 zebrafish의 유충은 폐기되어야한다. 피크 트 힘 대 한 zebrafish의 유충 현재 자극의 대표 플롯은 그림 6에 나와 있습니다. 3-7 DPF 사이의 야생 유형 zebrafish의 애벌레의 경우, 최적의 자극 전류는 3 DPF의 애벌레는 일반적으로 6-7 DPF의 애벌레보다 현재 더 큰 자극을 필요로, 400~600mA 사이에 일반적입니다. 원시 힘 데이터 (단계 5.8에서 수집) 처리 및 데이터 분석 소프트웨어로 분석 할 수있다. 첫째, 힘 레코드의 기본은 0으로 설정됩니다. 둘째, 힘 센서의 전압 출력 (M 강제로 변환N) (힘 센서에 대한 보정 곡선을 생성하기 위해 제조업체의 지침을 참조하십시오). 하나의 애벌레의 최대 트 수축 동안 수집 된 대표적인 강제 응답은 그림 7에 나와 있습니다. 데이터 분석 소프트웨어는 최대 힘과 힘의 응답의 다른 기능을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 최대 트의 수축에서 최대 힘 데이터의 대표적인 세트는 그림 8A에 표시됩니다. 전형적인 피크 트 포스 오래된 유충이 어린 유충보다 더 많은 힘을 생성과 0.9에서 1.7 mN의에 야생 형 3-7 DPF의 애벌레 범위의 값. 피크 트의 힘의 차이는 성장과 발전 등 정상적인 프로세스 (그림 8) 또는 유전자의 돌연변이와 관련된 병리 21,22과 같은 비정상적인 프로세스로 인해 수 있습니다. 근육 단면적 (CSA)에 의해 정규화 피크 트의 힘의 차이가 differe에로 인해 단순히 정도를 확인하는 데 사용할 수 있습니다<html> 근육 21,22의 크기 NCES. 근육 CSA는 공식을 이용하여 추정 할 수있다 : CSA는 (B / 2) (A / 2) = π, A는 측면에서 볼 때 근육의 높이이고, B는, 아래에서 볼 때 근육의 폭 및 단면 타원형으로 간주됩니다. 0.027 3-4 DPF의 애벌레는 일반적으로 5-7 DPF의 애벌레보다 작은 CSA 값을 보여주는 0.034 mm 2, 야생형 3-7 DPF의 애벌레 범위에 대한 일반적인 CSA 값을 입력합니다. 최대 트 수축의 정규화 된 최대 힘 데이터의 대표적인 세트는 그림 8b에 표시됩니다. 4-7 DPF 유충은 일반적으로 3 DPF의 애벌레보다 큰 값을 보여주는 34 51 mN의 / mm 2 야생형 3-7 DPF의 애벌레 범위에 대한 일반적인 표준화 피크 트 힘 값을 입력합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig1.jpg" /> 그림 1. 봉합 루프 꼬리에 봉합 루프. 화살표가 가리 킵니다. ve_content &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2.jpg" /> 그림 2. 레이블 구성 요소 (A) 시험 장치. 실험 챔버 (B) 근접 전망. 투명한 바닥 () 실험 챔버. (B) 힘 센서. (C) 길이 컨트롤러. (D) XYZ 위치 장치. X, Y 및 Z 축이 오른쪽 상단 모서리에 정의되어 있습니다. 열전 모듈을 활용 (E) 온도 제어 시스템. 튜브 열전 모듈의 냉각을 위해 물 흐름을 수용 할 수 있습니다. (F) 스테인리스 관 변환기를 강제로 연결합니다. (G) 스테인레스 스틸 튜브의 길이가 컨트롤러에 연결합니다. (H) 온도계 microprobe. (I) 플래티넘 평행 판 전극의 길이에 걸쳐실. 백금 플레이트는 높은 2.5 ㎜, 두께 0.255 mm이다. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3.jpg" /> 그림 3. 실험 챔버에 유충을 묶는. (A) 유충은 앞쪽 끝 부분에 묶여 있지만, 아직 90 ° 선회 한 없습니다. (B) 유충 스위블 90 아직 선회 한하지 후방 끝 부분에 묶여 °. (C) 유충 후. (D) 유충은 후 스위블 및 봉합 루프 꼬리가 잘립니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4.jpg" /> 그림 4. 단면적 추정을위한 측정. 근육은 (A) 측면에서 볼 및 (B) </stronG&gt; 바닥. 빨간색 막대의 위치가 비뇨 생식기 개구부의 위치를​​ 나타냅니다. 빨간색 막대의 길이는 각각 측면과 하단에서 볼 때 근육의 높이와 너비를 나타냅니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5.jpg" /> 그림 5. zebrafish의 애벌레 몸통 근육의 측면보기. 분명 손상 (A) 건강한 조직. (B) 조직. 섬유 박리로 인한 경축는 별표로 표시됩니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig6.jpg" /> 그림 6. 피크 트 힘 비해 자극의 대표 플롯 현재. 최적의 자극 전류는 500mA이다. 그림 7. 단일 트 수축 대표 힘의 기록.이 수축은 0 밀리 초에 자극 펄스로 이끌어되었다. 최대 힘은 1.56 mN의 것입니다. <img alt="그림 8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8.jpg" /> 그림 8. 3-7 DPF의 애벌레.에서 대표적인 힘 데이터 (A) 최대 트의 수축에서 피크 힘이 데이터는. (B) 최대 트의 수축에서 피크 포스 데이터는 CSA에 정상화. 이전 유충 (6-7 DPF)는 5 DPF에서 시작 스피루리나와 공급 Hatchfry Encapsulon 0 등급 (은빛 연구소)이었다. 수단 + 표준 편차는 각 그룹 N = 5로보고됩니다. 3 DPF의 애벌레 (*) 4 DPF의 애벌레 (#)에서 유의 한 차이 그룹 (ANOVA, P &lt;0.05 표시됩니다). 4 6-7 DPF (A) 사이의 힘의 증가가 더 정보에 기초 성장에 기인 반면 3, 4 DPF (B) 사이의 정규화 된 힘의 상당한 증가는이 기간 동안 고유의 힘 생성 능력의 증가를 나타냅니다 정규화 된 힘의 4 ~ 7 DPF에서 변경할 수 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

힘의 측정은 개발, 부상, 질병, 치료 또는 화학 물질의 독성에 의한 근육 기능의 변화를 보여주기 위해 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 애벌레 몸통 근육의 최대 수축시 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish의 유충의 근육 기능을 평가하기 위해 수축하는 동안 힘 측정

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

force-measurement-during-contraction-to-assess-muscle-function

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K 조회수.  University of Michigan. 힘의 측정은 개발, 부상, 질병, 치료 또는 화학 물질의 독성에 의한 근육 기능의 변화를 보여주기 위해 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 애벌레 몸통 근육의 최대 수축시 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

비디오: Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

연구

생물학

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

zebrafish의 시각 기능을 연구하기 위해 optokinetic 응답을 사용하여

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Zebrafish 애벌레의 Microgavage

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해<em&gt; C. 엘레</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

약리학 연구에 고립 된 조직 목욕-애플리케이션에서 부드러운 근육 기능의 측정

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

인 - 더 - 필드 응용 프로그램에 대한 설계 및 앱 타머 - 금 나노 입자 기반 비색 분석법 개발

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...